Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn acetobacter có khả năng oxi hóa ethanol cao và thử nghiệm lên men giấm dứa đỗ thị hiền, đặng thị ánh sương, hoàng thị quý, nguyễn thị chiến, tạp chí khoa học đại học thủ dầu một, số 1(36) 2018,tr 33 43

Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER CÓ KHẢ NĂNG OXY HÓA ETHANOL CAO VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN GIẤM DỨA Đỗ Thị Hiền(1), Đặng Thị Ánh Sương(1), Hoàng Thị Quý(1), Nguyễn Thị Chiến(1) (1) Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP HCM Ngày nhận 20/3/2017; Ngày gửi phản biện 30/3/2017; Chấp nhận đăng 30/6/2017 Email: hiendt@cntp.edu.vn Tóm tắt Chủng vi sinh vật nghiên cứu sử dụng nhiều để lên men giấm Acetobacter Dứa loại trái khó bảo quản lâu đặc tính: mềm, dễ dập, mọng nước giàu đường Hiện nay, Việt Nam, sản xuất giấm theo phương pháp truyền thống cho hiệu suất không cao, chất lượng khơng ổn định Vì vậy, việc lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp chịu n ng độ ethanol cao s gi p nâng cao hiệu suất r t ng n thời gian sản xuất giấm Đề tài đ ti n hành phân lập tuyển chọn chủng T có khả chịu n ng độ c n cao Định danh 16 cho thấy T loài Acetobacter senegalensis hảo sát điều kiện lên men giấm dứa Acetobacter senegalensis thu k t quả: Thời gian lên men ngày; pH tối ưu khoảng 5,0 ÷ 5,5; n ng độ ethanol từ - 8%v/v lượng acid acetic tạo khoảng 3,10 ÷ 3,37% Từ khóa: dứa, Acetobacter, giấm, factors affecting Abstract IDENTIFICATION OF ACETOBACTER SP IN HIGH ABILITY OF ETHANOL METABOLISM AND EX VITRO EXPERIMENTAL VINEGAR FERMENTATION FROM PINEAPPLE FRUITS Acetobacter sp has been known as the most popular microorganism strain for vinegar fermentation Pineapple fruit has been defined that the preservation processes is difficult for continuous time due to soft, succulent, sugar-rich profiles Traditional vinegar products currently have showed low efficiencies and unstable qualities Therefore, microorganism inoculum selection haing a high ethanol metabolism would improve time, efficiency and quality of producing vinegar This study aims to identify Acetobacter senegalensis using rDNA 16S from TS2 sample The results indicated vinegar fermentation processes from pineapple using Acetobacter senegalensis optimized in days, pH from 5.0 ÷ 5.5, ethanol concentration from - 8%v/v which can receive 3.1 ÷ 3.37% (v/v) of acetic acid Đặt vấn đề Giấm dung dịch acetic lỗng có nồng độ ≤ 8%, loại gia vị sử dụng từ nguyên liệu có đường bột cách lên men rượu acid acetic (Lê Văn Nhương, 1990) Acetobacter Gluconerbacter hai chủng vi khuẩn lên men acetic phổ biến Chúng có khả oxi hóa mạnh ethanol thành acid acetic điều kiện hiếu khí bắt buộc Đồng thời chủng vi khuẩn có khả chịu nồng độ acid acetic cao nên chúng ứng dụng 33 Đỗ Thị Hiền Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter để lên men sản xuất giấm (Watchara Kanchanarach cộng sự, 2010) Kết nghiên cứu Nanda cộng sự, 2001 phân lập chủng Acetobacter từ giấm gạo komesu kurosu lên men tĩnh 50mL môi trường chứa 1,0% D - glucose, 1,0% glycerol, 0,2% polypeptone, 0,2% chiết xuất nấm men, 10% chiết xuất từ khoai tây, 1,0% acid acetic, 4,0% ethanol 30°C tuần lượng acid acetic sinh 6,0 - 6,5 % với pH = 3,1 Nghiên cứu đặc biệt Ndoye cộng sự, 2007 “Acetobacter senegalensis, loài vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt phân lập từ xoài Senegal” cho thấy chủng A.senegalensis phát triển tốt môi trường chứa 30% D -glucose với amoni nguồn nitơ nhất, ethanol nguồn carbon, chịu nồng độ ethanol 10% tạo 6% acid acetic Dứa loại trái nhiệt đới, hàm lượng đường dứa trung bình từ - 12%, có nơi trồng tốt chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15 - 16% (trong 66% đường dạng saccarose 34% dạng fructose glucose) Dứa cịn có màu sắc, mùi thơm đặc trưng thích hợp để chế biến, làm gia vị cho ăn làm giấm Nội dung nghiên cứu 2.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn acid acetic Nguồn nguyên liệu lựa chọn để phân lập vi khuẩn lên men acetic: dịch giấm gạo, giấm nuôi, nước dừa lên men, thu thập chợ Sơn Kỳ (quận Tân Phú), dịch thủy sâm mua quận 12 (TP Hồ Chí Minh) Tiến hành tăng sinh mẫu phân lập 24 giờ, 300C, lắc 150 rpm/phút Sau pha lỗng mẫu đến nồng độ thích hợp (thường 10-3 đến10-7) tiến hành cấy trải môi trường YPGD: Yeast extract 5g/L, peptone 5g/L, Glycerol 5g/L, D – Glucose 5g/L, Ethanol 4%v/v, 0,5% CaCO3 (Moryadee Wasu, 2008) Nuôi cấy mẫu phân lập nhiệt độ thường (28-320C) Sau khoảng 1-2 ngày, vi khuẩn phát triển bề mặt thạch Tiến hành quan sát, chọn khuẩn lạc có khả tạo vòng halo (vòng phân giải CaCO3) vi khuẩn acetic, tách làm khuẩn lạc Chọn dịng vi khuẩn có tỉ lệ vịng phân giải lớn Cấy trải chủng vi khuẩn vừa phân lập với nồng độ pha loãng: 10-4, 10-5 , 10-6 Ủ nhiệt độ thường (28-320C) 24-48 Tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc, kích thước vi khuẩn Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào Chọn tế bào có hình que, bắt màu đỏ vàng hay đỏ tía với thuốc nhuộm Thử nghiệm tính sinh acid acetic (Davidson et al., 1993): Nuôi chủng phân lập môi trường định tính acid acetic ((Glucose 30g/L, KH2PO4 15g/L, (NH4)2SO4 15g/L, Ethanol 3%v/v) nhiệt độ phòng (28 – 32oC) ngày Cho vào ống nghiệm 3mL dịch mẫu 1mL dung dịch NaOH Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều, đun sôi đèn cồn Nếu dịch lên men có acid acetic có màu đỏ Thử nghiệm khả oxy hóa acetate ( harafi et al., 2010): Nếu chủng phân lập có khả oxy hóa acetate chủng thuộc giống Acetobacter cịn ngược lại chủng thuộc giống Gluconobacter Cấy chủng phân lập môi trường YPGD (giống mơi trường phân lập) có bromocresol green (0,01% g/L) làm chất thị màu Ủ đĩa nhiệt độ thường (28 – 32oC) 24 - 72 khơng có thay đổi màu sắc 2.2 Kiểm tra khả phát triển chủng phân lập mơi trường ni cấy có nồng độ ethanol cao Các chủng vi khuẩn thí nghiệm đuợc cấy môi truờng phân lập YPGD bổ sung nồng độ ethanol với nồng độ 6, 8, 10, 12, 14%v/v Sau tiến hành ủ nhịệt độ thường (28 - 320C) Theo dõi khả phát triển chủng sau 48 - 72 cách quan 34 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 sát mức độ sinh trưởng mạnh hay yếu chúng môi trường thạch đĩa Chọn chủng Actobater có khả chịu nồng độ ethanol cao → định danh để xác định loài 2.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm dứa chủng vi sinh vật phân lập Dứa  Gọt vỏ  Ép  lọc Pha lỗng (1 dứa:3 nước) Lên men  Rót chai  Thanh trùng Thành phẩm Khi lên men bổ sung Acetobacter phân lập ( 10%v/v) Đồng thời khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men: pH, ethanol thời gian lên men hảo sát ảnh hưởng pH ban đầu: Sử dụng dịch dứa sau pha loãng với khoảng pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0, 5,5; 6,0 6,5 Cho lên men với chủng Acetobacter 10% v/v phân lập được, mật độ tế bào 106 CFU/ml Thể tích lên men 100mL, acid acetic bổ sung ban đầu 0,6% v/v, ethanol 8% v/v, nhiệt độ phòng (khoảng 28-32oC), thời gian lên men ngày Định lượng acid acetic tạo phương pháp chuẩn độ hảo sát ảnh hưởng ethanol bổ sung: Sử dụng dịch dứa sau pha loãng cho lên men với chủng Acetobacter 10% v/v phân lập được, mật độ tế bào 106 CFU/ml Thể tích lên men 100mL, acid acetic bổ sung ban đầu 0,6% v/v, pH tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.1, nhiệt độ phịng (khoảng 28-32oC), thời gian lên men ngày Định lượng acid acetic tạo phương pháp chuẩn độ hảo sát ảnh hưởng thời gian lên men: Sử dụng dịch dứa sau pha loãng cho lên men với chủng Acetobacter 10% v/v phân lập được, mật độ tế bào 106 CFU/ml Thể tích lên men 100ml, acid acetic bổ sung ban đầu 0,6% v/v, pH tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.1, ethanol bổ sung tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.2, nhiệt độ phịng (khoảng 28-32oC), thời gian lên men 2, 4, 6, ngày Định lượng acid acetic tạo phương pháp chuẩn độ 2.4 Xử lý số liệu Các thí nghiệm lặp lại lần, kết ghi nhận xử lý thống kê phần mềm Statgraphic Centurion XV.I, Excel 2013 với mức độ tin cậy 95% Kết thảo luận 3.1 Phân lập chủng Acetobacter Các chủng vi khuẩn lựa chọn vi khuẩn acid acetic chúng tạo vịng halo mơi trường YPGD Kết nhuộm Gram khuẩn lạc có màu hồng đỏ thu 14 chủng vi khuẩn (Gq1, Gq2, Gq3, Gq4, Gq5, GN1, GN2, GN3, D1, D2, D3, TS1, TS2, TS3) thỏa mãn điều kiện chúng có đa dạng đặc điểm hình thái, khuẩn lạc cụ thể sau: Phần lớn khuẩn lạc trịn đều, bìa nguyên, số trơn bóng, số có tâm Có màu trắng đục, trắng màu vàng nhạt Có hình cầu, hình que ngắn que dài xếp thành chuỗi Tuyển chọn chủng có khả sinh acid acetic mạnh Tiến hành cấy chấm điểm chủng vi khuẩn phân lập môi trường YPGD Sau 48 quan sát vòng phân giải CaCO3 xung quanh điểm cấy Kết thể hình bảng Bảng Đường kính vịng phân giải CaCO3 Chủng Gq1 Gq2 Vòng phân giải CaCO3 (mm) 8,0 ± 1,15c 9,67 ± 0,88cd Chủng D1 D2 35 Vòng phân giải CaCO3 (mm) 18,0 ± 1,15f 13,0 ± 1,53e Đỗ Thị Hiền Gq3 Gq4 Gq5 GN3 GN4 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter 11,33 ± 1,20de 19,33 ± 1,20fg 0,0 ± 0.0a 3,0 ± 1,53ab 1,33 ± 0,67ab 4,33 ± 1,20b 10,33 ± 0,88cde 11,67 ± 0,33de 20,67 ± 1,20fg 21,67 ± 0,88g D3 GN1 GN2 TS1 TS2 Gq D1 TS2 GN Hình Hình dạng khuẩn lạc hình thái vi thể chủng Gq2, GN1, D1, TS1,TS2 TS3 Hình Vịng phân giải CaCO3 chủng phân lập Qua số liệu thể bảng 3.2, ta thấy chủng Gq5 chủng GN4 cho kết đường kính phân giải CaCO3 thấp Gq5 (0,0mm), GN4 (1,33mm) Một số chủng có đường kính phân giải cao như: TS2 (21,67mm), TS1 (20,67mm), Gq4 (19,33mm), D1 (18,0mm) Với mục đích tuyển chọn chủng có khả tạo vịng halo cao, nhóm tiến hành sàng lọc, loại bỏ hai chủng Gq5 chủng GN4, 12 chủng lại tiếp tục tiến hành thử nghiệm sinh hóa khác 36 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 Thử nghiệm tính sinh acid acetic Để kiểm chứng khả oxy hóa ethanol thành acid acetic chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành định tính acid acetic tạo mơi trường nuôi cấy dung dịch FeCl3 5% Kết cho thấy 11 chủng phân lập có chủng không tạo acid acetic chủng Gq1 chủng D2 (môi trường giữ nguyên màu vàng ban đầu), chủng lại tạo acid acetic chúng tạo dung dịch có màu đỏ thẫm chúng có màu nhạt so với ống nghiệm chứa dung dịch acid acetic chuẩn Acid chuẩn TS D Gq TS GN GN Gq2 Gq GN Gq1 D2 Đ C Hình Định tính acid acetic chủng vi khuẩn phân lập Thử nghiệm khả oxy hóa acetate Bảng t phân loại chủng acid acetic phân lập STT Loại mẫu Ký hiệu Giấm gạo Gq2 Gq3 Gq4 GN1 GN2 GN3 D1 TS1 TS2 Acetobacter Giấm nuôi Nước dừa lên men Dịch thủy sâm Phân lọai Gluconobacter X X X X X X X X X Theo tài liệu định danh Bergey (Holt cộng sự, 1994), dựa vào phản ứng oxy hóa acetate chia chủng phân lập thành hai nhóm Acetobacter Gluconobacter Tiến hành cấy chủng phân lập mơi trường YPGD có bổ sung 0,01% g/L bromocresol green Ủ nhiệt độ phòng (28 – 32oC) 24 giờ, quan sát thấy tất chủng chuyển môi trường từ màu xanh lam sang màu vàng Tuy nhiên sau 72 có khác biệt màu sắc môi trường chủng phân lập, số chủng môi trường giữ màu vàng Gluconobacter, số chủng chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục Acetobacter Kết phân loại thể Bảng hình ảnh minh họa hình Các chủng Acetobacter dễ dàng phân biệt với chủng Gluconobacter nhờ đặc điểm Q - (thành phần ubiquinone 37 Đỗ Thị Hiền Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter màng tế bào) chúng giúp chủng Acetobacter dễ dàng thực q trình oxy hóa acetate tạo sản phẩm cuối CO2 H2O Còn chủng Gluconobacter khơng diễn q trình oxy hóa acetate (Larpent et al., 1990) Đối với chất thị bromocresol green nhạy cảm với pH thấp pH đạt mức 4,5 chuyển sang màu xanh lục Đối với chủng Acetobacter, việc tạo CO2 làm giảm pH môi trường pH đạt mức 4,5 làm môi trường chuyển từ vàng sang xanh lục Trong chủng Gluconobacter không tạo CO2 nên môi trường giữ màu vàng ban đầu A B D C Hình ự bi n đổi màu môi trường thị sau 72 *Ghi ch : (A): màu môi trường đối chứng; (B) visinh vật không làm đổi màu môi trường; (C) chủng Acetobacter làm môi trường chuyển màu xanh;, (D) chủng Gluconobacter làm môi trường chuyển sang màu vàng 3.2 Kiểm tra khả phát triển chủng phân lập mơi trường có bổ sung ethanol Cấy chủng phân lập môi trường phân lập YPGD bổ sung nồng độ ethanol khác nhau: 6%, 8%, 10%, 12%, 14% (%v/v) Ủ nhiệt độ phòng (28 – 32oC) 48 giờ, ta thu kết Bảng Bảng Mức độ phát triển chủng vi khuẩn phân lập môi trường chứa n ng độ ethanol khác STT Chủng Ethanol 6%(v/v) Ethanol 8%(v/v) Ethanol 10%(v/v) Ethanol 12%(v/v) Ethanol 14%(v/v) Gq4 ++ + + - - GN1 + - - - - D1 ++ ++ ++ TS1 ++ ++ ++ + - TS2 ++ ++ ++ ++ - - *Ghi ch : (++) Phát triển mạnh , (+) Phát triển, (-) hông phát triển Từ bảng ta thấy tất chủng phát triển mạnh mơi trường chứa 6% ethanol, 8% khả phát triển bắt đầu giảm không phát triển mơi trường có chứa nồng độ ethanol 14% Ở mơi trường có chứa 12% ethanol, có hai chủng D1 TS2 phát triển Trong chủng TS2 cho kết phát triển chủng D1 Chọn chủng TS2 để định danh loài để khảo sát cho thí nghiệm Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy đoạn DNA khuếch đại chủng TS2 tương đồng với gen mã hóa 16S rDNA lồi Acetobacter senegalensis, mã số LN606600.1 với độ tương đồng 100% 38 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 A C B E D Hình Thử khả chịu n ng độ ethanol cao chủng phân lập *Ghi chú: (A):các chủng môi trường ethanol 6% v/v; (B) môi trường ethanol 8% v/v; (C) môi trường ethanol 10% v/v, (D) môi trường ethanol 12% v/v, (E) môi trường ethanol 14% v/v Hình t so sánh độ tương đ ng đoạn DNA chủng T với liệu ngân hàng gen NCBI 39 Đỗ Thị Hiền Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter 3.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm dứa chủng vi sinh vật phân lập Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu Để xác định khoảng pH thích hợp cho trình lên men giấm dứa, tiến hành cho lên men 100ml dịch dứa xử lý chỉnh nồng độ đường lên 10g/L, bổ sung 8% v/v ethanol, 0,6% v/v acid acetic, 10% v/v dịch TS2 tăng sinh, thời gian ngày Lấy mẫu để chuẩn độ để xác định % acid acetic mẫu Kết thu theo Bảng Hình Bảng N ng độ acid acetic thu ứng với giá trị pH pH % acid acetic 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 1,50 ± 0,17a 1,73± 0,16ab 2,36 ± 0,04bc 3,43 ± 0,26d 3,23 ± 0,32d 2,50 ± 0,29c 1,32 ± 0,27a Hình Đ thị thể hàm lượng acid acetic tương ứng với giá trị pH Trong trình lên men lượng acid acetic tạo đến thời điểm quay ngược trở lại ức chế lên phát triển chủng Acetobacter acid acetic làm giảm pH mơi trường pH cao hay thấp ảnh hưởng trực tiếp đến trình sinh trưởng chủng Acetobacter Kết phân tích Statgraphics cho thấy có khác biệt có ý nghĩa phương diện thống kê học (P < 0,05) giá trị trung bình nồng độ acid acetic sinh sau lần thí nghiệm tương ứng với giá trị pH khác Từ đồ thị ta thấy lượng acid acetic sinh có xu hướng tăng dần từ pH 3,5 lên pH 5,0 giảm dần tăng pH từ 5,0 lên 6,5 Ở pH 3,5 ÷ 4,0 lượng acid acetic sinh (1,5 - 1,73%) pH thấp làm ức chế hoạt động A senegalensis Trong khoảng pH 4,5 ÷ 6,0, acid acetic tạo cao, pH 5,5 acid acetic đạt mức cao với 3,51% Nhưng pH tăng cao đến mức 6,5 lượng acid acetic sinh giảm mạnh xuống cịn 1,32%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với giá trị lại Nghiên cứu S.Ghosh (2012) lên men giấm trái cọ cho thấy chủng Acetobacter spp có khả sinh acid acetic cao khoảng pH 4,5 ÷ 6,5 Điều chứng tỏ, khoảng pH tối ưu cho trình lên men chủng Acetobacter senegalensis khoảng từ 5,0 ÷ 5,5 Quan sát sản phẩm ta thấy màu dịch dứa có sư thay đổi rõ rệt, khơng giữ màu vàng ban đầu, màu sắc đậm dần theo giá trị tăng pH Đồng thời chủng Acetobacter senegalensis tạo màng mỏng, chìm đáy trình lên men tạo nhiều vẩn đục làm cho màu sắc môi trường bị thay đổi Khảo sát ảnh hưởng ethanol bổ sung Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol bổ sung vào mơi trường thích hợp cho q trình lên men giấm dứa, tiến hành cho lên men 100mL dịch dứa xử lý bổ sung đường 10g/L, acid acetic 0,6% v/v, dịch Acetobacter senegalensis 10% v/v tăng sinh, pH =5,0-5,5, thời gian ngày, nhiệt độ phòng Định lượng % acid acetic mẫu Kết thu theo Bảng hình 40 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 Bảng N ng độ acid acetic thu ứng với n ng độ ethanol Nồng độ ethanol (%v/v) 10 12 14 Acid acetic (%) 3,37 ± 0,29c 3,10 ± 0,55c 2,07 ± 0,14b 1,60± 0,06ab 0,77 ± 0,08a Hình N ng độ acid acetic thu ứng với n ng độ ethanol Ethanol yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khả tạo thành acid acetic chủng Acetobacter spp Kết thu cho thấy chủng Acetobacter senegalensis có khả oxi hóa ethanol cao Dựa vào phân tích số liệu phần mềm Statgraphics cho thấy có khác biệt có ý nghĩa phương diện thống kê học (P < 0,05) giá trị trung bình nồng độ acid acetic sinh sau lần thí nghiệm tương ứng với mức nồng độ ethanol khác Lượng acid acetic sinh cao mức ethanol 6% 8% có xu hướng giảm dần nồng độ ethanol tăng lên Ở nồng độ ethanol 6% cho kết nồng độ acid acetic cao với 3,37%, tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 8% chủng A senegalensis phát triển tốt với 3,10% acid acetic Tuy nhiên, lượng acid acetic tạo thành giảm đáng kể từ 3,10% 8% ethanol xuống 2,07% 10% ethanol Khi tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 12% 14%, lượng ethanol cao khiến chủng vi khuẩn A senegalensis bị ức chế dẫn đến lượng acid acetic tạo thành thấp đạt 1,6% (tương ứng mức ethanol 12%) 0,77% (tương ứng mức ethanol 14%) Kết phù hợp với nghiên cứu Ndoye, Bassirou cộng (2007), vi khuẩn A senegalensis chịu nồng độ ethanol lên đến 10%, chí A senegalensis phát triển mơi trường có nồng độ ethanol 12% lượng acid acetic tạo thành không cao Nghiên cứu Nguyễn Đức Lượng cộng (2004) nồng độ ethanol thích hợp cho trình lên men giấm - 15% Tuy nhiên khả oxi hóa ethanol để taọ thành acid acetic vi khuẩn acetic có thay đổi lớn giống, loài điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men nhiệt độ, pH, phương pháp lên men Vì với nồng độ ethanol 12% 14% lượng acid acetic tạo thành thấp Ngược lại, nồng độ ethanol 6% , 8% 10% cho lượng acid acetic sinh cao nồng độ ethanol vi khuẩn thích ứng nhanh với mơi trường, kích thích sinh trưởng phát triển vi khuẩn, acid sinh nhiều, pH giảm mạnh ức chế hoạt động vi sinh vật khác Quan sát dịch dứa không giữ màu vàng ban đầu chủng Acetobacter senegalensis trình lên men tạo nhiều vẩn đục làm cho màu sắc môi trường bị thay đổi Đồng thời chủng tạo màng chắc, mỏng nồng độ ethanol 6% 8% môi trường Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Để xác định thời gian lên men thích hợp, tiến hành cho lên men 100mL dịch dứa xử lý có bổ sung 8% v/v ethanol, 0,6% v/v acid acetic, 10g/L glucose, 10% v/v dịch vi khuẩn Acetobacter senegalensis tăng sinh, pH= 5-5,5 Cách hai ngày, lấy mẫu để chuẩn độ nhằm xác định % acid acetic mẫu Kết thu theo bảng hình 41 Đỗ Thị Hiền Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter Bảng N ng độ acid acetic thu theo thời gian Thời gian lên men (ngày) Acid acetic (%) 1,32 ± 0,17a 1,79 ± 0,24ab 2,65 ± 0,42abc 3,74 ± 0,59c 10 2,91 ± 0,60bc 12 1,86 ± 0,45ab Hình Đ thị thể thay đổi hàm lượng acid acetic theo thời gian Lượng acid acetic tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ 8, 1,32%; 1,79%; 2,65%; 3,74% lúc chủng Acetobacter senegalensis trải qua giai đoạn thích nghi, tăng trưởng phát triển mạnh nên lượng acid acetic tích lũy qua ngày tăng Ở ngày thứ lượng acid acetic thu cao (3,74%), đến ngày thứ 10 lượng acid aceic có dấu hiệu giảm (cịn 2,91%) đến ngày 12 giảm mạnh (cịn 1,86%) Nguyên nhân lượng acid acetic tạo cao ức chế trở lại trình phát triển vi khuẩn làm khả chuyển hóa ethanol thành acid acetic giảm, hết ethanol nên vi khuẩn phải oxy hóa acid acetic lấy lượng để sống Cũng thời gian dài làm bay lượng acid cetic Vì thế, khoảng từ - 10 ngày nên thu sản phẩm kết thúc trình lên men Kết tương tự nghiên cứu Nguyễn Thị Thùy Lam (2006), lên men giấm trái chủng Acetobacter aceti, thời gian lên men chủng khoảng từ 12 ngày, cụ thể lượng acid acetic sinh ngày 3,54%, 10 ngày 3,69%, 12 ngày 3,61% Bên cạnh đó, nghiên cứu Võ Thị Ngọc Bích (2012) thời gian lên men giấm chủng Acetobacter tropicalis cho kết tối ưu - ngày Với điều kiện nuôi cấy 37oC ba chủng DK1, DK4, K4 sau ngày ba chủng cho hàm lượng acid acetic cao DK1 (3,42%), DK4 (3,54%), K4 (3,66%) Còn theo nghiên cứu TS Trịnh Văn Dũng (2005), thời gian lên men dịch nước mía chủng Acetobacter spp cho kết thời gian lên men tối ưu ngày với lượng acid acetic thu 5,74% Và nghiên cứu Seyram K Sossou (2009) tiến hành theo dõi phát triển chủng Acetobacter spp ASV03 cho thấy ASV03 tăng trưởng nhanh ngày thứ đến ngày thứ 11 với mật độ tế bào đo 106 cfu/mL (ngày thứ 2) tăng lên 1,2 x 109 cfu/mL (ngày thứ 11), sau ngày thứ 11 mật độ giảm xuống đạt 4,4 x 105 cfu/mL vào ngày thứ 23 Kết luận Từ nguồn mẫu ban đầu giấm gạo, giấm nuôi, nước dừa lên men, dịch thủy sâm phân lập chủng nghi ngờ chủng Acetobacter Gq4, GN1, D1, TS1, TS2 Khả phát triển chủng YGPD có bổ sung nồng độ ethanol khác 6, 8, 10, 12, 14% tuyển chọn ba chủng phát triển tốt nồng độ ethanol 10% chủng D1, TS1, TS2 42 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018 Có hai chủng D1 chủng TS2 phát triển môi trường chứa 12% ethanol, TS2 cho kết tốt Tiến hành định danh 16S cho kết TS2 chủng Acetobacter senegalensis Là chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao (có thể phát triển nhiệt độ 40 oC), có khả lên men tạo 6% acid acetic Các thí nghiệm khảo sát điều kiện ni cấy chủng Acetobacter senegalensis để lên men giấm dứa thu kết sau: Ở ngày cho lượng acid acetic cao 3,74%, pH tối ưu khoảng 5,0 ÷ 5,5 với lượng acid acetic tạo 3,03 ÷ 3,58%; nồng độ ethanol từ - 8% v/v cho kết lên men cao với 3,10 ÷ 3,37% acid acetic Sàng lọc thêm yếu tố chủng phân lập như: Khả phát triển nồng độ acid acetic khác nhau, nhiệt độ khác Khảo sát thêm số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm như: hàm lượng giống bổ sung, khảo sát lượng acid acetic cho vào môi trường ban đầu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Võ Thị Ngọc Bích (2012), Ảnh hưởng ethanol acid acetic đ n khả lên men Acetobacter tropicalis, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ [2] Trịnh Văn Dũng (2005), Lên men liên tục acid acetic từ nguyên liệu tự nhiên phương pháp nhanh, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng [3] Davidson, P M., and A L Branen (1993), "Antimicrobials in foods", Food science and technology (USA) [4] Ghosh, S., et al (2012), "Study on fermentation conditions of palm juice vinegar by response surface methodology and development of a kinetic model", Brazilian Journal of Chemical Engineering 29.3, pp: 461-472 [5] Nguyễn Thị Thùy Lam (2006), Thử nghiệm lên men trái theo phương pháp lên men h i lưu cố định vi khuẩn giá thể, Luận văn kỹ sư, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM [6] Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ vi sinh vật, tập 1, NXB Đại học Quốc gia TP HCM [7] Moryadee, Amornrut, and Wasu Pathom-Aree (2008), "Isolation of thermotolerant acetic acid bacteria from fruits for vinegar production", Res J Microbiol 3, pp: 209-212 [8] Lê Văn Nhương (1990), Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất giấm suất cao, NXB Nông nghiệp [9] Nanda, Kumiko, et al (2001), "Characterization of acetic acid bacteria in traditional acetic acid fermentation of rice vinegar (komesu) and unpolished rice vinegar (kurosu) produced in Japan", Applied and Environmental Microbiology 67.2, pp: 986-990 [10] Ndoye, Bassirou, et al (2007), "Acetobacter senegalensis sp nov., a thermotolerant acetic acid bacterium isolated in Senegal (sub-Saharan Africa) from mango fruit (Mangifera indica L.)", International journal of systematic and evolutionary microbiology 57.7, pp: 1576-1581 [11] Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn, Lê Thị Mỹ Xuyên (2014), Phân lập, tuyển chọn nấm men vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ [12] Shafiei, Rasoul, et al (2013), "Evaluation of viability and growth of Acetobacter senegalensis under different stress conditions", International journal of food microbiology 163.2, pp: 204-213 [13] Sharafi, S M., I Rasooli, and K Beheshti-Maal (2010), "Isolation, characterization and optimization of indigenous acetic acid bacteria and evaluation of their preservation methods", Iranian Journal Of Microbiology 2.1, pp: 38 [14] Nguyễn Trương Bảo Trân (2007), Chọn giống vi khuẩn khảo sát số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây, Trường Đại học Sư phạm TP HCM 43 ... hai chủng Gq5 chủng GN4, 12 chủng lại tiếp tục tiến hành thử nghiệm sinh hóa khác 36 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)- 2018 Thử nghiệm tính sinh acid acetic Để kiểm chứng khả oxy hóa. .. Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn, Lê Thị Mỹ Xuyên (2014), Phân lập, tuyển chọn nấm men vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ [12]... so sánh độ tương đ ng đoạn DNA chủng T với liệu ngân hàng gen NCBI 39 Đỗ Thị Hiền Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter 3.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men giấm dứa chủng