LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong TBVK e coli

Luận văn Thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hồng – Phó trưởng Phịng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam, người thầy_người anh tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong trình nghiên cứu vừa qua, em nhận giúp đỡ bảo tận tình cán Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt Th.S Nguyễn Quỳnh Mai, CN Nguyễn Thu Hiền giúp đỡ em q trình tiến hành thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo tham gia giảng dạy Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa đào tạo sau đại học truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt năm qua Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới BGH toàn thể cán giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc Phịng thí nghiệm trọng điểm CNG tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu Trường Viện Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ người thân gia đình lịng biết ơn sâu sắc, cảm ơn người bạn chia sẻ khó khăn thử thách sống cơng việc để em có kết Một lần em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 09 năm MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Keratin 1.2 Keratinase 1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả sinh keratinase cao .8 1.4 Tình hình nghiên cứu 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.5 Sản xuất ứng dụng trình thuỷ phân keratin lông vũ 14 1.5.1 Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng thức ăn gia súc 17 1.5.2 Tạo phân bón 17 1.5.3 Tạo enzyme ngành công nghiệp 18 1.5.4 Cải tạo đất 18 1.5.6 Tạo hợp chất màu 19 1.5.7 Ứng dụng công nghiệp dược sản xuất thực phẩm chức 19 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Nguyên liệu .20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hoá chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 i 2.1.4 Môi trường nuôi cấy .20 2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone 20 2.1.4.2 Môi trường I 20 2.1.4.3 Môi trường II 21 2.1.4.4 Môi trường III 21 2.1.4.5 Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium 21 2.1.4.6 Môi trường nuôi lắc lông vũ .21 2.1.4.7 Môi trường MPA .21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh keratinase cao .22 2.2.1.1 Lấy mẫu đo pH đất 22 2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium .22 2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23 2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus .23 2.2.2 Xác định khả thuỷ phân lông vũ 23 2.2.2.1 Nuôi giống cấp vào môi trường MPA 23 2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25 2.2.3 Lựa chọn mơi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn có khả sinh keratinase cao 25 2.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên khả sinh trưởng vi khuẩn thủy phân lông vũ 26 2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 26 2.2.6 Xác định gram âm gram dương vi khuẩn 26 2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến 26 2.2.6.2 Xác định cách kiểm tra độ kết dính 27 2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hố 28 2.2.8 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu pET32a 30 2.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn 30 2.2.8.2 Nhân đoạn DNA PCR .32 ii 2.2.9 Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết lấy mẫu địa điểm 41 3.2 Giá trị pH mẫu đất 41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin .42 3.4 Lựa chọn mơi trường thích hợp chủng chọn lọc 44 3.5 Tối ưu nhiệt độ chủng vi khuẩn chọn lọc .47 3.6 Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48 3.7 Kết xác định gram chủng vi khuẩn 49 3.8 Phân loại chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50 3.8.1 Phân loại theo kit API 50CHB chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 .50 3.8.2 Phân loại theo kit API 20NE chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51 3.9 Phân loại theo kiểu gene 52 3.9.1 Tách DNA tổng số .52 3.9.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN kỹ thuật PCR 53 3.10 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu pET32a 55 3.10.1 Nhân đoạn gene keratinase kỹ thuật PCR 55 3.10.2 Gắn sản phẩm PCR thơi gel tinh vào vector tách dịng pET32a 56 3.10.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58 3.10.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59 3.11 Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thơ chủng chọn lọc 60 3.11.1 Định lượng Protein phương pháp Bradford 60 3.11.2 Thử hoạt tính enzyme azokeratin 62 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr Dung dịch Ethidium Bromide BSA Bovine serum albumin DNA Deoxyribonucleic axid rARN Ribosomal ribonucleic acid LB Luria-Bertani Ker Keratinase bp Base pair(cặp ba zơ) E.coli Escherichia coli µl Microlit EtOH Ethanol Primer-F Mồi xuôi Primer-R Mồi ngược DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Sự đa dạng vi sinh vật có khả sinh keratinase đặc tính hóa sinh keratinase 1.2 Ứng dụng enzyme 16 2.1 49 phép thử lên men API 50 CHB 28 2.2 50 phép thử sinh hóa API 20 CHB 31 3.1 Địa điểm lấy mẫu 41 3.2 Giá trị pH mẫu đất 41 3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào khả thủy phân gam lông vũ 47 nhiệt độ khác nhau(Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.5 Kết xác định gram âm, gram dương 50 3.6 Kết phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB 50 chủng Đ.G.T.2.2 3.7 Kết phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB 52 chủng L.SC.1.2 3.8 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) BSA 61 3.9 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) hàm lượng 62 protein dịch vi khuẩn 3.10 Kết xác định hoạt tính enzyme keratinase 63 Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1.1 Một số hình dạng lơng vũ 1.2 Cấu tạo phân tử keratin 1.3 Ảnh kính hiển vi sợi bên tế bào keratin 1.4 Cấu tạo phân tử enzyme keratinase 3.1 Khả thủy phân lông vũ chủng chọn lọc 44 (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.2 Khả sinh trưởng thủy phân lông vũ 46 chủng vi khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.3 Khả thủy phân lông vũ chủng vi 46 khuẩn môi trường khác (Sau ngày nuôi cấy lắc) 3.4 Khả thủy phân lông vũ chủng vi 48 khuẩn khung nhiệt độ khác (Sau ngày ni cấy lắc) 3.5 Hình ảnh tế bào vi khuẩn với độ phóng đại 4800 49 lần 3.6 Ảnh điện di DNA tổng số 53 3.7 Sản phẩm PCR mồi 16S 54 3.8 Cây phát sinh chủng loại chủng Đ.GT.2.2 55 L.SC.1.2 3.9 Sản phẩm PCR mồi ker F ker R 56 3.10 Sản phẩm gel tinh gene ker 56 vi Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.11 Sản phẩm tinh gene ker vector 57 pET32asau xử lý enzyme cắt 3.12 Vector tái tổ hợp pET32a /ker 58 3.13 Sản phẩm biến nạp chủng vi khuẩn vào tế 58 bào khả biến E.coli DH10B 3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ 59 hợp chủng sau biến nạp 3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp 60 enzyme cắt XhoI BamHI 3.16 Đường chuẩn Bradford vii 61 MỞ ĐẦU Lơng vũ có lượng protein keratin thô cao (90 - 95%), phần lớn protein lơng vũ khơng hịa tan nước Mặc dù khó bị phân hủy, chất thải keratin bị phân hủy chủng vi khuẩn, xạ khuẩn nấm có khả sinh tổng hợp keratinase Vi sinh vật sinh tổng hợp keratinase phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ đất Nam cực đến suối nước nóng, kể điều kiện mơi trường hiếu khí kỵ khí Ðến nay, keratinase nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas,… Vì vậy, việc khai thác đa dạng vi sinh vật cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với ứng dụng cụ thể Keratinase phá vỡ cầu nối disunfua keratin làm đứt liên kết vòng xoắn Sau thủy phân hợp chất keratin lông vũ phân huỷ chia nhỏ thành axit amin peptit ngắn Như vậy, gia súc, gia cầm sử dụng lông vũ sau bị thủy phân làm thức ăn Chính vậy, keratinase nghiên cứu ứng dụng trình thủy phân lơng vũ để tạo thành hợp chất bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm làm phân bón hữu cơ,… Ở Việt Nam ngành công nghiệp tái tạo nguồn phế thải làm phân bón thức ăn cho gia súc cịn non trẻ giai đoạn tìm nguồn nguyên liệu định hướng để phát triển Phương pháp ứng dụng phổ biến để xử lý phế thải lông vũ sử dụng kiềm acid Tuy nhiên, phương pháp nhiều hạn chế (giá thành cao, hiệu suất thấp…), việc ứng dụng enzyme từ vi khuẩn để xử lý phế thải có nhiều ưu điểm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá thành thấp, mặt khác thân thiện với mơi trường Vì vậy, việc nghiên cứu enzyme từ vi khuẩn để thủy phân lông vũ vừa có ý nghĩa khoa học, vừa có ý nghĩa thực tiễn Với ưu điểm trên, để phục vụ cho việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đất lơng vũ có khả phân huỷ lông vũ, tiến hành nghiên cứu đề tài: Tên đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm thiết kế vector tái tổ hợp biểu keratinase tế bào vi khuẩn E.Coli ”  Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn chủng vi sinh vật đất thuộc nhóm vi sinh vật Bacillus, Chryseobacterium Vibrio có hoạt tính thủy phân với hiệu suất 70 – 80% lượng keratin lông vũ môi trường nuôi cấy - Thiết kế vector tái tổ hợp biểu keratinase E.Coli  Ý nghĩa đề tài: Ứng dụng xử lý lơng vũ sản xuất phân bón Thay tăng hàm lượng protein thức ăn gia súc gia cầm Ngoài ra, việc nghiên cứu đề tài mang lại nhiều ý nghĩa thiết thực đời sống như: Cải tạo đất trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường tạo nguồn keratinnase vô phong phú  Nội dung: - Thu thập mẫu đất chăn nuôi gia cầm nơi giết mổ gia cầm - Tuyển chọn chủng Bacillus, Pseudomonas, Chryseobacterium môi trường ni cấy - Nhận dạng hình thái đặc điểm hóa sinh chủng thu có khả phân giải mạnh keratin - Thiết kế nhân đoạn gen keratinase từ chủng có hoạt tính mạnh - Chọn dòng keratinase vector biểu pET32a để biểu tế bào vi khuẩn E coli - Phân tích hoạt tính enzyme keratinase (enzyme ngoại bào) [66] xác định hoạt tính keratinase 980.9 U/mg kết lại cao Vậy khả sinh keratinase phụ thuộc vào chủng vi khuẩn khác Hai chủng L.NĐ.3.4 Đ.NĐ.1.2 phân lập có hoạt tính keratinase cao Với kết tiến hành nghiên cứu đưa vào ứng dụng thực tiễn Bảng 3.10 Kết xác định hoạt tính keratinase Tên chủng Thể tích Hàm lƣợng Hoạt tính Hoạt tính dịch ni (ml) protein(mg) keretinase (U) keretinase (U/mg) L.NĐ.3.4 200 44 8066,5 183,33 Đ.NĐ.1.2 200 47.6 8466,6 177,87 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Phân lập tuyển chọn 20 chủng vi khuẩn, chọn lọc chủng vi khuẩn có khả sinh keratinase cao.( Đ.GT.2.2; L.SC.1.2; L.GT.2.1 Đ.SC.1.1) - Điều kiện nhiệt độ cho chủng vi khuẩn phát triển nhiệt độ từ 35 40 C môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn mơi trường dinh dưỡng bình thường - MT2, có khả thủy phân lông vũ đạt từ 75,45% đến 81,55%, sau ngày nuôi cấy lắc - Hai chủng Đ.GT.2.2 L.SC.1.2 phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, kết hợp với phản ứng sinh hóa (kit chuẩn API 50CHB 20NE) phân tích trình tự gene mã hóa 16S rARN Chủng Đ.GT.2.2 có độ tương đồng 98% so với nhiều loài thuộc chi Bacillus chủng L.SC.1.2 có độ tương đồng 95% so với chi Pseudomonas - Dịch chiết protein thô keratinase chủng L.NĐ.3.4 có hoạt tính 183.33 U/mg Đ.NĐ.1.2 có hoạt tính 177.87 U/mg, sử dụng chất azokeratin - Ngồi ra, chúng tơi nhân đoạn gene keratinase (Ker) thiết kế vector tái tổ hợp pET32a mang gene Ker để biểu Escherichia coli 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu trình tinh keratinase dạng thô tinh để ứng dụng chăn nuôi - Biểu keratinase tái tổ hợp Escherichia coli TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Đình Kim 2001 Giáo trình vi sinh vật đất Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2002 Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục Nguyễn Lân Dũng 1984 Vi sinh vật đất chuyển hoá hợp chất cacbon, nitơ Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Sức 2000 Vai trị vi sinh vật đất hệ thống nơng nghiệp bền vững Tài nguyên vi sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất Nhà xuất nông nghiệp GS Lê Văn Liễn 2001 Kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm phụ giết mổ hải sản làm thức ăn chăn nuôi Viện chăn nuôi Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đồn, Võ Nhân Hậu, Ngơ Xn Dũng 2008 Chọn lựa điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis; 5:460-466 Khoa Công nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Huy Hoàng 2010 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả thủy phân lơng vũ; 8(3A):923-928 Tạp chí Cơng nghệ sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai 2010 Phân loại đánh giá khả thủy phân lông vũ chủng vi khuẩn Bacillus.sp Phân lập từ đất nơi giết mổ gia cầm; 8(4):1869-1875 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện KH & CN Việt Nam Tiếng nƣớc Andersson M., Laukkanen M., Nurmiaho-Lassila E.L., Rainey F.A., Niemela S L., Niemelü S L., Sankinoja-Sanolen M.S 1995 Bacillus thermosphaericus, sp Nov, a new thermosphilic ureolytic Bacillus isolated from air Syst Appl microbio; 18: 203-220 10 De Boer S A., Priest F G., Diedrichsen B 1994 On the industrial use of Bacillus licheniformis: a review Appl Microbiol Biotechnol; 40:595-598 11 Galvez A., Valdivia E., Gonzalez-Segura A., Lebbadi M., Martinez-Bueno M., Maqueda M 1993 Purification, characterization and lytic activity against Naegleria fowleri of two amoebocins produced by Bacillus licheniformis A12 Appl Environ Microbiol; 59:1480–1486 12 Palleroni N J 1984., Genus Bacillus In Krieg., N.R., & Holt, J.G (eds): , Bergey s Manual of Systematic Bacteriology The Williams and Wilkin Co., Baltimore 13 Zerdani I., Faid M., Malki A 2004 Feather wastes digestion by new isolated satrain Bacillus sp in Morocco Afr Biotechnol; 3:67-70 14 Molyneux G.S 1959 The digestion of wool by a keratinolytic Bacillus Aus J.Biol Sci; 12:274-281 15 Schmidt W.F 1998 Innovative feather utilization strategies National Poultry Waste Management Symposium, Springdale, Arkansas Auburn, AL: Auburn University Printing Services; 276-282 16 Schmidt W.F., Line M.J 1996 Physical and chemical structures of poultry feather fiber fractions in fiber process development In: Proceedings of the TAPPI Nonwovens Conference, 11–13 March 1996, Charlotte, North Carolina Atlanta, GA: Technical Association of the Pulp and Paper Industry; 135-140 17 Shih J.C.H 1993 Recent developments in poultry waste digestion and feather utilization—areview Poultry Science 72:1617-1620 18 Brandelli A 2005 Production of an extracellular keratinase from Chryseobacterium sp growing on raw feathers J Biotechnol; 35-37 19 Palleroni N J 1984 Genus bacillus In Krieg, N.R., & Holt, J.G (eds): , Bergey s Manual of Systematic Bacteriology The Williams and Wilkin Co., Baltimore 20 Araragi T., Andersson M A., Mikkola R 1979 Density of microorganisms in soil Appl microbiol biotechnol; 57-61 21 Williams C.M., Richtcr C.S., Mackenzie J.R and Shih J.C.I 1990 Isolation, identification and characterization of a feather-degrading bacterium J Appl Environ Microbiol; 56:1509-1515 22 Lin X., Lee C.G., Casale SE and Shih J.C 1992 Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis strain J Appl Environ Ailcrobiol; 58:3271-3275 23 Xiang Lin., Chung-Ginn Lee., Ellen S., Jason C H 1992 Purification and Characterization of a Keratinase from a Feather-Degrading Bacillus licheniformis strain J Appl Environ Ailcrobiol; 58(10):3271–3275 24 Gupta R., Ramnani P 2006 Microbial keratinases and their prospective applications: an overview Appl microbiol biotechnol; 70:21-33 25 Egrow N.X 1983 Microbiology practice Mir Publishers, Moxcova 26 Zhang B., Sun Z., Jiang D., Niu T G 2009 Isolation and purification of alkaline keratinase from, African Journal of Biotechnology Vol 8; 11:25982603 27 Tamilmani P., Umamaheswari A., Vinayagam A B 2008 Production of an Extra Cellular Feather Degrading Enzyme by Bacillus licheniformis Isolated from Poultry Farm Soilin Namakkal District (Tamilnadu), Prakash International Journal of Poultry Science 7; 2:184-188 28 Lin X., Lee C.G., Casale E.S., Shih J.C.H 1992 Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain, Appl Environ Microbiol., 58: 3271-3275 29 Radha S., Gunasekaran P 2007 Cloning and expression of keratinase gene in Bacillusmegaterium and optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain, Journal application microbiol; 103:1301–1310 30 Godde C., Sahm K., Brouns S.J.J., Kluskens L.D., van der Oost J., de Vos W.M., Antranikian G 2005.Cloning and expression of islandisin,a new thermostable subtilis in from Fervidobacteriumislandicum, in Escherichiacoli, Appl Environ.Microbiol; 71:3951–3958 31 Joo H S.; Kumar C.G.; Park G.C.; Kim K.T, Paik S.R and Chang C.S October 2002 Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus hirikoshii Process Biochemistry, vol 38; 2:155-159 32 Sambrook, Fritsch E.F., Maniatis T 2001 ’’Moleculer Cloning: Alaboratory manual’’ Cold spring Harbor Lab Press, Cold spring Harbor 33 W Akhtar., H.G Edwards 1997 Fourier-transform Raman spectroscopy of mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc; 53A:81-90 34 L Kreplak., J Doucet., P Dumas., F Briki 2004 New aspects of the alpha-helix to beta-sheet transition in stretched hard alpha-keratin fibers Biophys J; 87:640-647 35 I Zerdani., M Faid., A Malki 2004 Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp in Morocco Afr J Biotechnol; 3: 67-70 36 M.C Papadopoulos 1986 The effect of enzymatic treatment on amino acid content and nitrogen characteristics of feather meal Anim Feed Sci Technol; 16:151-156 37 J.J Noval., W.J Nickerson 1995 Decomposition of native keratin by Streptomyces fradiae J Bacteriol; 77:251-263 38 B Bockle., R Muller 1997 Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol; 63:790792 39 P Ramnani., R Gupta 2004 Optimization of medium composition for keratinase production on feather by Bacillus licheniformis RG1 using statistical methods involving response surface methodology Biotechnol Appl Biochem; 40:191-196 40 A Ghosh., K Chakrabarti., D Chattopadhyay 2008 Degradation of raw feather by a novel high molecular weight extracellular protease from newly isolated Bacillus cereus DCUW J Ind Microbiol Biotechnol; 35:825-834 Epub 2008 Apr 2022 41 M Rozs., L Manczinger., C Vagvolgyi., F Kevei 2001 Secretion of a trypsin-like thiol protease by a new keratinolytic strain of Bacillus licheniformis FEMS Microbiol Lett; 205:221-224 42 X Lin., C.G Lee., E.S Casale., J.C Shih 1992 Purification and Characterization of a Keratinase from a Feather-Degrading Bacillus licheniformis Strain Appl Environ Microbiol; 58:3271-3275 43 A.G Kumar., S Swarnalatha., S Gayathri., N Nagesh., G Sekaran 2008 Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine keratinase by the newly isolated Bacillus pumilus J Appl Microbiol;104:411-419 44 H.J Suh., H.K Lee 2001 Characterization of a keratinolytic serine protease from Bacillus subtilis KS-1 J Protein Chem; 20:165-169 45 R Kumar., S Balaji., T.S Uma., A.B Mandal., P.K Sehgal 2008 Optimization of influential parameters for extracellular keratinase production by Bacillus subtilis (MTCC9102) in solid state fermentation using Horn meal a biowaste management Appl Biochem Biotechnol; 160:30-39 46 R Konwarh., N Karak., S.K Rai., A.K Mukherjee 2009 Polymer-assisted iron oxide magnetic nanoparticle immobilized keratinase Nanotechnology; 20: 225-107 Epub 222009 May 225112 47 E Ionata., F Canganella., G Bianconi., Y Benno., M Sakamoto., A Capasso., M Rossi., F La Cara 2008 A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv pennavorans bv nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds Microbiol Res1; 63:105-112 Epub 2006 Nov 2007 48 S.L Wang., W.T Hsu., T.W Liang., Y.H Yen., C.L Wang 2008 Purification and characterization of three novel keratinolytic metalloproteases produced by Chryseobacterium indologenes TKU014 in a shrimp shell powder medium Bioresour Technol; 99:5679-5686 Epub 2007 Nov 5626 49 G.W Nam., D.W Lee., H.S Lee., N.J Lee., B.C Kim., E.A Choe., J.K Hwang., M.T Suhartono., Y.R Pyun 2002 Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe Arch Microbiol; 178:538-547 50 A.B Friedrich., G Antranikian 1996 Keratin Degradation by Fervidobacterium pennavorans, a Novel Thermophilic Anaerobic Species of the Order Thermotogales Appl Environ Microbiol; 62:2875-2882 51 C Bernal., I Diaz., N Coello 2006 Response surface methodology for the optimization of keratinase production in culture medium containing feathers produced by Kocuria rosea Can J Microbiol; 52:445-450 52 R.C Thys., A Brandelli 2006 Purification and properties of a keratinolytic metalloprotease from Microbacterium sp J Appl Microbiol; 101:1259-1268 53 A Gessesse., R Hatti-Kaul., B.A Gashe., B Mattiasson 2003 Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather Enzyme and Microbial Technology; 32:519-524 54 S Mitsuiki., M Sakai., Y Moriyama., M Goto., K Furukawa 2002 Purification and some properties of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis sp TOA-1 Biosci Biotechnol Biochem; 66:164-167 55 Z.J Cao., Q Zhang., D.K Wei., L Chen., J Wang., X.Q Zhang., M.H Zhou 2009 Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme J Ind Microbiol Biotechnol; 36:181-188 56 R Tatineni., K.K Doddapaneni., R.C Potumarthi., R.N Vellanki., M.T Kandathil., N Kolli., L.N Mangamoori 2008 Purification and characterization of an alkaline keratinase from Streptomyces sp Bioresour Technol; 99:1596-1602 57 F Xie., Y Chao., X Yang., J Yang., Z Xue., Y Luo., S Qian 2009 Purification and characterization of four keratinases produced by Streptomyces sp strain 16 in native human foot skin medium Bioresour Technol; 101: 344-350 58 P Bressollier., F Letourneau., M Urdaci., B Verneuil 1999 Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus Appl Environ Microbiol; 65: 2570-2576 59 B Bockle., B Galunsky., R Muller 1995 Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530 Appl Environ Microbiol; 61:3705-3710 60 D.G Syed., J.C Lee., W.J Li., C.J Kim., D Agasar 2009 Production, characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis Bioresour Technol; 100:1868-1871 61 R.R Chitte., S Dey 2001 Cloning and expression of an actinokinase gene from a thermophilic Streptomyces in Escherechia coli Indian J Exp Biol; 39: 410-415 62 S Riessen., G Antranikian 2001 Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity Extremophiles; 5:399-408 63 S Balaji., M.S Kumar., R Karthikeyan., R Kumar., S Kirubanandan., R Sridhar., P.K Sehgal 2008 Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102) World Journal of Microbiology and Biotechnology; 24:2741-2745 64 C.G Cai., J.S Chen., J.J Qi., Y Yin., X.D Zheng 2008 Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain J Zhejiang Univ Sci B; 9:713-720 65 L Manczinger., M Rozs., C.S Vágvölgyi., F Kevei 2003 Isolation and characterization of a new keratinolytic Bacillus licheniformis strain World J Microbiol Biotechnol; 19:35-39 66 B Zhang., D.D Jiang., W.W Zhou., H.K Hao., T.G Niu 2009 Isolation and characterization of a new Bacillus sp 50-3 with highly alkaline keratinase activity from Calotes versicolor faeces World J Microbiol Biotechnol; 25:583-590 67 J.M Kim., W.J Lim., H.J Suh 2001 Feather-degrading Bacillus species from poultry waste Process Biochem; 37:287-291 68 P.O Werlang., A Brandelli 2005 Characterization of a novel feather- degrading Bacillus sp strain Appl Biochem Biotechnol; 120:71-79 69 A Gushterova., E Vasileva-Tonkova., E Dimova., P Nedkov., T Haertlé 2005 Keratinase production by newly isolated actinomycete strains World J Microbiol Biotechnol; 21: 831-834 Antarctic 70 A.H Mohamedin 1999 Isolation, identification and some cultural conditions of a protease-producing thermophilic Streptomyces strain grown on chicken feather as a substrate Int Biodeterior Biodegrad; 43:13-21 71 L Szabo., A Benedek., M.L Szabo., G Barabas 2000 Feather degradation with a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain World J Microbiol Biotechnol; 16:252-255 72 T Matsui., Y Yamada., H Mitsuya., Y Shigeri., Y Yoshida., Y Saito., H Matsui., K Watanabe 2009 Sustainable and practical degradation of intact chicken feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328 Appl Microbiol Biotechnol; 82:941-950 73 H Takami., Y Nogi., K Horikoshi 1999 Reidentification of the keratinase-producing facultatively alkaliphilic Bacillus sp AH-101 as Bacillus halodurans Extremophiles; 3:293-296 74 S Balaji., M.S Kumar., R Karthikeyan., R Kumar., S Kirubanandan., R Sridhar., P.K Sehgal 2008 Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102) World J Microbiol Biotechnol; 24:2741-2745 75 R Tsuboi., I Ko., K Takamori., H Ogawa 1989 Isolation of a keratinolytic proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic pH Infect Immun; 57:3479-3483 76 R Gupta., P Ramnani 2006 Microbial keratinases and their prospective applications: an overview Appl Microbiol Biotechnol; 70:21-33 77 H Gradisar., J Friedrich., I Krizaj., R Jerala 2005 Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to some known proteases Appl Environ Microbiol; 71:3420-3426 78 P Pillai., G Archana 2008 Hide depilation and feather disintegration studies with keratinolytic serine protease from a novel Bacillus subtilis isolate Appl Microbiol Biotechnol; 78:643-650 79 F Casarin., F Cladera-Olivera., A Brandelli 2008 Use of poultry byproduct for production of keratinolytic enzymes Food Bioprocess Technol; 1:301-305 80 C.G Cai., X.D Zheng 2009 Medium optimization for keratinase production in hair substrate by a new Bacillus subtilis KD-N2 using response surface methodology J Ind Microbiol Biotechnol; 36:875-883 81 A Brandelli., A Riffel 2005 Production of an extracellular keratinase from Chryseobacterium sp growing on raw feathers Electron J Biotechnol; 8:35-42 83 H.J Son., H.C Park., H.S Kim., C.Y Lee 2008 Nutritional regulation of keratinolytic activity in Bacillus pumilis Biotechnol Lett; 30:461-465 84 A.A Khardenavis., A Kapley., H.J Purohit 2009 Processing of poultry feathers by alkaline keratin hydrolyzing enzyme from Serratia sp HPC 1383 Waste Manag; 29:1409-1415 Epub 2008 Dec 1419 85 J.J Wang., K Rojanatavorn., J.C Shih 2004 Increased production of Bacillus keratinase by chromosomal integration of multiple copies of the kerA gene Biotechnol Bioeng; 87:459-464 86 S.K Rai., R Konwarh., A.K Mukherjee 2009 Purification., characterization and biotechnological application of an alkaline β-keratinase produced by Bacillus subtilis RM-01 in solid-state fermentation using chicken-feather as substrate Biochem Eng J; 45:218-225 87 P Prakash., S.K Jayalakshmi., K Sreeramulu 2010 Purification and characterization of extreme alkaline, thermostable keratinase, and keratin disulfide reductase produced by Bacillus halodurans PPKS-2 Appl Microbiol Biotechnol; 11 88 A Brandelli 2008 Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond Food Bioprocess Technol; 1:105-116 ... ? ?Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm thiết kế vector tái tổ hợp biểu keratinase tế bào vi khuẩn E. Coli ”  Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn chủng vi. .. hóa sinh chủng thu có khả phân giải mạnh keratin - Thiết kế nhân đoạn gen keratinase từ chủng có hoạt tính mạnh - Chọn dịng keratinase vector biểu pET32a để biểu tế bào vi khuẩn E coli - Phân. .. gel tinh gene ker 56 vi Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.11 Sản phẩm tinh gene ker vector 57 pET32asau xử lý enzyme cắt 3.12 Vector tái tổ hợp pET32a /ker 58 3.13 Sản phẩm biến nạp chủng vi khuẩn vào