Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát tính thích nghi của cây hoàng lan [Cananga Odorata (lam.) hook. f. et thomson] tạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại tỉnh Bình Phước

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát tính thích nghi của cây hoàng lan [Cananga Odorata (lam.) hook. f. et thomson] tạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại tỉnh Bình Phước nêu lên kết quả về việc giâm cành hoàng lan, nuôi cấy invitro chồi hoàng lan, sinh trưởng của cây hoàng lan trồng ở thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Trần Thị Thanh Phương

KHẢO SÁT TÍNH THÍCH NGHI CỦA CÂY HOÀNG LAN

[Cananga odorata (Lam.) Hook f et Thomson] TẠO

ĐƯỢC TỪ CÁC KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG KHÁC NHAU

TẠI TỈNH BÌNH PHƯỚC

Chuyên ngành: Sinh Thái Học

Mã số: 60 42 60

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Vương Đình Tuấn

TS Phạm Văn Ngọt

Thành phố Hồ Chí Minh – 2010

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

Thầy Vương Đình Tuấn, thầy Phạm Văn Ngot đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, động viên

và đưa ra những ý kiên quý báu cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện quyển luận văn này

Quý thầy cô khoa sinh học trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp

đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập

Quý thầy cô thuộc bộ môn thực vật trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh

đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Các cô chú, anh chị ở Phân Viện Nghiên cứu Khoa học Lâm Nghiệp Nam Bộ, Đài Khi tượng Thủy văn Nam Bộ, đã cộng tác, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tất cả các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã giúp

đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

H : Chiều cao cây

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole 3-butyric acid

L: Số lượng lá trên cây

MS : Murashige and Skoog’s

NAA : 1-naphthylacetic acid

S : Diện tích lá

TB : Trung bình

WPM : Woody Plant Media

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Hoàng lan (Cananga odorata (Lam.) Hook f & Thomson) hay còn được gọi là Ngọc lan tây, thuộc họ Na (Annonaceae), là một trong các loài thực vật chứa tinh dầu phân bố ở Việt Nam, các nước Đông Nam Á, một số nước Châu Phi và Châu Mỹ Hoa hoàng lan có chứa tinh dầu (ylang-ylang oil) được ưa chuộng trong công nghiệp hương liệu Tinh dầu này từ lâu đã được sử dụng để điều chế nước hoa nổi tiếng Chanel NP

o

P

5 Và là nguyên liệu chính để sản xuất hầu hết các loại nước hoa đắt tiền [18],7 cũng như được dùng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất nước hoa theo phong cách phương Đông [48].7 Tinh dầu hoàng lan có mùi thơm hấp dẫn tạo hương vị đặc biệt nên còn được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống Ngoài ra, nó còn được dùng làm thuốc chữa bệnh cao huyệt áp, chữa chứng nhịp tim nhanh, sốt rét, bệnh đường ruột, viêm gan … [18]

Cây hoàng lan là cây trồng có tiềm năng sinh lợi rất lớn Cây trồng 2 năm tuổi bắt đầu ra hoa, đến 4 – 5 năm tuổi ra hoa rất nhiều và chu kỳ khai thác có thể đến 50 năm Mỗi cây cho khoảng 20kg hoa/năm Một kg tinh dầu hoàng lan có giá trị từ 81 – 97 đô la Mỹ [18] Trên các trang web, 1

lọ 10 ml tinh dầu Ylang Ylang giá khoảng 10 -20USA [49] Cây hoàng lan được trồng với quy mô

lớn ở nhiều nước như : Philippinnes, Indonesia, quần đảo Camoros, Réunion, tỉnh Quảng Đông (Trung Quốc), đảo Madagasca , các nước Châu Phi…, và trở thành cây có tinh dầu đem lại nguồn

lợi đáng kể Ở Indonesia, diện tích trồng hoàng lan lên đến 160.000 ha với sản lượng tinh dầu hàng năm khoảng 120 tấn [18] Tại Việt Nam, cây Hoàng lan thường được trồng rãi rác ở các công viên, trường học, nhà dân để lấy bóng mát hoặc làm cảnh, chưa được tập trung thành diện tích lớn

Nước ta có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của cây hoàng lan, hoàn toàn

có thể trồng với quy mô lớn, nhằm cải thiện thu nhập của người dân Tuy nhiên, hiện những nghiên

cứu về giống, kỹ thuật gieo trồng, kỹ thuật thu hái và chế biến hoàng lan hầu như chưa được nghiên

cứu ở Việt Nam Để góp phần đưa cây hoàng lan – một cây có giá trị kinh tế cao – được trồng rộng rãi ở Việt Nam, đề tài “Khảo sát tính thích nghi của cây hoàng lan [Cananga odorata (Lam.) Hook

f et Thomson] t ạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại Thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước” được tiến hành

2.M ục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây hoàng lan bằng biện pháp nuôi cấy invitro và giâm cành

- Khảo sát tính thích nghi của cây Hoàng lan trên nền đất tỉnh Bình Phước

- So sánh sự sinh trưởng của cây giống tạo từ hạt và cành giâm sau giai đoạn vườn ươm

3.N ội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính hoàng lan bằng giâm cành và nuôi cấy invitro:

o Giâm cành hoàng lan : Sử dụng hóa chất kích thích là IBA và thuốc thương phẩm

o Nuôi cấy invitro hoàng lan : Khảo sát khử trùng chồi, tạo chồi, vươn chồi và tạo rễ

- Theo dõi sinh trưởng của cây hoàng lan tạo từ hạt và cành giâm trồng ở huyện Bình Long,

- So sánh sự sinh trưởng của cây hoàng lan tạo từ hạt và cành giâm trồng tại huyện Bình long,

tỉnh Bình Phước trong 4 tháng

5.Th ời gian tiến hành thí nghiệm

Từ tháng 06/2009 đến tháng 9/2010

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.M ột số đặc điểm sinh học, sinh thái của Hoàng lan

Cây hoàng lan có vị trí phân loại như sau:

Kingdom (Giới) : 0Plantae0

Subkingdom (Phân giới) : 0Tracheobionta0

Superdivision (Siêu ngành) : 0Spermatophyta0

Genus (Giống /Chi) : Cananga (DC.) Hook f et Thomson

Species (Loài) : Cananga odorata (Lam.) Hook f et Thomson [50]

B ảng 1 Tên gọi cây hoàng lan ở các quốc gia trên thế giới

pwurenwai, seir en wai [51]

Đặc điểm sinh học : Cây gỗ cao 10 - 15m, đường kính 30 - 50cm Thân tròn, cành thường

đâm ngang, dễ gãy Vỏ màu xám tro nhạt, nhẵn Gỗ màu vàng nhạt, mềm Tán lá hình trụ Lá đơn

mọc cách, xếp thành hai hàng trên một cành nhỏ, dể rụng Phiến lá mềm, mỏng; hình trái xoan hay hình trứng, hơi lệch, hơi gợn sóng; gốc lá tròn, đầu thuôn; hai mặt nhẵn dài 15 - 20cm

3

Cây hoàng lan ra hoa quanh năm Hoa có màu vàng hay vàng lục, mọc thành từng cụm trên

những nhánh ngắn không có lá; cánh hoa dài, hình tam giác Cánh tràng 6 xếp thành hai vòng, dài

và lượn sóng, đầu thuôn hẹp, thường cuộn ra phía ngoài Nhị đực nhiều, bao phấn hướng trong, trung đới hình nón, lá noãn 8 - 10, vòi dài, dầu nhụy có lông tơ Khi còn non, hoa có màu xanh, khi chín hoa có màu vàng Quả còn non màu xanh, hình trứng ngược, kích cỡ 15 – 25mm x 8 – 10mm,

nhẵn, không có lông, vỏ quả dày khoảng 2mm Mỗi quả có 10 -12 hạt, dẹt [1]3

Hình 1 Cây và qu ả hoàng lan ở Giồng trôm – Bến Tre

Đặc điểm sinh thái : Cây ưa sáng, mọc nhanh, 3phát triển mạnh mẽ ở miền cận nhiệt đới, nơi

có lượng mưa hàng năm khoảng (650-)1500-2000(-4000) mm và nhiệt độ trung bình hàng năm từ 21-27P

0

P

C Ở Java, hoàng lan sinh trưởng thành cụm ở rừng mưa ẩm thường xanh và ở rừng tếch Còn

ở New Guinea, nó mọc ở độ cao 850m [52]

(p-[53]

Giá tr ị : Gỗ hoàng lan nhẹ, màu vàng nhạt, thớ mịn, dùng để tiện khắc, làm văn phòng phẩm,

dễ gia công chế biến, nhưng kém chịu đựng, dễ nứt nẻ, mối mọt, chủ yếu làm củi Hoa rất thơm và

chứa tinh dầu (ylang –ylang oil), được dùng để sản xuất nước hoa theo phong cách phương Đông, đặc biệt là nước hoa nổi tiếng Chanel NP

o

P

5 Mùi hoàng lan được pha trôn khá tốt với mùi cây cỏ, hoa

quả và gỗ, để dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống Tinh dầu hoàng lan tạo cho

cơ thể một cảm giác thoải mái, tâm trí thanh thản và được coi là một loại thuốc làm dịu đi sự mệt

mỏi của cơ thể Tinh dầu này giúp điều tiết các chất bã nhờn ở da, làm giảm huyết áp, làm giảm sự căng cơ, và có tác dụng kích thích hung phấn tình dục, dùng chữa chứng nhịp tim nhanh, bệnh sốt rét, bệnh đường ruột, viêm gan…[18]

1.2.Tình hình nghiên c ứu cây hoàng lan trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1.Trên th ế giới

Thông tin đầu tiên về Hoàng lan được biết từ John Ray (1628-1705), nhà phân loại học người

Anh, đã mô tả cây với tên Arbor saguisen Hoàng lan cũng đã được ghi chép lại bởi nhiều nhà khoa

học khác với các tên như Borga cananga, Unona odorata

Theo Oyen và cộng sự (1999) thì cây hoàng lan ưa điều kiện nóng ẩm ở các khu vực thấp trong vùng nhiệt đới, với nhiệt độ trung bình năm 21 – 27P

o

P

C, lượng mưa hàng năm khoảng 1500 – 2000mm Cây sinh trưởng tốt trên các vùng đất màu mỡ, đất nham thạch, quang đãng, nhiều ánh sáng, đất hơi chua đến hơi kiềm (pH : 4,5 – 8)

Manner và Elevitch (2006) đã miêu tả đặc điểm hình thái, phân bố, công dụng của cây Hoàng lan Cây hoàng lan sinh trưởng nhanh khi gặp điều kiện thuận lợi và có thể đạt 2m trong 1 năm Cây thường phân bố ở những vùng đất thấp hoặc rừng tái sinh có độ cao 800 – 1200m so với mực nước

biển Những vùng này thường có lượng mưa lớn bình quân 700 – 5000mm/năm và có nhiều ánh sáng Độ pH thích hợp cho cây thường trung tính hơi ngả acid yếu Đất nhiễm mặn với nộng độ

muối cao không phù hợp cho trồng hoàng lan Cây có thể chịu được nhiệt độ thấp nhất từ 10 – 18P

o

P

C, nhiệt độ cao nhất là 28 – 35P

Hoàng lan được nhân giống chủ yếu bằng hạt Hạt được gieo trong các túi bầu đất đến khi có 6 – 10 lá thì đem trồng ra đất Mật độ trồng hoàng lan thường là 6 x 6m [57] Tuy nhiên, ở đảo Pohnpei thuộc liên bang Micronesia (đảo quốc ở Thái Bình Dương) người ta trồng hoàng lan với

mật độ 4 x 4m [18]

Hoang và cộng sự (1986) thuộc Đại học Philippines đã nghiên cứu nhân giống ilang-ilang

[Cananga odorata (Lamk.) Hook.f và Thomson] bằng hạt và giâm cành Kết quả khi nghiên cứu

nảy mầm cho thấy, ngâm hạt trong nước ấm 60P

Molabayabas và cộng sự (1995), cũng thuộc trường đại học Philipines, đã thực hiện nuôi cấy

invitro ilang-ilang từ chồi ngọn cây con Mẫu cấy được rửa, sau đó vô trùng bằng NaOCl với nồng

độ 0,3% Các nghiệm thức được cho là môi trường thích hợp cho sự hình thành mô sẹo, được thực

hiện trên môi trường MS hoặc WPM chứa 1 – 2mg/l BAP kết hợp 0,1 – 0,5mg/l NAA Sự biệt hóa

số lượng lớn chồi và mầm được ghi nhận trong môi trường MS chứa 2mg/l BAP với NAA từ 0,1 – 0,2mg/l Mầm chồi đã biệt hóa sinh trưởng bình thường khi được cấy trên môi trường WPM có BAP riêng rẽ hoặc kết hợp với 0,1mg/l và 0,5 mg/l NAA; trong khi trên môi trường MS thì tạo ra

những dạng không bình thường Trong môi trường WPM và MS có bổ sung kinetin hoặc NAA riêng rẽ thì ít có hoặc không có tác dụng lên sự hình thành mô sẹo và chồi Tuy nhiên, nếu bổ sung 15% nước dừa vào môi trường WPM và BAP từ 1 – 10mg/l, ghi nhận thúc đẩy tạo sẹo, làm giảm sự

hình thành chồi Chồi đã được biệt hóa sinh trưởng bình thường khi được cấy chuyền sang môi trường WPM có 2mg/l BAP, trong khi đó, trên môi trường MS có cùng chất điều hòa sinh trưởng, các chồi này hình thành nên những kết cấu giống protocorn trên bề mặt lá Môi trường WPM có

hiệu quả hơn môi trường MS trong sự cảm ứng tạo rễ Sự hình thành nhiều rễ và tốt hơn trên môi trường WPM có 0,5mg/l IBA Cây con tái sinh từ mô sẹo chồi ngọn có thể sinh trưởng dưới điều

kiện bình thường [60]

Năm 2008, một số nhà khoa học của Philippine, như Lindain, Reglos, Guzman và Cedo, đã

thực hiện nuôi cấy invitro hoàng lan, đồng thời, khảo sát lượng sản phẩm tinh dầu trong mô sẹo tạo

được từ cánh hoa Tác giả sử dụng các nguồn vật liệu khác nhau (chồi ngọn, chồi nách, lá non, noãn

và cánh hoa) nhằm khảo sát khả năng biệt hóa chồi thông qua mô sẹo ( con đường gián tiếp) Khử trùng mẫu cấy bằng 3 chất khử trùng : alcohol 70%, thuốc diệt nấm và NaOCl Nhúng nhanh mẫu

cấy vào alcohol 70%, hoặc thời gian tối đa là 30s, sau đó chuyển qua lắc trong thuốc diệt nấm trong

20 phút với các nồng độ khác nhau đối với từng nguồn vật liệu khác nhau Cuối cùng là sử dụng NaOCl với nồng độ khác nhau nhưng ở khoảng thời gian là 10 phút Cảm ứng tạo mô sẹo mẫu cấy

đã vô trùng trong môi trường có BA 2mg/l kết hợp với NAA 0,2 mg/l, cho tỉ lệ mô sẹo tốt và mô

sẹo này có khả năng cho ra chồi Tuy nhiên với mỗi loại vật liệu khác nhau thì màu sắc mô sẹo, tốc

độ tăng trưởng của mô sẹo có khác nhau Mô sẹo được tạo từ cánh hoa cho ra muộn hơn so với các nguồn vật liệu khác Mô sẹo từ bầu nhụy cái cho sự tăng trưởng nhanh nhất, trong khi mô sẹo từ

chồi ngọn và chồi nách thì chậm nhất Mầm chồi được tạo từ mô sẹo chồi ngọn, chồi nách và lá sau

15 – 16 tuần cấy chuyển trên môi trường MS có 0,2mg/l NAA +2mg/l BAP Các mầm này được vươn cao trên môi trường WPM có 2mg/l BAP Trong khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên sự

tạo mô sẹo và biệt hóa chồi thì WPM tạo được ưu thế hơn do ti lệ hóa nâu thấp, tỉ lệ tạo chồi cao, tỉ

lệ cây bị thủy tinh hóa thấp, điều này có thể là do nồng độ của Nitrate trong WPM thấp hơn trong

MS Tái sinh rễ được tạo trên môi trường ½ WPM có 0,5mg/l IBA [56]

1.2.2 Ở Việt Nam

Một số tài liệu miêu tả về hình thái, đặc điểm phân bố, đặc điểm sinh học về cây hoàng lan của

Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi, Trần Hợp mang tính đại cương Việc nghiên cứu nhân giống và khảo sát sinh trưởng cây hoàng lan hiện còn khá mới

Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2002) đã khảo sát quá trình phát triển, già chín và nảy mầm ở Hoàng lan [6] Trương Mai Hồng và cộng sự (2004) đã nghiên cứu sự phát triển và già chin của hạt

hoàng lan (Cananga odorata (Lamk.) Hook.f et Thoms) từ cây hoàng lan 10 tuổi, được trồng ở trường Đại học Nông lâm Tp Hồ Chí Minh, cho biết : Hạt hoàng lan là loại hạt tỏ ra khó nảy mầm,

hạt có miên trạng đáng kể Khi thu hoạch hạt từ những quả già chín (84 ngày sau hoa nở) gieo ngay trên giấy thấm thì có 1% hạt nảy mầm; thu hạt từ quả chín nâu đen (98 ngày sau hoa nở, ẩm độ hạt 25%) gieo ngay trên giấy thấm thì tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 17% Khi rút khô độ ẩm hạt còn 10%, 7,4% và 4,7% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng tương ứng là 26%, 31% và 51% Khi phơi nắng hạt trong 3 ngày thì tỷ lệ nảy mầm là 27% Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt hoàng lan không có bản

chất tồn trữ chính thống (ưa khô).[19]

Phạm Văn Ngọt và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu khả năng nảy mầm và sinh trưởng

của cây hoàng lan trồng ở huyện Giồng Trôm - Bến Tre, đã cho thấy, hạt hoàng lan ngâm trong dung dịch GA3 (0,3 – 0,7ppm) trong 1 giờ cho tỷ lệ nẩy mầm trên 47% cao hơn so với đối chứng

chỉ có 42,67% Sinh trưởng của cây con ở giai đoạn vườn ươm ở các chế độ bón phân N,P,K khác nhau, đã ghi nhận tỷ lệ sống của cây hoàng lan con sau 5 tháng ở các nghiệm thức bón nitơ và phosphor là 100%, ở nghiệm thức bón kali nồng độ 1,5% là 77.8%, nồng độ 2% là 60% Sinh trưởng của cây con ở các nồng độ nitơ khác nhau đều tốt hơn so với đối chứng, và tốt nhất ở nồng

độ 2% Ở nồng độ 3% và 4% PR 2 ROR 5 R, cây sinh trưởng tốt hơn các nghiệm thức còn lại Bón phân kali

tỏ ra không hiệu quả đối với sự sinh trưởng của cây Quan sát sinh trưởng của cây con hoàng lan

trồng ở huyện Giồng Trôm - Bến Tre, cho thấy cây con có 6 – 7 lá ươm trong túi bầu sau 1 năm

trồng có chiều cao 221,77 – 250,67cm, đường kính thân đạt 4,90 – 6,29cm Cây hoàng lan trồng thuần loại sinh trưởng tốt hơn cây trồng xen với chuối và vườn dừa Hoàng lan trồng xen trong vườn

dừa ở giai đoạn 1 năm có sinh trưởng kém nhất Sau 1 năm tiến hành cắt ngọn, các cây hoàng lan

trồng thuần loại sinh trưởng tốt nhất, có đường kính thân cây từ 9,24 – 9,54cm Những cây trồng trong vườn dừa có đường kính thân cây từ 8,22 – 8,62cm không thua kém những cây hoàng lan

trồng xen với chuối Sau 1,5 năm trồng, cây hoàng lan bắt đầu ra hoa [18]

1.3.Nghiên c ứu về giâm cành

Mọi tế bào thực vật sống đều có khả năng tái tạo lại một cây hoàn chỉnh Khả năng này phụ thuộc vào hai đặc tính cơ bản của tế bào thực vật đó là tính toàn thể (totipotency) và sự phản biệt hóa (dedifferentiation) Trong nhân giống bằng giâm cành, chỉ cần điều khiển sự hình thành rễ mới (rễ bất định), vì chồi đã có sẵn

Các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình này như : tình trạng sinh lý của cây mẹ, tuổi của cành giâm, vị trí cành giâm (chồi ngọn, chồi bên), điều kiện môi trường (nước, nhiệt độ, ánh sáng …) Cành mẹ mang các dưỡng chất (các glucids, khoáng chất…) ảnh hưởng đến sự ra rễ của cành giâm Cành giâm lấy ở giai đoạn trẻ dễ tái sinh hơn cây đã ở pha sinh trưởng già Từ gốc đến chồi ngọn 1 cây hay 1 cành có sự phân bố các thành phần hóa học khác nhau, nên phản ứng ra rễ khác nhau Để tránh cho cành mẹ bị stress nước, nên lấy hom vào buổi sáng khi cây ở trạng thái trương nước

Một số chất điều hoà sinh trưởng tỏ ra có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh rễ bất định Trong số đó, auxin có tác dụng nhất đến sự ra rễ của cành giâm

- Auxin: Vào những năm 30 và sau đó, người ta phát hiện ra chất auxin, là một hợp chất có tác

dụng kích thích sinh trưởng của thân, thúc đẩy sự hình thành rễ, như:

o Acid indol acetic (IAA) là auxin có bản chất tự nhiên, có tác dụng thúc đẩy hình thành

Ứng dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong giâm cành : Để xúc tiến sự hình thành rễ

bất định, việc xử lý các chất điều hoà sinh trưởng là cần thiết Các nhóm chất auxin có tác dụng kích thích sự ra rễ rất rõ rệt Xử lý hỗn hợp các chất ra rễ tỏ ra có tác dung cao hơn xử lý riêng

rẽ Thí dụ, hỗn hợp IBA và α-NAA có tỷ lệ 1/1 tỏ ra có hiệu quả tạo rễ rất rộng rãi cho nhiều loài cây và cao hơn so với việc sử dụng riêng rẽ từng chất [34]

1.4.Nghiên cứu về nuôi cấy invitro

Chồi ngọn sau khi vô trùng, được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi Sau đó, chồi tiếp tục phát triển vươn cao, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất để sinh trưởng phát triển bình thường [12]

Theo Lindain và các cộng sự (2008) đã nuôi cấy in-vitro Ilang-Ilang để xác định phản ứng của

những mẫu cấy khác nhau (chồi ngọn, chồi nách, lá non bầu noãn và cánh hoa) với 2 loại môi trường MS (Murashige và Skoog), WPM (Woody Plant Medium) Mô sẹo từ chồi ngọn, chồi nách

và lá non có khả năng biệt hóa tạo chồi Với hai nguồn vật liệu còn lại thì không cho chồi mặc dù cùng trong điều kiện nuôi cấy như nhau Điều này chứng tỏ nguồn gốc vật liệu đóng vai trò quan

trọng trong tái sinh [56]

M ột số chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng trong nuôi cấy invitro Các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật là những thành phần môi trường có tính quyết định trong sự xác định con đường phát triển của các tế bào thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật phổ biến nhất là các hormone thực vật hay các chất tổng hợp có chức năng tương tự của chúng Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật chính được sử dụng trong nuôi cấy, là:

- Auxin : Hoạt hoá phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ.[8] Tất cả cây trồng đều tổng hợp được auxin tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng Auxins tự nhiên quan trọng nhất là IAA (indole-3-acetic acid), nhưng nó được sử dụng hạn chế vì nó dễ bị phân hủy bởi nhiệt và ánh sáng Một số loại auxin tổng hợp khác như: 2,4D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), IBA (Indole 3-butyric acid), NAA (1-naphthylacetic acid), …

- Cytokinin : Kích thích mạnh lên sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin còn giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non, nhưng lại ức chế sự tạo rễ [17] Sự sinh tổng hợp cytokinin trong cây xảy ra ở những vùng khác nhau, đặc biệt là những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân ngọn rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái

và trong rễ, tuy nhiên rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất [12]

- Gibberellin : Kích thích phân chia tế bào, mô vỏ và biểu bì Nhóm chất này kích thích sự kéo dài lóng, vùa do sự kéo dài, vùa do sự phân chia tế bào thân Gibberellin liều cao (hay phối

hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá.[ 8]

1.5 Đặc điểm tự nhiên tỉnh Bình Phước

8

Bình Phước là một tỉnh miền núi ở phía Tây của vùng Đông Nam Bộ, phía Đông giáp tỉnh Lâm Đồng và Đồng Nai, phía Tây giáp tỉnh Tây Ninh và Campuchia, phía Nam giáp tỉnh Bình Dương và phía Bắc tỉnh Đắk Lắk và Campuchia

8

Thí nghiệm khảo sát tính thích nghi và sinh trưởng của các cây tạo từ hạt và giâm cành được

thực hiện tại Bình Long Địa danh này là một trong những thị xã thuộc tỉnh Bình Phước, cách Đồng Xoài khoảng 40km, về phía đông Nơi này mang những đặc điểm tự nhiên và khí hậu của tỉnh Bình Phước

của tỉnh

Lượng mưa bình quân hàng năm biến động từ 2045 - 2325 mm Mùa mưa diễn ra từ tháng 5 -

11, chiếm 85-90% tổng lượng mưa cả năm, tháng có lượng mưa lớn nhất 376mm (tháng 7) Mùa khô từ cuối tháng 11 đến đầu tháng 5 năm sau, lượng mưa chỉ chiếm 10 - 15% tổng lượng mưa cả năm, tháng có lượng mưa ít nhất là tháng 2,3 Lượng bốc hơi hàng năm khá cao từ 1113 - 1447mm

Thời gian kéo dài quá trình bốc hơi lớn nhất vào tháng 2,3,4

Hình 2 B ản đồ hành chính tỉnh Bình Phước

Do chế độ mưa theo mùa nên biên độ giao động về độ ẩm không khí giữa mùa mưa và mùa khô khá lớn Độ ẩm trung bình hàng năm từ 80,8 - 81,4% Bình quân năm thấp nhất là 45,6 - 53,2%, tháng có độ ẩm cao nhất là 88,2%, tháng có độ ẩm thấp nhất là 16%

8

Các điều kiện tự nhiên và khí hậu của tỉnh Bình Phước phù hợp với đặc điểm sinh thái của cây hoàng lan

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.V ật liệu

2.1.1.V ật liệu trong thí nghiệm giâm cành

Cành giâm (hom) là các cành tay (cành cấp 1) và thân hoàng lan được lấy từ các cây 5 – 6 tháng tuổi đặt trong vườn trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

Giá thể để cắm hom là cát sạch Nhà giâm hom được che sáng bằng lưới đen, cường độ sáng còn 40 – 50% Trên luống giâm có khung chụp nilon trắng để giữ ẩm Các chất điều hoà sinh trưởng được dùng là: IBA, IAA, 2.4D, và thuốc kích thích ra rễ thương phẩm: OXYBERON Dust 0.5 (Nhật) và N3M (Việt Nam) Và một số dụng cụ khác như : kéo cắt cành, dụng cụ chăm sóc vườn ươm, …

2.1.2.Vật liệu trong thí nghiệm nuôi cấy invitro

Vật liệu dùng trong nuôi cấy mô Hoàng lan là : Chồi ngọn và chồi nách lấy từ các cây 1 năm

tuổi mang từ huyện Giồng Trôm – Bến Tre, đặt trong vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ

Các hóa chất được sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy chồi hoàng lan như: các hóa chất

khử trùng (Javel, HgClR 2 R), các chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA, NAA, GA3), các hóa chất để pha môi trường nuôi cấy (xuất xứ từ các hãng hóa chất như: Prolab, Himedia, Merck, Sigma…) Và một

số dụng cụ khác: tủ cấy, ống nghiệm, bình tam giác,

Môi trường được dùng trong các thí nghiệm là WPM (Wood Plant Media), được chuẩn pH về

từ 5,7 – 5,8

Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ

2.1.3.V ật liệu trong thí nghiệm khảo sát sinh trưởng

Cây con được trồng để theo dõi sinh trưởng là những cây đã nảy mầm từ hạt (cây từ hạt) và cây được tạo ra từ giâm cành (cây giâm cành)

Cây giâm cành là các cành giâm đã ra rễ được trồng vào các túi bầu đất, được tưới nước 2 lần/ ngày Cây ra ngôi được 3 tháng được mang trồng ra đất, tiếp tục khảo sát sinh trưởng, để đánh giá tính thích nghi của những cây này

Tiến hành gieo hạt hoàng lan : Hạt được lấy từ các quả chín tại huyện Giồng Trôm – Bến Tre

Các hạt được chọn đem gieo là những hạt chắc, không bị sâu bệnh Trong lá mầm và phôi hạt Hoàng lan có nhiều dầu nên sau khi thu hoạch, loại bỏ các hạt lép, hong khô trong nắng nhẹ hoặc ở nơi mát mẻ rồi đem gieo ngay.[16]

Đặt các hạt vào trong các đĩa Petri có giấy

thấm đã tưới ẩm, 2 – 3 ngày tưới nước và thay giấy

thấm cho đến khi các hạt nẩy mầm Sau đó, chuyển các hạt đã nảy mầm sang các túi bầu đựng đất, được đục lỗ xung quanh đáy, tưới nước 2 lần/ngày vào

buổi sáng và chiều Cây con mọc được 3 – 4 tháng, đem trồng ra đất để khảo sát sự sinh trưởng đối

chứng với các cây có từ giâm cành Thời gian tiến hành: tháng 05/2009 Địa điểm thực hiện: vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam

Bộ

2.2 Phương pháp tiến hành

2.2.1.Nhân gi ống vô tính hoàng lan

Chất điều hoà sinh trưởng chính dùng trong các nghiệm thức ra rễ là IBA, được pha ở các mức

từ 50 – 1000ppm Bên cạnh đó, tiến hành các nghiệm thức ra rễ có sự phối hợp giữa IBA và các

chất kích thích sinh trưởng khác Đồng thời, thực hiện nghiệm thức đối chứng bằng nước lã Các thuốc kích thích ra rễ được pha theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất in trên vỏ bao bì

Hình 3 Gieo h ạt hoàng lan

2.2.1.1.2.B ố trí thí nghiệm

Các nghiệm thức ra rễ thực hiện trong giâm cành hoàng lan được thể hiện ở bảng 2

B ảng 2 Các nghiệm thức giâm hom hoàng lan

STT Nghiệm thức lượng Số

mẫu

Số lần lặp Tổng

Địa điểm thực hiện: Vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ Thời gian thực hiện từ : 06/ 2009

Các chỉ tiêu theo dõi :

- Thời gian ra rễ trung bình của cành giâm ở mỗi nghiệm thức (tuần)

%𝑠ố𝑛𝑔 𝑐ủ𝑎 𝑐á𝑐 𝑐à𝑛ℎ 𝑔𝑖â𝑚 =𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐à𝑛ℎ 𝑚𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑖â𝑚𝑆ố 𝑐à𝑛ℎ 𝑔𝑖â𝑚 𝑠ố𝑛𝑔 × 100

%𝑟𝑎 𝑟ễ 𝑐ủ𝑎 𝑐á𝑐 𝑐à𝑛ℎ 𝑔𝑖â𝑚 =𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐à𝑛ℎ 𝑚𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑖â𝑚𝑆ố 𝑐à𝑛ℎ 𝑔𝑖â𝑚 𝑟𝑎 𝑟ễ × 100

- Số lượng rễ chính trung bình/cành giâm ở mỗi nghiệm thức : Đếm tất cả rễ của các cành giâm ra rễ ở mỗi nghiệm thức, tính tổng số rễ rồi chia cho tổng số cành giâm ra rễ

- Chiều dài rễ trung bình một rễ (cm): Đo chiều dài của từng rễ ở mỗi cành giâm trong từng nghiệm thức, tính tổng các chiều dài rồi chia cho tổng số lượng rễ của các cành giâm trong nghiệm thức đó

2.2.1.2 Phương pháp nuôi cấy mô hoàng lan

2.2.1.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Các chồi dài khoảng 0.5cm không bị sâu, bệnh được chọn, đem rửa sạch, lắc trong dung dịch

xà phòng 10 – 15 phút, tráng qua nhiều lần bằng nước máy trước khi được vô trùng bên trong tủ

cấy Vô trùng mẫu cấy bằng cồn 70P

o

P

, lắc trong 5 – 10 giây, tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần

Tiếp tục cho các mẫu vào các dung dịch hóa chất khử trùng (Javel – Natri hypochlorite, HgClR 2 R) ở các nồng độ khác nhau,có bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween, lắc trong thời gian khác nhau, sau đó, tráng lại 3 lần bằng nước cất Các nghiệm thức của thí nghiệm được thiết lập và trình bày ở bảng 3

B ảng 3 Các nghiệm thức khử trùng mẫu cấy trong nuôi cấy invitro hoàng lan

Thời gian theo dõi mẫu cấy sau khi khử trùng : 2 – 3 tuần Các chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu vô trùng (%): được tính theo công thức

%𝑚ẫ𝑢 𝑣ô 𝑡𝑟ù𝑛𝑔 =𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑣ô 𝑡𝑟ù𝑛𝑔𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 × 100

- Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%): được tính theo công thức

%𝑚ẫ𝑢 𝑠ố𝑛𝑔 =𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑠ố𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎử 𝑡𝑟ù𝑛𝑔𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 × 100

2.2.1.2.2 Phương pháp tạo chồi

Các mẫu vô trùng được cấy vào môi trường có BA, BA phối hợp với NAA với nồng độ khác nhau, nhằm kích thích tạo chồi Thí nghiệm này được bố trí thông qua bảng 4

B ảng 4 Các nghiệm thức tạo chồi trong nuôi cấy invitro hoàng lan

Thời gian theo dõi sự hình thành chồi, cụm chồi : 4 tuần

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi, tính theo công thức

%𝑚ẫ𝑢 𝑡ạ𝑜 𝑐ℎồ𝑖 =𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑡ạ𝑜 𝑐ℎồ𝑖𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 × 100

- Số chồi trung bình/chồi, tính theo công thức

𝑆ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ/𝑚ẫ𝑢 =𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑐á𝑐 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑡ạ𝑜 𝑐ℎồ𝑖𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐ấ𝑦 𝑡ạ𝑜 𝑐ℎồ𝑖

2.2.1.2.3 Phương pháp vươn chồi hoàng lan

Chồi hình thành được cấy chuyền vào môi trường vươn chồi Môi trường WPM có GAR 3 Rở các

nồng độ khác nhau được sử dụng, có phối hợp với BA Các nghiệm thức được bố trí ở bảng 5

B ảng 5 Các nghiệm thức vươn chồi trong nuôi cấy invitro hoàng lan

∆h : Kích thước tăng trưởng của chồi (cm)

hR 1 R : chiều cao chồi ban đầu (cm)

hR 2 R : chiều cao chồi lúc sau (cm)

2.2.1.2.4 Phương pháp tạo rễ

Các chồi có chiều cao khoảng 2cm được chọn để tạo rễ Chồi được cắt khỏi cụm chồi và ngâm

10 phút trong dung dịch IBA (5ppm và 10ppm) đã vô trùng, trước khi cấy vào môi trường WPM và

½ WPM

Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo rễ được thể hiện ở bảng 6

B ảng 6 Các nghiệm thức tạo rễ trong nuôi cấy invitro hoàng lan

6 10ppm IBA 20 3 60

Thời gian theo dõi: 4 tuần Các chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ (%) chồi tạo rễ, được tính theo công thức

𝑇ỷ 𝑙ệ (%)𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑡ạ𝑜 𝑟ễ = 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑡ạ𝑜 𝑟ễ

- Số rễ trung bình/mẫu, được tính theo công thức

𝑆ố 𝑟ễ 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔𝑏ì𝑛ℎ/𝑚ẫ𝑢 = 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑟𝑎 𝑟ễ𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑟ễ

2.2.2.Kh ảo sát sự sinh trưởng của cây Hoàng lan có từ hạt và giâm cành tại Bình Phước

Những cây con đem trồng để khảo sát sinh trưởng là những cây được tạo từ hạt và cây từ thí nghiệm giâm cành Các cây này đã được đưa ra bầu đất 3 – 4 tháng, tương đối đồng đều nhau về đường kính thân, chiều cao cây, số cành cấp I, số lá và diện tích lá

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố 3 lần lặp Trong đó, nền lập địa trồng cây là như nhau Các yếu tố khác tương đối đồng đều như: cây con, mật độ, kỹ thuật tác động, chăm sóc

Yếu tố lặp: cây con từ hạt và cây con từ giâm cành

Các hố trồng cây không được bón lót, có chiều sâu khoảng 0,5m và chiều rộng hố 0,3m Mật

Trong những tháng mùa khô (tháng 05 và 06/2010), chúng tôi tưới nước cho cây 2 lần/ngày vào buổi sáng và buổi chiều, mỗi lần 1000ml nước Số liệu sinh trưởng được thu thập 1 lần/tháng,

đo tất cả các cây sau đó tính trung bình theo từng công thức, từng lần lặp

Địa điểm thực hiện: vườn tại thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước Thời gian tiến hành và khảo sát: từ tháng 04 – 09/2010

Đo chiều cao trung bình cây H (cm) : Dùng thước cây đo từ gốc sát mặt đất đến đỉnh ngọn

cây, một tháng 1 lần

Tăng trưởng chiều cao cây : Δh (cm) = HRn+1R – HRnR

HRnR: Chiều cao cây đo lần thứ n

HRn+1R: Chiều cao cây đo lần thứ n+1

Đo đường kính trung bình thân cây D (mm): Dùng thước kẹp để đo ở vị trí kế dưới 2 lá đầu

tiên trong suốt quá trình thí nghiệm

Tăng trưởng đường kính thân: Δd = DRn+1R – DRnR

DRnR: Đường kính thân cây đo lần thứ n

DRn+1R: Đường kính thân cây đo lần thứ n+1

Đếm tất cả số lá có trên cây vào mỗi tháng, cùng ngày với đo chiều cao và đường kính thân cây Tính số lá trung bình qua mỗi tháng để tính được sự tăng trưởng số lá trung bình qua mỗi

tháng Tăng trưởng số lá trung bình (ΔL): ΔL = LRn+1R – LRnR

𝐷𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ 1 𝑙á (𝑐𝑚2) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑑𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 27 𝑙á (𝑐𝑚27 2)

𝑆(𝑑𝑚2) = 𝐷𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ 1 𝑙á × 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑙á 9 𝑐â𝑦9 × 100

Thống kê số cành cấp I có trên cây cùng ngày với đo chiều cao và đường kính thân, đếm tất cả các cành cấp I của tất cả các cây theo mỗi lần lặp, từ đó tính số cành cấp I trung bình /cây ở mỗi tháng và tính tăng trưởng số cành cấp I/cây Tăng trưởng số cành cấp I : ∆C = CR n+1 R - CR n

CR n R : Số cành cấp I trung bình/cây đo lần thứ n

CR n+1 R : Số cành cấp I trung bình/cây đo lần thứ n+1

Lấy mẫu đất của 3 lô ở tầng 0 – 80cm tại khu vực trồng cây, đem phân tích thành phần cơ giới

và thành phần hóa học tại Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ

Dùng máy ANNA F11 để đo cường độ ánh sáng ở mỗi lô thí nghiệm Đo ở vị trí trồng cây cách mặt đất 1m, đặt máy hướng về phía đông và đo cường độ ánh sáng

Tính các giá trị trung bình 𝑋, 𝑌 Xét tỉ số t = 𝑋−𝑌

𝑆�𝑛1+𝑚1 , nếu t > 1,96 thì 𝑋 > 𝑌 với độ tin cậy 95%

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.K ết quả giâm cành hoàng lan

Sự hình thành một cá thể mới trong quá trình giâm cành phụ thuộc vào đặc tính của giống và điều kiện ngoại cảnh, trong đó điều kiện thời tiết khí hậu giữ một vai trò quan trọng Các thí nghiệm giâm cành đoạn cành và đoạn thân hoàng lan được thực hiện từ tháng 11/2009 – 08/2010, thời tiết chuyển từ mùa mưa sang mùa khô, nhiệt độ tăng dần qua các tháng, biên độ nhiệt dao động trong 1 ngày khá lớn

3.1.1.T ỷ lệ sống

Sức sống của cành đã giảm đi khi bị tách khỏi cây mẹ, đồng thời, tác động của ngoại cảnh, chủ

yếu là điều kiện khí hậu, cùng với ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng, cành giâm sau khi được

cắt rời cây mẹ, góp phần làm giảm sức sống của hom giâm Trong nghiên cứu này, với điều kiện chăm sóc ổn định, tỷ lệ sống của cành giâm từ cành tay và thân cây hoàng lan đã được ghi nhận

Qua các thí nghiệm tiến hành giâm cành trên cành tay hoàng lan ở 3 vị trí ngọn cành (đoạn 1), dưới ngọn (đoạn 2), và gần gốc cành (đoạn 3), cho thấy đoạn ở ngọn có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn ở hai vị trí còn lại và đoạn ở gần gốc cành có tỷ lệ sống thấp nhất sau 8 tuần theo dõi Các số

liệu về tỷ lệ sống của các đoạn 1, đoạn 2 và đoạn 3 được trình bày trên bảng 7

Ở tất cả các nghiệm thức, sức sống của các đoạn cành giảm dần, tỷ lệ sống ở tuần thứ 8 thấp hơn 4 tuần trước đó Ở nghiệm thức đối chứng chịu sự tác động chủ yếu từ ngoại cảnh, các cành đoạn 1 sau 8 tuần có tỷ lệ sống (80%) cao hơn tỷ lệ sống của các cành đoạn 2 (42.5%) và đoạn 3 (30%) Đoạn 1 của cành khi được xử lý với IBA, có tỷ lệ sống cao hơn so với đối chứng Ở nghiệm

thức 500ppm và 1000ppm IBA, đoạn 1 có tỷ lệ sống là 85% sau 8 tuần Trong khi đó, ở các nghiệm

thức 50ppm IBA và 100ppm IBA, mặc dù nồng độ IBA thấp hơn, nhưng do được tiến hành vào

giữa mùa khô, nên tỷ lệ sống sau 8 tuần của đoạn 1 thấp hơn đối chứng

B ảng 7 Tỷ lệ sống của các đoạn cành tay hoàng lan trong giâm cành

Nghiệm thức

Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 4 (%)

Tỷ lệ sống TB ở tuần

thực hiện Đoạn

Nước cất 80 ±

2.90

57.5 ± 1.52

52.5 ± 2.72

80 ± 2.90

42.5 ± 0.79

30 ± 1.29

11/2009 - 12/2010

1.52

55 ± 1.59

50 ± 2.91

47.5 ± 0.79

27.5 ± 1.52

22.5 ± 1.52

02/2010 - 03/2010

1.84

62.5 ± 2.00

55 ± 2.76

67.5 ± 2.00

30 ± 2.25

20 ± 1.84

01/2010 02/2010

0.79

65 ± 2.05

27.5 ± 0.79

85 ± 0.92

32.5 ± 1.52

5 ± 0.92

11/2009 - 12/2009

1.52

67.5 ± 0.79

10 ± 1.29

85 ± 2.05

37.5

11/2009 - 12/2010 50ppm 2,4D +

100ppmIBA

27.5 ± 0.79

27.5 ± 2.39

12.5 ±

02/2010 - 03/2010 100ppm IAA +

100ppm IBA

15 ± 0.92

22.5 ± 2.72

5 ±

02/2010 - 03/2011 Oxyberon dust

0.5

52.5 ± 0.79

22.5 ± 2.00

17.5 ± 2.39

35 ± 0.92

12.5 ± 2.00

10 ± 2.25

12/2009 - 01/2010

2.76

40 ± 2.59

30 ± 1.29

32.5 ± 0.79

27.5 ± 2.72

22.5 ± 2.39

12/2009 - 01/2011 Đoạn 2 và 3 của cành khi được xử lý đều có tỷ lệ sống thấp hơn đối chứng ở tất cả các nghiệm

thức Ở các nghiệm thức có IBA, nồng độ IBA càng cao, tỷ lệ sống của các đoạn 3 giảm đi Khi xử

lý cành tay hoàng lan với IBA kết hợp với 2,4D và IAA, các đoạn có sức sống rất thấp, và chết sau

8 tuần thí nghiệm Điều này cho thấy, có thể auxin (2,4D và IAA) có tác dụng làm giảm sức sống

của cành tay hoàng lan

Qua số liệu trên bảng 7, đoạn ở ngọn có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn giữa và đoạn gốc của cành tay Tỷ lệ sống cao nhất của đoạn cành đạt 85% Như vậy, khi giâm hom cành tay hoàng lan có

thể sử dụng đoạn 1 và xử lý bằng IBA (500 – 1000ppm) Để có tỷ lệ sống cao, nên thực hiện giâm cành vào mùa mưa hoặc đầu mùa khô (tháng 11 – 12 trong năm) Kết quả này phù hợp với nghiên

cứu của Hoang và cộng sự (1986), mặc dù Hoang đã sử dụng thân hoàng lan để giâm cành

Kết quả về tỷ lệ sống của đoạn thân hoàng lan được thể hiện ở bảng 8

Qua các nghiệm thức giâm cành trên thân cây hoàng lan, tỷ lệ sống của các đoạn thân có xu hướng giảm dần sau 8 tuần theo dõi và đoạn 1 có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn 2 và đoạn 3, tương

tự với kết quả thu được khi thực hiện trên cành tay, tuy nhiên tỷ lệ sống của các đoạn thân cao hơn

so với các đoạn cành

Ở nghiệm thức đối chứng, đoạn 1 có tỷ lệ sống sau 6 – 8 tuần là 77,5% cao hơn so với đoạn 2

và đoạn 3 Các nghiệm thức giâm cành sử dụng thuốc thương phẩm được thực hiện cùng thời điểm

với nghiệm thức này Khi sử dụng thuốc kích thích ra rễ N3M, các đoạn thân có tỷ lệ sống khá cao sau 8 tuần, đoạn 1 sống hoàn toàn, tỷ lệ sống trung bình của đoạn 2 là 82,5%, đoạn 3 là 60% cao hơn so với đối chứng Ngược lại, khi sử dụng thuốc kích thích ra rễ Oxyberon dust 0.5, tỷ lệ sống

của các đoạn thân đều thấp hơn Như vậy, tỷ lệ sống của các đoạn thân hoàng lan không chỉ chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, mà còn chịu sự ảnh hưởng của thuốc kích thích

B ảng 8 Tỷ lệ sống của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành

Nghiệm thức

Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 4 (%)

Tỷ lệ sống TB ở tuần

thực hiện Đoạn

82.5 ± 2.00

77.5 ± 2.00

67.5 ± 3.28

67.5 ± 3.53 04-06/2010

1.59

90 ± 1.84

90 ± 1.29

90 ± 1.31

85 ± 0.92

85 ± 1.59 06-08/2010

2.72

37.5 ± 3.01

25 ± 0.92

20 ± 2.25

15 ± 3.05

12.5 ± 1.52 03-05/2010

3.44

60 ± 5.36

52.5 ± 3.53

55 ± 3.05

32.5 ± 2.00

17.5 ± 1.52 03-05/2010

3.05

20 ± 2.59

10 ± 1.29

62.5 ± 4.34

20 ± 2.59

7.5 ± 1.52 02-04/2010 50ppm 2,4D +

92.5 ± 2.39

75 ± 3.05

85 ± 3.05

82.5 ± 2.39

37.5 ± 2.72 05-07/2010 100ppmIAA +

100ppm IBA

67.5 ± 2.00

57.5 ± 2.00

55 ± 2.76

67.5 ± 2.00

57.5 ± 2.00

55 ± 2.76 05-07/2011 Oxyberon dust

0.5

92.5 ± 2.39

80 ± 2.59

70 ± 2.25

62.5 ± 2.00

62.5 ± 2.00

57.5 ± 5.26 04-06/2010

82.5 ± 2.39

60 ± 1.30 04-06/2010

Từ tháng 02 – 05/2010, các nghiệm thức sử dụng IBA với nồng độ 100ppm, 500ppm, 1000ppm được tiến hành Các đoạn thân chịu sự ảnh hưởng phần lớn từ điều kiện ngoại cảnh, nên

có tỷ lệ sống thấp hơn so với đối chứng Trong đó, đoạn 1 có tỷ lệ sống trung bình cao hơn so với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống của đoạn này tăng dần theo nồng độ IBA, cao nhất là 62,5% ở 1000ppm IBA Đối với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống ở 500ppm IBA cao hơn so với 100ppm và 1000ppm Nghiệm

thức IBA có nồng độ 50ppm được tiến hành vào tháng 06 – 08/2010, tỷ lệ sống của các đoạn sau 8

tuần cao hơn so với đối chứng, đoạn 1 là 90%, đoạn 2 và 3 là 85% Như vậy, sự sống sót của cành giâm hoàng lan chịu ảnh hưởng khá lớn từ điều kiện khí hâu và thời điểm giâm cành hoàng lan thích

hợp nhất vào những tháng mùa mưa của năm

Các nghiệm thức có sự kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA được tiến hành cùng thời gian vào tháng 05 – 07/2010 Ở nghiệm thức 100ppm IBA kết hợp với 50ppm 2,4D, kết quả về tỷ lệ sống cũng giảm dần sau 8 tuần, tỷ lệ sống trung bình của đoạn 1 và 2 cao hơn so với đối chứng, tuy nhiên

thấp hơn so với kết quả thu được từ nghiệm thức có 50ppm IBA, như vậy, chính 2,4D là tác nhân chính làm giảm tỷ lệ sống của các đoạn thân, và sự ảnh hưởng này thể hiện rõ rệt qua tỷ lệ sống của đoạn 3 Tương tự như vậy, ở nghiệm thức có sự kết hợp giữa 100ppm IBA và 100ppm IAA, IAA đã

có ảnh hưởng tức thời lên các cành giâm, nên chỉ sau 3 tuần tỷ lệ sống của các đoạn thân giảm đi và

thấp hơn so với đối chứng, sau đó tỷ lệ này không đổi sau các tuần tiếp theo

Số liệu trên bảng 8 cho thấy, để giâm hom đoạn thân hoàng lan có thể sử dụng thuốc N3M hay IBA (50mg/l) để đạt hiệu quả cao Thời gian áp dụng từ tháng 6 – 8 trong năm

3.1.2.Th ời gian ra rễ

Theo nghiên cứu của Hoang và cộng sự (Philipines), hoàng lan là loại cây dễ ra rễ Tuy nhiên,

sự hình thành rễ mới ở cành tay và thân cây không giống nhau Theo dõi sự ra rễ của các đoạn cành tay và đoạn thân hoàng lan, thời gian ra rễ được xác định như sau:

Đối với cành tay hoàng lan, thời gian ra rễ của các đoạn cành khá chậm Dưới tác động của

chất điều hòa sinh trưởng IBA ở nồng độ 1000ppm và thuốc thương phẩm Oxyberon dust 0.5 (Nhật), sau 4 tuần, các đoạn cành bắt đầu ra rễ và tiếp tục ra rễ ở 3 – 4 tuần sau đó

Đối với thân hoàng lan, ở nghiệm thức đối chứng, các đoạn thân ra rễ sau 4 tuần kể từ khi được giâm vào giá thể Khi có tác động của chất điều hòa sinh trưởng, thời gian ra rễ nhanh hơn, sau 2 – 3

tuần giâm vào giá thể, các đoạn thân bắt đầu ra rễ Cụ thể :

100ppm kết hợp với IAA 100ppm và thuốc thương phẩm N3M (Việt Nam) , rễ mới xuất hiện sau 5 hoặc 6 tuần

- Ở nghiệm thức có IBA 1000ppm và Oxyberon dust 0.5, rễ mới xuất hiện sau 2 tuần

Như vậy, thân hoàng lan có thể ra rễ sau 3 tuần kể từ khi giâm vào giá thể, và tiếp tục ra rễ trong các tuần tiếp theo cho đến tuần thứ 8 Cành tay hoàng lan khó ra rễ hơn, dưới tác động của

chất điều hòa sinh trưởng, các đoạn cành ra rễ sau 4 tuần

Qua đó, tôi đã theo dõi quá trình ra rễ của hoàng lan ở 2 mốc thời gian : 3 – 4 tuần, và 6 – 8

tuần

3.1.3.T ỷ lệ tạo rễ trong giâm cành hoàng lan

Kết quả ra rễ của cành giâm từ cành tay hoàng lan được trình bày ở bảng 9

B ảng 9 Tỷ lệ ra rễ của các đoạn cành tay hoàng lan trong giâm cành

Nghiệm thức

Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ

4 (%)

Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ 8 (%)

Hình 5 Các đoạn cành tay ra rễ

A 500ppm IBA – đoạn 2; B 1000ppm IBA – đoạn 1; C 1000ppm IBA-

đoạn 2; D Oxyberon dust 0.5 – đoạn 1; E Oxyberon dust 0.5 – đoạn 2

Khi bổ sung IBA với nồng độ tăng dần từ 50 – 1000ppm, các đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với đoạn 1 Đồng thời, những nghiệm thức được thực hiện trong điều kiện ngoại cảnh thích hợp (phụ lục 1), các đoạn cành dễ ra rễ hơn.Tuy nhiên tỷ lệ ra rễ trung bình còn thấp Đoạn 2 hình thành rễ mới ở 500ppm IBA với tỷ lệ 2,5% Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, đoạn 1 ra rễ với tỷ lệ 2,5%; đoạn 2 có tỷ

lệ ra rễ với tỷ lệ 5%, cao hơn so với đoạn 1 và so với đoạn 2 ở nồng độ 500ppm IBA

Ở các nghiệm thức sử dụng các thuốc ra rễ thương phẩm, thuốc kích thích ra rễ N3M chưa có

hiệu quả đối với các đoạn cành Trong khi đó, sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5 (Nhật Bản) cho kết

quả tốt lên đoạn 1 với tỷ lệ ra rễ trung bình là 7,5% sau 4 tuần, và 15% sau 8 tuần; tỷ lệ ra rễ trung

bình ở đoạn 2 là 2,5% sau 8 tuần Tác dụng của sự kết hợp giữa IBA với các auxin khác đã không

có hiệu quả đối với sự ra rễ của cành tay hoàng lan, các đoạn cành ở các nghiệm thức này không ra

rễ

Như vậy, cành tay hoàng lan có tỷ lệ ra rễ không cao, đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với các đoạn ở các vị trí khác trên cành tay Trong thí nghiệm này, IBA ở nồng độ 1000ppm có hiệu quả tốt nhất cho sự ra rễ của cành tay

Thực hiện các thí nghiệm tương tự như ở cành tay hoàng lan, các đoạn thân có tỷ lệ ra rễ cao hơn Các kết quả được trình bày ở bảng 10

Nghiệm thức đối chứng, đoạn 2 ra rễ với tỷ lệ 10%, cho thấy đoạn này dễ ra rễ hơn so với đoạn

1 và 3, trong đó đoạn 1 không ra rễ Dưới tác dụng của thuốc kích thích ra rễ thương phẩm, các đoạn thân ra rễ nhiều hơn đối chứng Tỷ lệ ra rễ của đoạn 2 là 27,5% khi dùng N3M và 35% khi dùng Oxyberon dust 0.5, cao hơn hẳn so với đoạn 1 và đoạn 3

Ở các nghiệm thức có IBA với nồng độ tăng dần từ 100 – 1000ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn 1,

2 và 3 tăng theo mức tăng của nồng độ IBA, đoạn 1 có tỷ lệ ra rễ cao nhất 40% ở 1000ppm IBA Dưới tác động của ngoại cảnh, các đoạn thân không ra rễ hoặc ra rễ với tỷ lệ thấp Tại nồng độ 100ppm IBA, các đoạn không ra rễ; hoặc ở nồng độ IBA 500ppm và 1000ppm, đoạn 2 và 3 có tỷ lệ

ra rễ thấp hơn so với đoạn 1

B ảng 10 Tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành

Nghiệm thức

Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 4

Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 8

Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3

15 ± 1.59

15 ± 3.05

0.79

25 ± 0.92

17.5 ± 2.39

Oxyberon dust

0.5

2.5 ± 0.79

7.5 ± 0.79

0.25 ± 0.79

27.5 ± 2.76

35 ± 3.79

22.5 ± 4.19

1.29

27.5 ±

Trong điều kiện khí hậu thích hợp, các đoạn 3 có tỷ lệ sống cao hơn và ra rễ dễ hơn Tại nồng

độ IBA 50ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân cao hơn so với đối chứng, đoạn 2 tỏ ra dễ ra rễ hơn, đặc

biệt đoạn 3 ra rễ với tỷ lệ cao hơn đoạn 1 Ở các nghiệm thức kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA, cả

3 đoạn đều ra rễ và đoạn 2 ra rễ nhiều nhất Tỷ lệ ra rễ của các đoạn này đều cao hơn so với đối

chứng, nhưng tỷ lệ ra rễ ở đoạn 1 là 22.5% thấp hơn so với kết quả ở nồng độ 1000ppm IBA Như

vậy, sự phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trưởng tác động lên sự ra rễ của thân hoàng lan với

hiệu quả còn thấp

Như vậy, IBA là kích tố ra

rễ thích hợp để

cành các đoạn thân hoàng lan Điều này phù

thương phẩm kích thích ra rễ có nguồn gốc khác nhau cũng có hiệu quả trong giâm cành ở mức độ

thấp hơn Thuốc N3M có thể sử dụng để nhân giống hoàng lan 1 cách rộng rãi và dễ dàng bằng phương pháp giâm cành

3.1.4.S ố lượng và kích thước rễ

Trong giâm cành, một bộ phận của cây bị tách rời cơ thể mẹ, để có thể sống độc lập, nó phải phát triển thành một cơ thể mới, tái sinh các cơ quan dinh dưỡng Sự tái sinh bộ rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính của loài, điều kiện ngoại cảnh, hàm lượng các phytohormones (auxins),

vị trí của cành giâm trên cây, lượng chất dinh dưỡng chứa trong cành giâm, độ lớn của cành giâm… Dưới tác động của chất kích thích ra rễ khác nhau, các vị trí khác nhau trên thân và cành hoàng lan tái sinh bộ rễ với số lượng và chiều dài rễ khác nhau

Các đoạn cành tay hoàng lan có thể ra rễ ở các nghiệm thức 500 – 1000ppm IBA và Oxyberon dust 0.5 Số lượng rễ được hình thành và chiều dài rễ sau 8 tuần được trình bày trên bảng 11

B ảng 11 Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn cành hoàng lan trong giâm cành

Qua bảng 11, ở các nghiệm thức 500ppm và 1000ppm IBA, số lượng rễ hình thành được ít, từ

1 – 2 rễ, chiều dài rễ dao động từ 6–8cm Nghiệm thức 1000ppm IBA, số lượng rễ mới nhiều hơn và

rễ dài hơn so với 500ppm IBA Ở nghiệm thức sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5, chất lượng bộ rễ

tốt hơn, các đoạn có từ 4 – 6 rễ mới, chiều dài rễ ngắn hơn, từ 2 – 5,5cm Các nghiệm thức này được

tiến hành cùng thời gian (11 – 12/2009), nên chịu ảnh hưởng của tác nhân ngoại cảnh như nhau Như vậy, chất lượng bộ rễ phụ thuộc chủ yếu vào liều lượng và chất kích thích ra rễ

Chất lượng bộ rễ của các đoạn cành giâm từ thân hoàng lan tốt hơn so với bộ rễ ở các đoạn cành tay Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân được thể hiện ở bảng 12

Ở tất cả các nghiệm thức, số lượng rễ hình thành được ở đoạn 2 cho số rễ cao hơn đoạn 1 và 3

Dựa theo kết quả về số rễ có được từ các nghiệm thức, số rễ của các cành giâm nhiều hơn khi nồng

độ IBA tăng Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, số rễ thống kê được cao hơn so với đối chứng

B ảng 12 Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành

Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3

2.83 ± 0.62

3.37 ± 1.42

2.63 ± 0.95

2.06 ± 1.13

0.56

3.56 ± 1.12

2.56 ± 1.49

2.79 ± 0.86

2.01 ± 0.48

1.26 ± 0.44

1.98 ±

Đối với chiều dài rễ, rễ của các đoạn 1 dài nhất và rễ của các đoạn 2 dài hơn rễ đoạn 3, có thể

là do các tế bào ở đoạn 1 gần mô phân sinh đỉnh ngọn, nên rễ hình thành được sẽ phát triển nhanh hơn Chiều dài rễ cũng tăng dần theo nồng độ của IBA

Qua kết quả trên, ta cũng thấy được, ở điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (phụ lục 1), các cành giâm có tỷ lệ ra rễ cao, thì số lượng rễ nhiều hơn và kích thước rễ cũng dài hơn, điều này được thể

hiện ở kết quả của hầu hết các nghiệm thức trên bảng 11

3.2.K ết quả nuôi cấy invitro chồi hoàng lan

3.2.1.K ết quả vô trùng chồi ngọn hoàng lan

Dưới tác động của các hóa chất khử trùng (Javel, HgClR 2 R), các mẫu chồi hoàng lan được vô trùng, tuy nhiên, đối với từng loại chất khử trùng và nồng độ chất khử trùng khác nhau, tỷ lệ mẫu được vô trùng cũng khác nhau, đồng thời, tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng bị ảnh hưởng Các kết quả

về khử trùng mẫu chồi hoàng lan được thể hiện ở bảng 13 và hình 7

Về tỷ lệ số mẫu vô trùng, xử lý mẫu cấy bằng HgClR 2 R tỏ ra hiệu quả hơn so với xử lý bằng Javel Khi sử dụng Javel để khử trùng mẫu, nồng độ và thời gian xử lý mẫu càng cao, các tác nhân gây hại (nấm, vi khuẩn) bị loại bỏ càng nhiều, nên tỷ lệ mẫu vô trùng tăng lên Nhưng Javel cho

hiệu quả khử trùng rất thấp Ở nồng độ 10% Javel xử lý mẫu trong thời gian 10 phút và 15 phút, đều không có hiệu quả khử trùng Ở nồng độ 50% Javel xử lý mẫu trong 15 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng

chỉ đạt 13,3%

Khi sử dụng HgClR 2 Rđể khử trùng mẫu thì hiệu quả khử trùng mẫu cao hơn Ở nồng độ 0.05mg/l HgClR 2 R xử lý trong 5 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 66,67% Bên cạnh đó, tương tự với kết quả khi

xử lý bằng Javel, nồng độ HgClR 2 R và thời gian xử lý tăng lên, tỷ lệ số mẫu vô trùng cũng tăng lên Ở

nồng độ HgClR 2 R cao nhất (0,1mg/l) xử lý trong thời gian lâu nhất (10 phút) cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 93,67%

Về tỷ lệ số mẫu sống vô trùng, các nghiệm thức ở nồng độ 0,07mg/l HgClR 2 R có tỷ lệ mẫu sống cao hơn so với các nghiệm thức còn lại Ở các nghiệm thức có nồng độ HgClR 2 R thấp hơn (0,05mg/l),

có hiệu quả khử trùng thấp hơn nên tỷ lệ mẫu sống vô trùng thấp hơn so với các nồng độ cao hơn Ở các nghiệm thức có nồng độ HgClR 2 R cao hơn (0,1mg/l)R 2 R, tỷ lệ số mẫu sống thấp hơn do ảnh hưởng

của chất khử trùng

B ảng 13 Tỷ lệ mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống sau khi khử trùng

trùng (%)

Tỷ lệ mẫu sống sau khử trùng (%) Hóa chất Nồng độ Thời gian (phút)

7 92.33 ± 1.43 63.3 ± 5.17

Như vậy, HgClR 2 Rlà hóa chất khử trùng hiệu quả hơn so với Javel Và xử lý mẫu cấy ở nồng độ 0,07mg/l HgClR 2 R trong thời gian 10 phút có tỷ lệ số mẫu sống vô trùng cao nhất (78,33%)

Hình 7 Đồ thị về tỷ lệ số mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống

3.2.2.K ết quả về tạo chồi hoàng lan trong nuôi cấy mô

Các mẫu cấy vô trùng được cấy chuyền qua môi trường WPM, có chất điều hòa sinh trưởng

BA và NAA Sau 4 tuần, các chồi mới được hình thành từ các nách lá Kết quả tạo chồi được thể

hiện qua bảng 14 và hình 9

Số liệu trên bảng 14 cho thấy tỷ lệ số mẫu tạo chồi sau 6 tuần nuôi cấy đều giảm trên tất cả các nghiệm thức Điều này là do, một số mẫu không tạo chồi hoặc tạo nên những cấu trúc bất thường và

một số chất có tác động ức chế được sản sinh từ chính mẫu cấy trong quá trình nuôi cấy Các chồi

mới được hình thành sau 3 tuần nuôi cấy bị thoái hóa và tạo nên những dạng bất thường khi được

cấy chuyền sang môi trường mới Các dạng bất thường này có màu xanh nhạt, giòn dễ gãy hoặc có

hiện tượng thủy tinh hóa

Kết quả cho thấy, trên các môi trường có bổ sung thêm BA, hoặc BA và NAA đều có tỷ lệ số

mẫu tạo chồi nhiều hơn so với môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng (đối chứng) Trong các môi trường có nồng độ BA tăng dần, nồng độ BA 2mg/l có tác dụng tốt trong sự tạo chồi, tỷ lệ

số mẫu tạo chồi ở tuần thứ 3 là 57,4% và tuần thứ 6 là 44,37%, cao hơn so với các nồng độ BA còn

lại Tuy nhiên, trong các nghiệm thức có sự phối hợp giữa BA với NAA có kết quả tạo chồi tốt hơn

Tỷ lệ (%) số mẫu vô trùng

Tỷ lệ (%) số mẫu sống sau khử trùng