Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Hoàng THÁI NGUYÊN – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam, người thầy_người anh tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Trong trình nghiên cứu vừa qua, em nhận giúp đỡ bảo tận tình cán Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt Th.S Nguyễn Quỳnh Mai, CN Nguyễn Thu Hiền giúp đỡ em trình tiến hành thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo tham gia giảng dạy Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa đào tạo sau đại học truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt năm qua Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH toàn thể cán giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu Trường Viện Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ người thân gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn người bạn chia sẻ khó khăn thử thách sống công việc để em có kết Một lần em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011 Nguyễn Thị Minh Chuyên ngành Di truyền học Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Keratin .3 1.2 Keratinase .6 1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả sinh keratinase cao 1.4 Tình hình nghiên cứu 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước .12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.5 Sản xuất ứng dụng trình thuỷ phân keratin lông vũ 14 1.5.1 Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng thức ăn gia súc 17 1.5.2 Tạo phân bón 17 1.5.3 Tạo enzyme ngành công nghiệp 18 1.5.4 Cải tạo đất 18 1.5.6 Tạo hợp chất màu 19 1.5.7 Ứng dụng công nghiệp dược sản xuất thực phẩm chức 19 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Nguyên liệu 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hoá chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 Chuyên ngành Di truyền học i Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20 2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone 20 2.1.4.2 Môi trường I 20 2.1.4.3 Môi trường II 21 2.1.4.4 Môi trường III 21 2.1.4.5 Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium 21 2.1.4.6 Môi trường nuôi lắc lông vũ 21 2.1.4.7 Môi trường MPA 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh keratinase cao 22 2.2.1.1 Lấy mẫu đo pH đất 22 2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium 22 2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23 2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 23 2.2.2 Xác định khả thuỷ phân lông vũ 23 2.2.2.1 Nuôi giống cấp vào môi trường MPA 23 2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25 2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn có khả sinh keratinase cao 25 2.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên khả sinh trưởng vi khuẩn thủy phân lông vũ 26 2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 26 2.2.6 Xác định gram âm gram dương vi khuẩn 26 2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến 26 2.2.6.2 Xác định cách kiểm tra độ kết dính 27 2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá 28 2.2.8 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu pET32a 30 2.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn 30 2.2.8.2 Nhân đoạn DNA PCR 32 Chuyên ngành Di truyền học ii Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh 2.2.9 Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết lấy mẫu địa điểm 41 3.2 Giá trị pH mẫu đất 41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin 42 3.4 Lựa chọn môi trường thích hợp chủng chọn lọc 44 3.5 Tối ưu nhiệt độ chủng vi khuẩn chọn lọc 47 3.6 Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48 3.7 Kết xác định gram chủng vi khuẩn 49 3.8 Phân loại chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50 3.8.1 Phân loại theo kit API 50CHB chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 50 3.8.2 Phân loại theo kit API 20NE chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51 3.9 Phân loại theo kiểu gene 52 3.9.1 Tách DNA tổng số 52 3.9.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN kỹ thuật PCR 53 3.10 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu pET32a 55 3.10.1 Nhân đoạn gene keratinase kỹ thuật PCR 55 3.10.2 Gắn sản phẩm PCR gel tinh vào vector tách dòng pET32a 56 3.10.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58 3.10.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59 3.11 Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô chủng chọn lọc 60 3.11.1 Định lượng Protein phương pháp Bradford 60 3.11.2 Thử hoạt tính enzyme azokeratin 62 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Chuyên ngành Di truyền học iii Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh BẢNG CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr Dung dịch Ethidium Bromide BSA Bovine serum albumin DNA Deoxyribonucleic axid rARN Ribosomal ribonucleic acid LB Luria-Bertani Ker Keratinase bp Base pair(cặp ba zơ) E.coli Escherichia coli µl Microlit EtOH Ethanol Primer-F Mồi xuôi Primer-R Mồi ngược Chuyên ngành Di truyền học iv Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Sự đa dạng vi sinh vật có khả sinh keratinase đặc tính hóa sinh keratinase 1.2 Ứng dụng enzyme 16 2.1 49 phép thử lên men API 50 CHB 28 2.2 50 phép thử sinh hóa API 20 CHB 31 3.1 Địa điểm lấy mẫu 41 3.2 Giá trị pH mẫu đất 41 3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào khả thủy phân gam lông vũ 47 nhiệt độ khác nhau(Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.5 Kết xác định gram âm, gram dương 50 3.6 Kết phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB 50 chủng Đ.G.T.2.2 3.7 Kết phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB 52 chủng L.SC.1.2 3.8 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) BSA 61 3.9 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) hàm lượng 62 protein dịch vi khuẩn 3.10 Kết xác định hoạt tính enzyme keratinase Chuyên ngành Di truyền học v 63 Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1.1 Một số hình dạng lông vũ 1.2 Cấu tạo phân tử keratin 1.3 Ảnh kính hiển vi sợi bên tế bào keratin 1.4 Cấu tạo phân tử enzyme keratinase 3.1 Khả thủy phân lông vũ chủng chọn lọc 44 (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.2 Khả sinh trưởng thủy phân lông vũ 46 chủng vi khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.3 Khả thủy phân lông vũ chủng vi 46 khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.4 Khả thủy phân lông vũ chủng vi 48 khuẩn khung nhiệt độ khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.5 Hình ảnh tế bào vi khuẩn với độ phóng đại 4800 49 lần 3.6 Ảnh điện di DNA tổng số 53 3.7 Sản phẩm PCR mồi 16S 54 3.8 Cây phát sinh chủng loại chủng Đ.GT.2.2 55 L.SC.1.2 3.9 Sản phẩm PCR mồi ker F ker R 56 3.10 Sản phẩm gel tinh gene ker 56 Chuyên ngành Di truyền học vi Lớp Sinh K17 Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.11 HVCH: Nguyễn Thị Minh Sản phẩm tinh gene ker vector 57 pET32asau xử lý enzyme cắt 3.12 Vector tái tổ hợp pET32a /ker 58 3.13 Sản phẩm biến nạp chủng vi khuẩn vào tế 58 bào khả biến E.coli DH10B 3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ 59 hợp chủng sau biến nạp 3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp 60 enzyme cắt XhoI BamHI 3.16 Đường chuẩn Bradford Chuyên ngành Di truyền học vii 61 Lớp Sinh K17 data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... PHẠM NGUYỄN THỊ MINH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA... đất 41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin 42 3.4 Lựa chọn môi trường thích hợp chủng chọn lọc 44 3.5 Tối ưu nhiệt độ chủng vi khuẩn chọn lọc 47 3.6... sinh trưởng thủy phân lông vũ 46 chủng vi khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.3 Khả thủy phân lông vũ chủng vi 46 khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.4 Khả thủy phân lông