LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) phân lập SUS1 promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa SUS1 promoter và gen cryia (c)

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Tác giả ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy PGS TS Nông Văn Hải – Phó viện trưởng Viện cơng nghệ sinh học, Giám đốc phịng thí nghiệm trọng điểm – Trưởng phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng tận tình dẫn, giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận văn Viện công nghệ sinh học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS - NCS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS Lê Thị Thu Hiền, CN Dương Thị Thu Hà, toàn cán bộ, đồng nghiệp phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ, động viên q trình cơng tác nghiên cứu khoa học Phịng Thí nghiệm thời gian thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng Công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020 Bộ Nông Nghiệp phát triển Nông thôn tạo điều kiện cho thực luận văn khuôn khổ đề tài mã số CNSH ĐT 03/06 -2010 Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên tận tình dạy dỗ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập khoa Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên, Các thầy cô Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu khoa học sống Sự tin tưởng khích lệ từ gia đình giúp tơi vững vàng, tồn tâm, tồn ý cho cơng việc Từ trái tim mình, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến tất người ! Thái Nguyên, ngày 22 tháng năm Tác giả MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng gen kháng sâu Bt tạo trồng chuyển gen có khả kháng sâu tự nhiên 1.2 Những nghiên cứu Bacillus thuringiensis gen cry .4 1.2.1 Những nghiên cứu chung Bacillus thuringiensis 1.2.2 Một số nghiên cứu gen Cry 1.2.3 Một số nghiên cứu gen cryIA(c) 1.3 Promoter vai trò điều khiển biểu gen 1.3.1 Cấu trúc gen 1.3.2 Cấu trúc promoter 10 1.3.3 Vai trò điều khiển biểu gen promoter 12 1.3.4 Những nghiên cứu Sus1 promoter 15 1.4 Agrobacterium tumefaciens chế chuyển gen vào thực vật 17 1.4.1 Giới thiệu chung Agrobacterium tumefaciens 17 1.4.2 .Cấu trúc chức Ti-plasmid 18 1.4.3 Cấu trúc chức đoạn T- DNA 19 1.4.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19 1.4.5 Tương tác T - DNA genome tế bào thực vật 21 1.4.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .22 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP 27 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số mầm ngô 27 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose 28 2.2.3 PCR (Polymerase chain reaction) 30 2.2.4 Xử lý DNA enzyme hạn chế 31 2.2.5 Phản ứng nối ghép gen 32 2.2.6 Biến nạp plasmid 32 2.2.7 Tách chiết DNA plasmid .34 2.2.8 Tinh ADN từ gel agarose cột 35 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập Sus1 promoter từ mầm ngô 36 3.1.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ mầm ngơ 36 3.1.2 Tách dịng đoạn Sus1 promoter pJET 1.2/blunt 39 3.1.3 Trình tự đoạn Sus1 promoter 42 3.2 Thiết kế vector biểu gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter gen cryIA(c) 45 3.2.1 Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46 3.2.2 Chuyển kết cấu biểu chứa Sus1 promoter gen cryIA(c) vào pCB301 49 3.3 Chuyển kết cấu Sus1 promoter cryIA(c) pCB301 vào A tumefaciens 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ Amp Ampicilin Bp Cặp base (base pair) Bt Bacillus thuringiensis ddNTP Dideoxy Nucleoside triphosphate DNA Deoxyribo Nucleoic acid dNTP Deoxy ribo Nucleoside triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtOH Cồn (Ethanol) Kb Kilo base (1kb = 1000bp) kDa KiloDalton LB Luria Broth PCR Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngược Pcb Vector pCB301 – Kan pJET Vector pJET 1.2/blunt Rif Rifamycin RT- PCR Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược SDS Sodium Dodecyl Sulphate Tm Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) v/p Vòng/phút Đtg Đồng tác giả DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 1: Cấu trúc gen 10 Hình 1.2: Vị trí promoter gen 10 Hình 1.3 : Bản đồ Ti - plasmid dạng octopin 19 Hình Quá trình chuyển T - ADN vào tế bào thực vật 20 Hình 3.1 : DNA Tổng số tách từ mầm ngô 38 Hình 3.2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter cặp mồi F8 39 Hình 3.3 Điện di sản phẩm tách plasmid chọn dòng vector pJET 1.2/blunt 41 Hình 3.4 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector pJET 1.2/blunt 42 Hình 5: Kiểm tra plasmid vector chọn dịng pJET1.2/blunt 42 Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn Sus1 promoter từ ngơ Q411 với trình tự MZESUS1 cơng bố Hình 3.7: Sơ đồ thiết kế vector pCB301 mang gen Cry1A(c) Sus1 promoter Hình 3.8: Ảnh điện di đồ plasmid tái tổ hợp vector pRTRA7/3 Hình 3.9: PCR kiểm tra đoạn Sus1 promoter cặp mồi Zsuc-PstIF Zsuc-NcoIR Hình 3.10: Kiểm tra plasmid vector pRTRA7/3 tái tổ hợp enzyme Pst I NcoI 44, 45 46 48 53 49 Hình 3.11: Kết cấu kiểm tra Sus1 promoter gen cryIA(c) vector pCB301 Hind III 50 Hình 3.12: Sản phẩm tách DNA từ A Tumefaciens 52 Hình 13: Sản phẩm PCR từ chủng Tumefaciens với cặp mồi Zsuc - PstI Zsuc - NcoIR 52 vii DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Một số trình tự thường có promoter sinh vật nhân chuẩn 11 Bảng Các cặp mồi sử dụng 25 Bảng 2 Các hóa chất sử dụng 26 Bảng Trang thiết bị dùng nghiên cứu 28 Bảng 2.4 Tương quan nộng độ gel agarose kích thước đoạn DNA cần phân tách 33 MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật, ngồi việc tìm kiếm phân lập gen quy định cho tính trạng có giá trị việc tìm kiếm phân lập promoter cần thiết để tăng cường mức độ biểu đặc hiệu gen Trước đây, gen quan tâm thường điều khiển promoter định như: CaMV 35S - promoter, actin promoter, NOS promoter, Ubiquitin promoter dẫn đến sản phẩm gen biểu hầu hết mô quan Xu hướng sử dụng promoter đặc hiệu để điều khiển gen mô mong muốn giai đoạn phát triển định Promoter gen mã hóa sucrose synthase1 (Sus1) ngơ chứng minh thuốc chuyển gen promoter đặc hiệu tế bào phloem Vì vậy, Sus1 promoter ngơ sử dụng nghiên cứu chuyển gen nhằm biểu tính trạng phloem [74] Ở Việt Nam, promoter gen mã hóa sucrose synthase1 phân lập hai giống lúa Tám xoan Dự thơm nhằm mục đích làm nguyên liệu cho nghiên cứu chuyển gen cho lúa [4] Các gen cry phân lập từ chủng Bacillus thuringensis (Bt) Có khoảng 150 gen mã hóa cho protein tinh thể độc có tác dụng với số loại sâu Trong số nghiên cứu độc tố cry, cryIA(c) protein nghiên cứu kỹ, bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng cánh vẩy Trên giới, việc thiết kế vector chuyển gen thực vật mã hóa protein gây độc cho trùng có nguồn gốc từ Bt năm đầu thập kỷ 20 Đến năm 2002, trồng chuyển gen có khả sinh độc tố kháng sâu có nguồn gốc Bt trồng 62 triệu hecta toàn giới [66] Gen cry chuyển vào nhiều trồng như: cryIA(b) vào thuốc lá, gen cryIA(c) vào cà chua, đậu tương, lúa, [38, [59], [70] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thiết kế vector chứa gen kháng sâu tiến hành nhiều Gen cryIA(c) chuyển vào vector chuyển gen hệ điều khiển Ubiquitin promoter phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào lúa [3] thiết kế vector pCB301 điều khiển 35S promoter để kiểm tra biểu thuốc Nicotiana benthaminana nhằm phục vụ nghiên cứu chuyển gen cho lâm nghiệp [7] Tuy nhiên với loại trồng việc thiết kế vector chuyển gen cần thực để tối ưu cho phù hợp với đặc điểm loài Đồng thời, khả kháng sâu chuyển gen cần phải có tính đặc hiệu cho phù hợp với tình trạng sâu bệnh loại trồng [18] Vì vậy, nghiên cứu này, với mục đích phân lập promoter đặc hiệu phloem phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cho ngô, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập Sus1 promoter từ ngô thiết kế vector biểu chứa Sus1 promoter gen cryIA(c)” 1.1 Mục tiêu đề tài Tạo vector biểu thực vật mang đồng thời Sus1 promoter phân lập từ ngô gen cryIA(c) kháng côn trùng 1.2 Yêu cầu đề tài - Nắm cấu trúc Sus1 promoter, đặc điểm, cấu trúc gen cryIA(c) - Nắm nguyên lý, kỹ thuật phương pháp thực q trình tách dịng gen, gắn gen vào vector biểu - Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens chứa Sus1 promoter gen cryIA(c) 1.3 Nội dung đề tài - Phân lập Sus1 promoter từ ngô - Thiết kế vector biểu thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter gen cryIA(c) kháng côn trùng - Tạo chủng A.tumefaciens mang Sus1 promoter gen cryIA(c) kháng côn trùng 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết đề tài cung cấp nguyên liệu phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào ngơ số trồng nơng nghiệp có giá trị khác Nhằm tạo chuyển gen kháng côn trùng có tính đặc hiệu phloem Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng gen kháng sâu Bt tạo trồng chuyển gen có khả kháng sâu tự nhiên Trong nơng nghiệp, ngành trồng trọt chịu ảnh hưởng yếu tố thời tiết, dịch bệnh Yếu tố nguyên nhân dẫn tới giảm suất chất lượng trồng Nghiêm trọng hơn, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học bừa bãi dẫn đến tình trạng sâu kháng lại thuốc trừ sâu hóa học Vấn đề khiến nhà quản lý người nơng dân gặp khó khăn hạn chế tổn thất suất lựa chọn đối tượng trồng loại thuốc bảo vệ thực vật phù hợp Sau loại protein hệ thứ bao gồm δ- endotoxin có khả kháng sâu vi khuẩn Bt (Cry, Cyt) phát nghiên cứu rộng rãi, nhiều loài trồng biến đổi gen chứa gen kháng sâu mở triển vọng mới, thiết lập nông nghiệp sạch, an tồn Ngay từ năm 2002, trồng chuyển gen có khả sinh độc tố kháng sâu có nguồn gốc Bt trồng 62 triệu hecta toàn giới [66] Ưu điểm bật trồng chuyển gen bền vững điều kiện tự nhiên giúp trồng kháng tương đối nhiều sâu bệnh Do đó, nhiều loại trồng chuyển gen chứa nhiều gen Bt (ví dụ gen cry, cyt, vip) nghiên cứu, thương mại hóa rộng rãi loại trồng đóng vai trị quan trọng thị trường giới [59] Tuy nhiên qua nhiều năm trồng đại trà Mỹ số nước khác giới Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản Các trồng chuyển gen thuộc hệ bộc lộ nguy bị giảm khả kháng nhiều loài sâu bệnh tiến hố có khả kháng với độc tố tiết [41], [54] Ngồi ra, việc biểu tính trạng kháng sâu không đặc hiệu không ổn định việc sử dụng promoter không đặc hiệu biểu không mạnh Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển loại protein diệt sâu đồng thời biểu đặc hiệu phận trồng quan tâm nghiên cứu ngày sâu, rộng Năm 2001, ba gen kháng sâu cryIA(c), cryIIA gna (mã hoá lectin bạch đàn) chuyển vào lúa (Oryza sativa) giống M7 Basmati 370 [47] Các protein biến nạp cho thấy tế bào khả biến A tumefaciens chủng C58 mọc tốt cịn đối chứng khơng mọc Các khuẩn lạc A tumefaciens có chứa plasmid tái tổ hợp phát phương pháp tách chiết DNA plasmid hình 3.12 sau để khẳng định chắn tiến hành PCR sản phẩm tách A tumefaciens Hình 12: Sản phẩm tách DNA từ A Tumefaciens MK: Maker; Đ/C: Đối chứng Agrobacterium ko chứa đoạn chèn; 1, 2, Agrobacterium chứa vector pCB301 + Sus1 + cryIA(c) Để khẳng định chắn tiến hành PCR sản phẩm tách A tumefaciens với cặp mồi ZSus - PstIF ZSus - NcoIR Kết thể (hình 3.13) cho thấy chúng tơi tạo chủng A Tumefaciens chứa vector pCB301 mang Sus1 promoter gen cryIA(c) M kb 1,5kb 1,0kb 1,2kb Hình 3.13: Sản phẩm PCR từ chủng A Tumefaciens với cặp mồi Zsuc PstIF Zsuc -NcoIR M: Maker, 1: Sản phẩm PCR từ A Tumefaciens Với việc phân lập đoạn Sus1 promoter từ dịng ngơ Q411 Việt Nam, chủ động nguồn nguyên liệu promoter cần thiết cho nghiên cứu chuyển gen sau này, đặc biệt có nhu cầu cần biểu tính trạng mong muốn tế bào phloem Việc biểu gen ngoại lai trồng thuận lợi gen điều khiển bới promoter có nguồn với chuyển gen Vì vậy, cấu trúc pCB301 + Sus1 + cryIA(c) tạo có Sus1 promoter phân lập từ ngơ có giá trị cho việc biểu gen cryIA(c) ngơ chuyển gen Ngồi ra, cấu trúc sử dụng nghiên cứu chuyển gen nhằm tăng cường khả kháng sâu cho trồng khác Như đề cập, đoạn gen cryIA(c) nghiên cứu có gắn với trình tự mã hóa cho đoạn peptide cmyc nên thuận lợi cho việc kiểm tra điều khiển Sus1 promoter biểu gen cryIA(c) chuyển gen lai western với kháng thể kháng cmyc Như vậy, việc phân lập Sus1 promoter từ ngô thiết kế vector pCB301 + Sus1 + cryIA(c) tạo nguồn nguyên liệu có giá trị cho nghiên cứu chuyển gen cho trồng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đưa số kết luận sau: Đã phân lập Sus1 promoter từ dịng ngơ Q411 Việt Nam xác định trình tự Sus1 promoter với kích thước 1116 bp với hộp TATA vị trí - 55 hộp CCAAT vị trí - 136 so với vị trí khởi đầu dịch mã có độ tương đồng 100% so với trình tự MZESUS1 công bố Ngân hàng gen quốc tế Đã thiết kế vector biểu thực vật pCB301 + Sus1 + cryIA(c) mang Sus1 promoter gen cryIA(c) Đã tạo chủng A tumefaciens C58 (pGV2260) mang vector pCB301+Sus1+cryIA(c) phục vụ cho việc chuyển gen kháng sâu vào ngô trồng khác Việt Nam Đề nghị Kiểm tra biểu gen cryIA(c) điều khiển Sus1 promoter mơ hình Tiến hành chuyển gen cryIA(c) điều khiển Sus1 promoter vào ngô TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình (2009), Tạo trồng chuyển gen kháng vi rus kỹ thuật RNAi, Hôi nghị Quốc gia Sinh vật biến đổi gen Quản lý an toàn sinh học, 2009, pp, 19 – 28 Lê Thị Thu Hiền, (2003), “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng” Luận án tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (2004) “Thiết kế vector hệ mang gen kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào trồng, “ Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (1): 8592 Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Hải Hà, Đào Thị Thu Hà, Vũ Hải Chi, Nguyễn Viết Cường, Nơng Văn Hải “Phân lập xác định trình tự đoạn điều khiển gen tổng hợp đường (Rsuc1 – promoter) từ giống lúa Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học số (1): 57 – 67, 2007 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007) “Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật” Tạp chí Cơng nghệ sinh học Trần Thị Cúc Hòa, “Tạo dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu chịu hạn”, Cần Thơ, 2007 Huỳnh Thu Huệ, Trần Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải (2008) “Thiết kế vector kiểm tra biểu gen CryIA(c) thuốc Nicotiana Benthamiana”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học số (4): 1-6 Võ Thị Thương Lan, (2006), “Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng“, NXB Giáo dục, Hà Nội Đặng Trọng Lượng, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001), “Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) thông qua Agrobacterium”, Kết nghiên cứu khoa học 1999 – 2000, Viện di truyền Nông Nghiệp, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, pp 120 – 128 10 Tạ Kim Nhung, (2009), “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen kháng sâu (CryIAc) số dịng ngơ Việt Nam thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, luận văn Thạc sỹ khoa học, Trường Đại học khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội 11 Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1998), “Bước đầu chuyển gen Bar, gusA và, cryIA(c) vào đậu xanh (Vigna radiata L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị tồn quốc lần thứ cơng nghệ sinh học vào lúa, pp.86-87 Tài liệu tiếng anh 12 Adamczyk J J, Mahaffey J.S.(2008), “Efficacy of Vip3A and cryIAb transgenic trait in cotton against various lepidopteran pests”, Fla Entomol, 91(4), pp.570 – 575 13 Balk, P A, De Boer, A D (1999), Rapid stalk elongation in tulip (Tulipa gesneriana L cv Apeldoorn) and the combined action of cold-induced invertase and the water - channel protein gammaTIP Planta 209, 346 - 354 14 Barton MK, Schedl TB and Kimble J 1987 Gain - of - function mutations of fem- 3, a sex-determination gene in Caenorhabditis elegans Genetics, 115, pp 107– 119 15 Becker C, Shutov AD, Nong Van Hai, Senyuk VI, Jung R, Horstmann C, Fischer J, Nielsen NC, Muntz K (1995) Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B - an asparagine - specific endopeptidase Eur J Biochem 228: 456463 16 Berger B R Christie P J (1994) “Genetic complementation analys of the Agrobacterium tumefaciens virB operon: virB2 throught virB11 are essential virulence genes” Bacteriol(176), pp 3646-3660 17 Bergvinson D J, Arnason J T, Mihm J A, and Jewel D C 1997 Phytochemical basis for multiple borer resistance in maize In Insect Resistant Maize: Recent Advances and Utilization Proceedings of an international symposium, 27 November-3 December 1994, Mexico, pp 82-90 18 Birich R.G., (1997), "Plant transformation: problems and strategies for practical application", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol.48: 297-326 19 Brock T.D., Madigan M.T., (1991), “Biology of microorganisms, Prentice-Hall International Editionas”, pp 301-302, pp 663-666 20 Buchanan C.D., Klein P.E., Mullet J.E.(2004), “Phylogenetic analysis of 5’ – noncoding region from the ABA – responsive rab 16/17 gene family of sorghum, maize and rice provides insight into the composition, organization and function of cis – regulatory modules”, Genetíc 168: 1639 – 1654 21 Carlson S J, Chourey P S (1996) Evidence for plasma membrane-associated forms of sucrose synthase in maize Mol Gen Genet 252, 303-310 22 Carlson, S J, Chourey, P.S., Helentjaris T, Datta, R (2002) Gene expression studies on developing kernels of maize synthase (SuSy) mutants show evidence for a third SuSy gene Plant Mol Biol 49, 15-29 23 Chen, Y C Chourey, P.S (1989) Spatial and temporal expression of the two sucrose synthase genes in maize: immunohistilogical evidence Theor Appl Gene 78, 553-559 24 Cheng X, Sardana R, Kaplan H, Altosaar I (1998) Agrobacterium - transformed rice plants expressing synthettic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxin to stript stem borer and yellow stem borer Proc Natl Acad Sci USA 95: 2767-2772 25 Cheng, W H., and Chourey, P S (1999) Genetic evidence that invertase- mediated release of hexoses is critical for appropriate carbon partitioning and normal seed development in maize Theor Appl Genet 98, 485-495 26 Crickmore N., zeigler D.R., Feitelson J., (1998) “Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins” Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, p.p 807-813 27 Datta K., Vasquez A., Tu J., Torrzo L., Alam M.F., Oliva N., Abrigo E., Khush G.S., Datta S.K (1998), “Constitutive and tissue – specific differential expression of the cryIA(b) gene in transgenic rice plants conferring resistance to rice insect pest”, Theor Appl Genet 97: 20 – 30 28 Delisle A.J., Ferl R.J (1990), “Characterization of the Arabidopsis Adh G – box – binding factor”, The plant Cell 2(6): 547 – 557 29 Dively G.P.(2005),”Impact of transgenic vip3A x cryIAb lepidopteran – resistant filed corn on the nontarget arthropod community”, Environ Entomol, 34(5), pp 1267 1291 30 Ellis J.G., Lewellyn D.J., Dennis E.S., Peacock W.J (1987), “Maize Adh – 1promoter sequences control anaerobic regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobacco”, EMBO J6: 11- 16 31 Ferres J., Van Rie J.(2002), “Biachemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis”, Annu Rev Entomol, 47, pp 501- 533 32 Fluhr R., Kuhlemeier C., Nagy F., Chua N.H (1986), “Organ specific and light – induced expression of plant genes”, Science 232: 1106 – 1112 33 Geiser, M., Weck, E., Doring, H P., Werr, W., Courage-Tebbe, U., Tillmann, E., and Starlinger, P (1982) Genomic clones of a wild-type allele and a transposable element-induced mutant allele of the sucrose synthase gene of Zea mays L EMBO J 1, 1455-1460 34 Gustavo A., Cabrera J., (1998b) “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp 1-11 35 Heinlein, M and Starlinger, P (1989) Tissue- and cell-specific expression of the two sucrose synthase isozymes in developing maize kernels Mol Gene Gene 215, 441-446 36 Holtgraewe, D.L., Scholz, A., Altmann, B.And Winter, H (2002) Zeo mays sucrose synthase mRNA, complete cds http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/Nucleotide , last accessed June 15, 2004 37 Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A (1992) “Agrobacterium and plant genetic engineering” Plant Molecular Biology, 19: 15-38 38 Huang, X F., Nguyen-Quoc, B., Chourey, P S., and Yelle, S (1994) Complete nucleotide sequence of the sucrose synthase cDNA of maize GenBank Accession Number L22296 39 Ishida K, Nakayama T and Hara Y 1996 Taxonomic studies on the Chlorarachniophyta II Generic delimitation of the chlorarachniophytes and description of Gymnochlora stellata gen et sp nov and Lotharella gen nov Phycological Research 44(1), pp.37-45 40 Khanna H., Becker D., Kleidon J., Dale J., (2004), “Centrifugation assisted Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana“, Molecular Breeding 14(3): pp 239-252 41 Koch, K.E., Xu, J., Duke, E.R., McCarty, D.R., Yuan, C-X., Tan, B.-C., and Avigne, W.T (1995) Sucrose provides a long distance signal for coarse control of genes affecting its metabolism In: H.G Pontis, G Salerno and E Echeverria (Eds.) Sucrose Metabolism, Biochemistry, Physiology, and Molecular Biology, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, pp 266–277 42 Koch, K E., Wu, Y., and Xu, J (1996) Sugar and metabolic regulation of genes for sucrose metabolism: potential influence of maize sucrose synthase and soluble invertase responses on carbon partitioning and sugar sensing J Exp Bot 47, 11791185 43 Koch, K.E., Zeng, Y Wu, Y., and Avigne, W.T (2000) Multiple paths of sugar- sensing and a sugar/oxygen overlap for genes of sucrose and ethanol metabolism J Exp Bot 51, 417-427 44 Komatsu, A., Moriguchi, T., Koyama, K., Omura, M., and Akihama T (2002) Analysis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships J Exp Bot 53, 61-71 45 Le Thi Thu Hien, Lam Dai Nhan, Kieu Huu Anh, Nong Van Hai, Le Tran Binh (2002), “Construction of Agrobacterium tumefaciens stráin carrying Bt pesticidal genes”, Adv Nat Sci, 32(2),pp.175 – 180 46 Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palerkar N., Chen J.S.(2003), “The mode of action of the Bacillus thuringgenesis vegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of CryIAb delta – endotoxin”, Appl Environ Mỉcobiol, 68 (8), pp.4648 – 4657 47 Lewin B,(2004), Gene VIII, Oxford Univerity Pres, Oxford – New York – Tokyo 48 Maqbool S.B, Riazuddin S, Loc N.T, Gatehouse A.M, Gatehouse J.A., Christou P.(2001), “Expression of multiple ensecticidal genes confers broad resistance against a range of different rice pets”, Mol Breed, 7(1),pp.85 – 93 49 Marana C, Gracia-Olmedo, F, and Carbonero, P (1988) Linked sucrose synthase genes in group - chromosomes in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) Gene 63, 253-260 50 Marana, C, Garcia-Olmedo, F, and Carbonero, P (1990) Differential expression of two types of sucrose synthase - encoding genes in wheat in response to anaerobiosis, cold shock and light Gene 88, 167 - 172 51 McCarty, D R., Shaw, J R., and Hannah, L C (1986) The cloning, genetic mapping, and expression of the constitutive sucrose synthase locus of maize Proc Natl Acad Sci 83, 9099 - 9103 52 McClintock, B (1931) The order of the genes C, Sh and Wx in Zea mays with reference to a cytologically known point in the chromosome Proc Natl Acad Sci USA 17, 485-491 53 McClintock, B (1956) Mutation in maize Carnegie Institute of Washington Yearbook 55, 323 - 332 54 McCormick, S., Mauvais, J., and Fedoroff, N (1982) Evidence that the two sucrose synthetase genes in maize are related Mol Gen Genet 187, 494 - 500 55 Narasimhulu SB, Deng XB, Sarria R, Gelvin SB 1996 Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize Plant Cell 8: pp 873–886 56 Negrotto D, Jolley M, Beer S, Wenck AR, Hansen G 2000 The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation Plant Cell Rep 19: pp 798 – 803 57 Nolte, K D, Hendrix, D L, Radin, J W, and Koch, K E (1995) Sucrose synthase localization during initiation of seed development and trichome differentiation in cotton ovules Plant Physiol 109, 1258-1293 58 Nolte, K.D, and Koch, K E (1993) Companion-cell specific localization of sucrose synthase in zones of phloem loading and unloading Plant Physiol 101, 899-905 59 Ranjekar P.K, Patankar A.,GuptaV., Bhatnagar R., Bentur J., Kumar P.A (2003), “Genetic engineering of crop plants for insect resistance”, Curr Sci, 84 (3),pp 321 – 329Sambrook, J., Fritsch, E F., Maniatis, T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 60 Sambrook J., Fritsch E.F., T.(2001), “ Molecular Cloning: Aladoratar manual” Cold spring Harbor Laboratory Preess, Cold Spring Harbor 61 Shaheuradov I.A,Gammerman A.J., Hancock J.M., Bramley P.M., Solovev V.V (2003).”Plant Prom: adatabase of plant promoter sequence”, Nucleic Acids Research 31 (1): 114 – 117 62 Shaw, J.R., Ferl, R.J., Baier, J., St Clair, D., Carson, C., McCarty, D.R., and Hannah, L.C (1994) Structural features of the maize sus1 gene and protein Plant Physiol 106, 1659 –1665 Sheldon, E., Ferl, R., Fedoroff, N., and Hannah, L C (1983) Isolation and analysis of a genomic clone encoding sucrose synthetase in maize: evidence for two introns in Sh Mol Gen Genet 190, 421 - 426 63 Sturm, A (1999) Invertase Primary structures, functions, and roles in plant development and sucrose partitioning Plant Physiol 121, - 64 Sturm, A., Lienhard, S., Schatt, S., and Hardegger, M (1999) Tissue-specific expression of two genes for sucrose synthase in carrot (Daucus carota L.) Plant Mol Biol 39, 349 - 360 65 Sturm, A., and Tang, G Q (1999) The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development, growth, and carbon partitioning Trends Plant Sci 4, 401 - 407 Shaw, J.R., Ferl, R.J., Baier, J., St Clair, D., Carson, C., McCarty, D.R., and Hannah, L.C (1994) Structural features of the maize sus1 gene and protein Plant Physiol 106, 1659 – 1665 66 Tabashnik B.E, Carriere Y., Dennehy T.J., Morin S., Sisteropn M.S., Roush R.T., Shelton A.M., Shelton A.M., Zhao J.Z (2003)” Insect resistance to trangsgenis Bt crops: Lessons from the laboratory and field”, Econ Entamol, 96 (4), pp 1031 – 1038 67 Trick H.N., Finer J.J., (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacterium - mediates transformation”, Transgenic Res.6, pp 329 - 337 68 Walden R., Koncz C., SchellmJ.(1990), “The use of gene vectors on plant moleculer biology, Methods in Molecular and cellular Biology: 175 – 194 69 Wang, F., Sanz, A., Brenner, M.L., and Smith, A (1993) Sucrose synthase, starch accumulation, and tomato fruit sink strength Plant Physiol 101, 321–327 70 Wang, F., Smith, A G., Brenner, M L (1994a) Isolation and sequencing of tomato fruit sucrose synthase cDNA Plant Physiol 103, 1463-1464 71 Wang, F., Smith, A G., Brenner, M L (1994b) Temporal and spatial expression pattern of sucrose synthase during tomato fruit development 104, 535-540 72 Wang, M B., Boulter, D., and Gatehouse J A (1992) The complete sequence of the rice sucrose synthase-1 (RSus1) gene Plant Mol Biol 19, 881-885 73 Werr, W., Frommer, W B., Maas, C., and Starlinger, P (1985) Structure of the sucrose synthase gene on chromosome of Zea mays L EMBO J 4, 1373-1380 74 Yang, N S and Russell, D (1990) Maize sucrose synthase-1 promoter directs phloem cell-specific expression of Gus gene in transgenic tobacco plants Proc Natl Acad Sci USA 87, 4144 – 4148 75 Zack, C D., Ferl, R J., and Hannah, L C (1986) DNA sequence of a shrunken allele of maize: evidence for visitation by insertional sequences Maydica XXXI -16 PHỤ LỤC 10 20 30 40 50 60 70 80 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN GTCGACGTCAACAGACGCCATGTCAAACAGGAGGAGCCAAAAAAAAAAGACGAGATGATTACGACAAAACATAAATAAAA MZESUS1 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN ATCGGTAAAAACTCTGAAAACCACTTTTGATCGCCCCCGGGGCATACCGCAAAACCAGGTAAAGGATCCGGGTTGGATCC MZESUS1 170 180 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN CGAGTAGATCCACCAGCAAAAGTGGGGGCGCCCGCCCCTTTGCTTCCAACCCACGCAAAAACCCGGATCCGATGAATGAC MZESUS1 250 260 270 280 290 300 310 320 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN CCTCCACCTCCACTTCCTCCTCACGGGCGGTCGCCTCGTCGTACAGACGAACAGAAACAAATGGCAAGCAAAAAATATAC MZESUS1 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN AATACAATACCAACAAAATACCGCGAAAGAATGCTACGGTCACCGGGGTGCATCTGCCGCCAATTCGACAGCCGTGTGTC MZESUS1 410 420 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN TCTTCAAAGCACGGAAAGGCTGCCGGCGGCGGGGGTGGTTTTTTTTCTTGTGTGCAAGCATTAGGGTGCAGGTACCAAAA MZESUS1 490 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN CTGCTGCGCGTCAGAAACCATGGGGTCATCAGCTTTGGCGGATTTTGGAGGCGGTGATGTGCGCTGCCTCTGTTTTCTCA MZESUS1 570 580 590 600 610 620 630 640 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN TGTACGTACCAAGGTCAGAAGGTGACGCGGCGTCAGAACGTGTGCATTTATTTATTATTACAACAGCGATATTACCGTCC MZESUS1 650 660 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN GAATGCCAAATTTATTACTACCGGGAAAAAAAATACCATCCTCGTCGTCTGTTCTACTTCTAGTACGTACGTACGTACAG MZESUS1 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN GGCGCGTCCAAGCTGCTTGTGCTTGAGGACAAAAACTAGTGGTTTTTAGTGGCAGAAAGTTCCCGCTACTTGTCACGCAT MZESUS1 810 820 830 840 850 860 870 880 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN TAAACCTCCGCTGATTTAGGAGTAGAAACCCATTTTTTAAAAATAAGTAAAAAGAGAGAACCAAAATACTCCGCCTCCCC MZESUS1 890 900 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN CCCCCCCCAAGCTGATCATATCCGATCATACCTGTACATGTAAACAAAAAAAATCCATCCGTAAACCGGCATCAGACGAA MZESUS1 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN GAAAGCAAACCCAATGCACTACCAAAAGGAAAGAAAGAAAAAATTCCTAATCTTTCTTATCCCTCACCTACCATTTTTTT MZESUS1 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 | | | | | | | | | | | | | | | | Sus ngo VN AAAAAAATCTAATACTACATGGGCAAGGGACGAAGGTGGTGGGAGCAAAGAGGCCCCCACCCCTGCCCCCGCAATG MZESUS1 cgtg Hình – Phụ lục: So sánh trình tự đoạn Sus1 promoter từ ngơ Q411 với trình tự cơng bố MZESUS1 PHỤ LỤC Hình – Phụ lục: Sơ đồ thiết kế vector pCB301 mang gen Cry1A(c) Sus1 promoter ... dung đề tài - Phân lập Sus1 promoter từ ngô - Thiết kế vector biểu thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter gen cryIA( c) kháng côn trùng - Tạo chủng A.tumefaciens mang Sus1 promoter gen cryIA( c) kháng... biểu gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter gen cryIA( c) 45 3.2.1 Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46 3.2.2 Chuyển kết cấu biểu chứa Sus1 promoter gen cryIA( c) vào... đích phân lập promoter đặc hiệu phloem phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cho ngô, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Phân lập Sus1 promoter từ ngô thiết kế vector biểu chứa Sus1 promoter gen