LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) NC tạo KN tái tổ hợp STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN b (SEN) dạng ko độc từ đoạn GEN SEB tự nhiên làm NL phục vụ chế tạo que thử PHN độc tố SEB

Luận văn thạc sỹ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Lời cảm ơn! Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, kinh phí để giúp tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Viện Công nghệ sinh học đặc biệt TS Bùi Văn Ngọc bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi q trình thực nghiệm chia kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Hóa sinh, thầy giáo Khoa đào tạo sau đại học, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Đề tài thực khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước KC.04.14/1115: “Nghiên cứu chế tạo que thử phát nhanh độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) tụ cầu vàng” PGS TS Nghiêm Ngọc Minh làm chủ nhiệm giai đoạn 2013 – 2015 Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng Học viên năm MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ngộ độc thực phẩm tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) .3 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2 Giới thiệu Staphylococcus aureus 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 1.2.3 Các độc tố Staphylococcus aureus 11 1.3 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 15 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc 15 1.3.2 Cơ chế gây độc 16 1.3.3 Những triệu chứng thường gặp 17 1.3.4 Các phương pháp phát S aureus SEB 17 1.3.5 Protein tái tổ hợp SEB tiềm ứng dụng 21 1.4 Hệ biểu gen 23 1.4.1 Hệ biểu E coli 23 1.4.2 Chủng biểu E coli BL21(DE3) 24 1.4.3 Vector biểu pET22b(+) 25 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 26 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 28 2.1.4 Thiết bị máy móc 28 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 28 2.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29 2.2.3 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR) 30 2.2.4 Tách dòng vector pJET1.2/blunt 30 2.2.5 Xác định trình tự acid nucleic 31 2.2.6 Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer 31 2.2.7 Phản ứng nối ghép gen 32 2.2.8 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến Escherichia coli .33 2.2.9 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 33 2.2.10 Cắt plasmid enzym giới hạn 34 2.2.11 Tinh phân đoạn DNA 34 2.2.12 Phương pháp biểu gen đích chủng E coli BL21(DE3) 35 2.2.13 Phương pháp điện di DNA gel agarose 35 2.2.14 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide 36 2.2.15 Phương pháp tinh protein tái tổ hợp 37 2.2.16 Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford 38 2.2.17 Phương pháp kiểm tra độc tính protein tái tổ hợp 38 2.2.18 Phương pháp Western blot 40 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Tách chiết DNA tổng số S aureus nhân dòng gen seb 42 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số S aureus 42 3.1.2 Nhân dòng gen seb 42 3.1.3 Xác định trình tự gen seb 44 3.2 Tạo đột biến điểm gen seb 45 3.2.1 Tạo gen seb đột biến 45 3.2.2 Xác định trình tự gen seb đột biến 47 3.3 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen seb đột biến .48 3.3.1 Thiết kế vector pET22(b+) mang gen seb đột biến 48 3.3.2 Giải trình tự gen seb đột biến vector biểu 49 3.4 Tối ưu điều kiện biểu gen seb đột biến tế bào E coli BL21 tinh protein mtSEB 50 3.4.1 Biểu gen seb đột biến tế bào E coli BL21 50 3.4.2 Tối ưu điều kiện biểu gen seb đột biến 51 3.4.3 Tinh ptotein tái tổ hợp mtSEB 55 3.4.4 Xác định hàm lượng protein mtSEB theo phương pháp Bradford 57 3.5 Đánh giá tính kháng nguyên protein mtSEB 58 3.6 Đánh giá độc tính protein mtSEB động vật thử nghiệm 58 3.6.1 Đánh giá độc tính protein wtSEB mtSEB liều tiêm 1xLD50 lô đối chứng 58 3.6.2 Đánh giá độc tính protein wtSEB mtSEB liều tiêm 3xLD50 60 3.6.3 Đánh giá độc tính protein wtSEB mtSEB liều tiêm 10xLD50 61 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 75 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter APS Ammonium persulphate bp Base pair BSA Bovine serum albumin dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid Kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria - Bertani LD50 Lethal dose, 50% ml Milliliter mtSEB Mutant SEB OD Optical density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid S aureus Staphylococcus aureus SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis K16 – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật i SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TEMED N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine v/p Vòng/phút v/v volume/volume w/v Weight/volume wtSEB Wild type SEB i i DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn S aureus kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Các yếu tố gây bệnh S aureus 13 Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể protein SEB 15 Hình 1.4 Cơ chế gây độc siêu kháng nguyên 16 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số chủng S aureus 42 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen seb từ DNA tổng số S aureus 43 Hình 3.3 Điện di đồ plasmid mang gen seb tách chiết từ thể biến nạp 43 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/seb enzym hạn chế EcoRI HindIII 44 Hình 3.5 Trình tự gen seb chủng S aureus 44 Hình 3.6 Quy trình tạo đột biến H12Y gen seb 46 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose % 47 Hình 3.8 Trình tự amino acid sai khác dòng đột biến (mtSEB) dịng chưa đột biến (wtSEB) 47 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp pET22(b+)/mtSEB 48 Hình 3.10 Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt enzym EcoRI, HindIII 49 Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide wtSEB mtSEB 50 Hình 3.12 Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 (DE3) sau cảm ứng 51 Hình 3.13 Protein tổng số từ chủng E coli BL21 mang gen mã hóa mtSEB ni cấy cảm ứng nhiệt độ khác 52 Hình 3.14 Khả sinh tổng hợp mtSEB chủng E coli tái tổ hợp với nồng độ chất cảm ứng IPTG khác sau cảm ứng 54 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian nuôi cảm ứng lên hàm lượng protein SEB 54 Hình 3.16 Protein mtSEB sau tinh chế cột lực Ni-NTA gel SDS-PAGE 56 Hình 3.17 Đồ thị đường chuẩn định lượng protein BSA có phương trình tuyến tính: Y = 0,456X 57 Hình 3.18 Phân tích khả bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng lại SEB S aureus 58 Hình 3.19 Kết tiêm chuột lô với liều tiêm 1xLD50 sau ngày theo dõi 60 Hình 3.20 Kết tiêm chuột lô với liều tiêm 3xLD50 sau ngày theo dõi 61 Hình 3.21 Kết tiêm chuột lô với liều tiêm 10xLD50 sau ngày theo dõi 62 Hình 3.20 Kết tiêm chuột lơ với liều tiêm 3xLD50 sau ngày theo dõi 3.6.3 Đánh giá độc tính protein wtSEB mtSEB liều tiêm 10xLD50 Tương tự thí nghiệm trên, tiến hành tiêm cho lô 4, với liều tiêm 10xLD50 Kết cho thấy liều tiêm 10xLD50 (= 25 µg/g) dung dịch wtSEB phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g 100% số chuột chết sau tiêm (lơ 4) (hình 3.21) không xuất chuột chết lô tiêm Actinomycin D liều 0,5 µg/g phối hợp với dung dịch mtSEB liều tiêm 10xLD50 (= 25 µg/g) Bảng 3.5 So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB liều tiêm10xLD50 Lơ chuột thí nghiệm Số chuột chết/tổng số chuột Số chuột chết (%) Lô (tiêm ActD M2 = 10xLD50) 10/10 100 Lô (tiêm ActD M4 = 10xLD50) 0/10 Hình 3.21 Kết tiêm chuột lô với liều tiêm 10xLD50 sau ngày theo dõi Như vậy, sau lô thử nghiệm kết đánh giá độc tính protein SEB sau: Protein tái tổ hợp mtSEB có độc tính thấp khơng gây chết động vật thí nghiệm liều tiêm (1xLD50; 3xLD50 10xLD50) dùng phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g trọng lượng thể protein wtSEB có độc tính cao gây chết 50% số chuột thí nghiệm liều tiêm 1xLD50 gây chết 100% số chuột thí nghiệm liều 3xLD50 10xLD50 dùng phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g trọng lượng thể KẾT LUẬN Nhân dòng xác định trình tự gen seb tự nhiên có kích thước khoảng 534 bp từ chủng S aureus phân lập Việt Nam Tạo gen seb đột biến điểm 04 vị trí ba mã hóa 12, 32, 105 121 để thay amino acid Histidine thành Tyrosine gen seb tự nhiên Thiết kế biểu thành công mtSEB với vector pET22b(+) E coli o BL21 Với nhiệt độ 37 C, nồng độ IPTG 0,5 mM thời gian cảm ứng là điều kiện để tối ưu để cảm ứng biểu protein mtSEB Tinh thành công protein mtSEB sử dụng cột Ni – NTA với nồng độ trung bình mg/ml Protein mtSEB tái tổ hợp phản ứng đặc hiệu với kháng thể đa dịng thơng qua kỹ thuật Western blot Độc tố protein mtSEB không gây chết chuột mức liều tương đương 10xLD50 (25 µg/g) protein wtSEB có độc tính cao gây chết 50% số chuột thí nghiệm liều tiêm 1xLD50 (2,5 µg/g) gây chết 100% số chuột thí nghiệm liều 3xLD50 (7,5 µg/g) 10xLD50 (25 µg/g) KIẾN NGHỊ Tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB đánh giá hiệu giá tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2009) Dược điển học Việt Nam Xuất lần 4, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn, Bùi Thị Kim Dung (2005) Khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ Tp.Hồ Chí Minh năm 2002-2004 Trung tâm y tế dự phịng Tp.Hồ Chí Minh, Thơng tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm ] Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Kiều Nương (2003) Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố thành phố Hồ Chí Minh năm 2002.Viện Vệ Sinh Y tế Cơng Cộng Thành phố Hồ Chí Minh, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục 230 trang Phan Hữu Tôn (2010) Giáo trình sinh học phân tử Nhà xuất Nơng nghiệp 179 trang ư Tiếng nước ngồi Agrawal R, Singh PK, Sharma SK, Kamboj DV, Goel AK, Singh L (2012) Highly expressed recombinant SEB for antibody production and development of immunodetection system Indian J Microbiol 52: 191–196 Arcuri EF, Angelo FF, MartinsGuimar˜ aEsetal MF (2010) Toxigenic status of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk and Minas frescal cheese in Brazil J Food Prot 73(12): 2225–2231 Balaban N, Rasooly A (2000) Staphylococcal enterotoxins Int J Food Microbiol 61: 1-10 Barber MA (1914) Milk poisoning due to a type of Staphylococcus albusoccurring in the udder of a healthy cow Philipp J Sci 9: 515–519 10 Barik S (1993) Site-directed mutagenesis by double polymerase chain reaction Methods Mol Biol 15: 277-286 11 Bayles KW, Iandolo JJ (1989) Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal enterotoxin D J Bacteriol 171(9): 4799-806 12 Bennett SD, Walsh KA, Gould LH (2013) Foodborne disease outbreaks caused by Bacillus cereus, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus United States, 1998–2008 Clin Infect Dis 57: 425–433 13 Bergdoll MS (1989) Staphylococcus aureus In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed) Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA: 463-523 14 Betley MJ, Mekalanos JJ (1988) Nucleotide sequence of the type A staphylococcal enterotoxin gene J Bacteriol 170(1): 34-41 15 Bohach GA, Schlievert PM (1987) Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins Mol Gen Genet 209(1): 15-20 16 Bohach GA, Schlievert PM (1989) Conservation of the biologically active portions of staphylococcal enterotoxins C1 and C2 Infect Immun 57(7): 22492252 17 CAST (1994) Foodborne Pathogens: Risks and Consequences Task Force Report No 122 18 Chaibenjawong P, Foster SJ (2011) Desiccation tolerance in Staphylococcus aureus Arch Microbiol 193(2): 125–135 19 Chen JY, Qiao Y, Komisar JL, Baze WB, Hsu IC, Tseng J (1994) Increased susceptibility to staphylococcal enterotoxin B intoxication in mice primed with actinomycin D Infect Immun 62(10): 4626-4631 20 Chiang YC, Chang LT, Lin CW, Yang CY, Tsen HY (2006) PCR primers for the detection of staphylococcal enterotoxins K, L, and M and survey of staphylococcal enterotoxin types in Staphylococcus aureus isolates from food poisoning cases in Taiwan J Food Prot 69(5): 1072-1079 21 Chiang YC, Liao WW, Fan CM, Pai WY, Chiou CS, Tsen HY (2008) PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan Int J Food Microbiol 121(1): 66-73 22 Coffman JD, Zhu J, Roach JM, Bavari S, Ulrich RG, Giardina SL (2002) Production and purification of a recombinant Staphylococcal enterotoxin B vaccine candidate expressed in Escherichia coli Protein Expr Purif 24 (2): 302 – 312 23 Collins CH, Patricia ML, Grange JM (1995) Staphylococcus and Micococcus Collines and Lyne’s Microbiological Methods: 353-359 24 Couch JL, Betley MJ (1989) Nucleotide sequence of the type C3 staphylococcal enterotoxin gene suggests that intergenic recombination causes antigenic variation J Bacteriol 171(8): 4507-10 25 Couch JL, Soltis MT, Betley MJ (1988) Cloning and nucleotide sequence of the type E staphylococcal enterotoxin gene J Bacteriol 170(7): 2954-60 26 Dack GM, Cary WE, Woolpert O, Wiggers H (1930) An outbreak of food poisoning proved to be due to a yellow hemolytic staphylococcus J Prev Med 4: 167–175 27 De Buyser ML, Dufour B, Maire M, Lafarge V (2001) Implication of milk and milk products in food-borne diseases in France and in different industrialized countries Int J Food Microbiol 67: 1–17 28 Denys J (1894) Pre´sence de Staphylocoque dans une viande qui a de´termine ´ des cas d’empoisonnement Bull Acad R Med Belg 8: 496 29 Do Carmo LS, Dias RS, Linardi VR, Sena MJ, Santos DA, Faria E, Pena EC, Jett M, Heneine LG (2002) Food poisoning due to enterotoxigenic strains Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil Food Microbiol 19(1): 9-14 30 Genigeorgic CA (1989) Present state of knowledge on staphylococcal intoxication Int J Food Microbiol 9: 327-360 31 Gleason BA (2011) CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview 32 Haeghebaert S, Le QF, Gallay A, Bouvet P, Gomez M, Vaillant V (2002) Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000 Bull Epidémiol Hebdo 23:105-109 33 Hanson BM, Dressler AE, Harper AL, R P Scheibel RP, S E Wardyn SE, L K Roberts LK, J S Kroeger JS, T C Smith TC (2011) Prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on retail meat in Iowa Journal of Infection and Public Health 4(4): 169–174 34 Haran KP, Godden SM, Boxrud D, Jawahir S, Bender JB, Sreevatsan S (2012) Prevalence and characterization of Staphylococcus aureus, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus, isolated from bulk tank milk from Minnesota dairy farms J Clin Microbiol 50(3): 688–695 35 Henghold WB (2004) Other biologic toxin bioweapons: ricin, staphylococcal enterotoxin B, and trichothecene mycotoxins, 2nd Dermatol Clin 22(3): 257262 36 Hennekinne JA, De Buyser ML, Dragacci S (2012) Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation FEMS Microbiol Rev 36: 815–836 37 Hovde CJ, Hackett SP, and G.A Bohach GA (1990) Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C3 gene: sequence comparison of all three type C staphylococcal enterotoxins Mol Gen Genet 220(2): 329-33 38 Jablonski LM, Bohach GA (1997) Staphylococcus aureus Food Microbiology Fundamentals and Frontiers (Doyle MP, Beuchat LR & Montville TJ, eds) American Society for Microbiology Press, Washington, DC: 353–357 39 Jackson CR, Davis JA, Barrett JB (2013) Prevalence and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from retail meat and humans in Georgia J ClinMicrobiol 51: 1199–1207 40 Jones CL, Khan SA (1986) Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus J Bacteriol 166(1): 29–33 41 Jordan EO, Burrows W (1934) Further observations on staphylococcus food poisoning Am J Hyg 20: 604 42 Ju J, Kheterpal I, Scherer JR, Ruan C, Fuller CW, Glazer AN, Mathies RA (1995) Design and synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA sequencing and analysis Anal Biochem 231(1): 131-140 43 Kappler J, Kotzin B, Herron L, Gelfand EW, Bigler RD, Boylston A, Carrel S, Posnett DN, Choi Y, Marrack P (1989) Vβ specific stimulation of human T cells by toxins Science 244: 811–813 44 Kijek TM, Rossi CA, Moss D, Parker RW, Henchal EA (2000) Rapid and sensitive Immunomagnetic-electrochemiluminescent detection of Staphyloccocal Enterotoxin B J Immunol Methods 236(1-2): 9–17 45 King KD, Anderson GP, Bullock KE, Regina MJ, Saaski EW, Ligler FS (1999) Detecting Staphylococcal Enterotoxin B using an automated fiber optic biosensor Biosens Bioelectron 14(2):163–170 46 Korolev S, Pinelis D, Savransky V, Komisar J, Vogel P, Fegeding K (2003) Toxicity of the Staphylococcal Enterotoxin B Mutants with Histidine-totyrosine Substitutions Toxicology 187(2-3): 229–238 47 Kusumaningrum HD, Van Putten MM, Rombouts FM, Beumer RR (2002) Effects of antibacterial dishwashing liquid on foodborne pathogens and competitive microorganisms in kitchen sponges J Food Protect 65(1): 61–65 48 Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227: 680-685 49 Leggiadro RJ (2000) The threat of biological terrorism: a public health and infection control reality Infect Control Hosp Epidemiol 21(1): 53-56 50 Ler SG, Lee FK, Gopalakrishnakone P (2006) Trends in detection of warfare agents Detection methods for ricin, staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin J Chromatogr A 1133(1-2): 1-12 51 Letertre C, Perelle S, Dilasser F, Fach P (2003) Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus J Appl Microbiol 95(1): 38-43 52 Li H, Llera A, Tsuchiya D, Leder L, Ysern X, Schlievert PM, Karjalainen K, Mariuzza RA (1998) Three-dimensional structure of the complex between a T cell receptor beta chain and the superantigen staphylococcal enterotoxin B Immunity 9(6): 807-816 53 Loir YL, Baron F, Gautier M (2003) Staphylococcus aureus and food poisoning Genet and Mol Res 2: 63-76 54 Marrack P, Blackman M, Burgert HG, McCormack JM, Cambier J, Finkel TH, Kappler J (1989) T-cell repertoire and thymus Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54: 105-110 55 Marrack P, McCormack J, Kappler J (1989) Presentation of antigen, foreign major histocompatibility complex proteins and self by thymus cortical epithelium Nature 338(6215): 503-505 56 Martin MC, Fueyo JM, Gonzalez-Hevia MA, Mendoza MC (2004) Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks Int J Food Microbiol 94(3): 279286 57 Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV (1999) Food-Related Illness and Death in the United States Emerg Infecti Dis 5(5): 607-625 58 Minor TE, Marth EH (1972) Staphylococcus aureus and staphylococcal food intoxications A review IV Staphylococci in meat, bakery and other foods J Milk Food Technol 35: 228–241 59 Monaco M, Pedroni P, Sanchini A, Bonomini A, Indelicato A, Pantosti A (2013) Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus responsible for human colonization and infection in an area of Italy with high density of pig farming BMC Infect Dis 13(1): 258 60 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51: 263-273 61 Munson SH, Tremaine MT, Betley MJ, Welch RA(1998) Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun 66(7): 3337-3348 62 Murphy BP, O’Mahony E, Buckley JF, O’Brien S, Fanning S (2010) Characterization of Staphylococcus aureus isolated from dairy animals in ireland Zoonoses Public Hlth 57(4): 249–257 63 Neder VE, Canavesio VR, Cal vinho LF (2011) Presence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in bulk tank milk from Argentine dairy farms Rev Argent Microbiol 43(2): 104–106 64 Normanno G, Firinu A, Virgilio S, Mula G, Dambrosio A, Poggiu A, Decastelli L, Mioni R, Scuota S, Bolzoni G, Di Giannatale E, Salinetti AP, La Salandra G, Bartoli M, Zuccon F, Pirino T, Sias S, Parisi A, Quaglia NC, Celano GV (2004) Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy Int J Food Microbiol 98: 73-79 65 O’Brien AM, Hanson BM, Farina SA, Wu JY, Simmering JE, Wardyn SE, Kulick M, Wallinga DB, Smith TC (2012) MRSA in conventional and alternative retail pork products PLoS ONE 7(1):e30092 66 Omoe K, Ishikawa M, Shimoda Y, Hu DL, Ueda S, Shinagawa K (2002) Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S aureus isolates Harboring seg, seh, or sei genes J Clin Microbiol 40(3): 857-62 67 Papageorgiou AC, Acharya KR (2000) Microbial superantigens: from structure to function Trends Microbiol 8(8): 369-375 68 Papageorgiou AC, Tranter HS, Acharya KR (1998) Crystal structure of microbial superantigen staphylococcal enterotoxin B at 1.5 A resolution: implications for superantigen recognition by MHC class II molecules and T-cell receptors J Mol Biol 277(1): 61-79 69 Peles F, Wagner M, Varga L, Hein I, Rieck P, Gutser K, Keresztúri P, Kardos G, Turcsányi I, Béri B, Szabó A (2007) Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from Bovine Milk in Hungary Int J Food Microbiol 118 (2): 186-193 70 Pu S, Han F, Ge B (2009) Isolation and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from louisiana retail meats Appl Environ Microb 75(1): 265–267 71 Rose WC, Bradley SG (1971) Enhanced toxicity for mice of combinations of antibiotics with Escherichia coli cells or Salmonella typhosa endotoxin Infect Immun 4(5): 550-555 72 Rosec JP, Gigaud O (2002) Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France Int J Food Microbiol 35: 61-70 73 Rusnak JM, Kortepeter M, Ulrich R, Poli M, Boudreau E (2004) Laboratory Exposures to Staphylococcal Enterotoxin B Emerg Infect Dis 10: 1544-1549 74 Sande MK, McKillip JL (2002) Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches Food control 15: 5-10 75 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74 (12): 5463-5467 76 Savransky V, Pinelis D, Korolev S, Ionin B, Fegeding K (2004) Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice Toxicon 43(4): 433-438 77 Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones JL, Griffin PM (2011) Foodborne illness acquired in the United Statesmajor pathogens Diseases 17(1): 7–15 78 Scherrer D, Corti S, Muehlherr JE, Zweifel C, Stephan R (2004) Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulktank milk samples of goats and sheep Vet Microbiol 101(2): 101–107 79 Schmitt M, Schuler-Schmid U, Scmidt-Lorenz W (1990) Temperature limits off growth, Tnase, and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strain isolated from food Int J Food Mcrobiol 11: 1-19 80 Sedmak JJ, Grossberg SE (1977) A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250 Anal Biochem (79): 544-552 81 Shih YP, Kung WM, Chen JC, Yeh CH, Wang AHJ, Wang TF (2002) Highthroughput screening of soluble recombinant proteins Protein Sci Publ Protein Soc 11: 1714–1719 82 Shin CS, Hong MS, Bae CS, Lee J (1997) Enhanced production of human miniproinsulin in fed-batch cultures at hight cell density of Escherichia coli BL21 (DE3) [pET-3aT2M2] Biotechnol Prog 13: 249-257 83 Stelma GN, Bergdoll MS (1982) Inactivation of staphylococcal enterotoxin A by chemical modification Biochem Biophys Res Commun 105(1): 121-126 84 Stiles BG, Garza AR, Ulrich RG, Boles JW (2001) Mucosal vaccination with recombinantly attenuated staphylococcal enterotoxin B and protection in a murine model Infect Immun 69: 2031-2036 85 Sugiyama H, Bergdoll MS, Dack GM (1960) In vitro studies on staphylococcal enterotoxin production J Bacteriol 80: 265-70 86 Sundstrom M, Abrahmsen L, Antonsson P, Mehindate K, Mourad W, Dohlsten M (1996) The Co-crystal structure of staphylococcal enterotoxin type A with Zn2+ at 2.7 A resolution Implications for major histocompatibility complex class II binding J Biol Chem 271(50): 32212-6 87 Swaminathan S, Furey W, Pletcher J, Sax M (1992) Crystal structure of staphyloccocal enterotoxin B, a superantige Nature 359: 801 – 806 88 Syne SM, Ramsubhag A, Adesiyun AA (2013) Microbiological hazard analysis of ready-to-eat meats processed at a food plant in Trinidad, West Indies Infect Ecolo Epidemiol 89 Thibodeau J, Cloutier I, Lavoie PM, Labrecque N, Mourad W, Jardetzky T, Sekaly RP (1994) Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding Sciences 266(5192): 1874-1878 90 Todar K (2005) Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus) Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology 91 Ulrich RG, Sidell S, Taylor TJ, Wilhelmsen CL, Franz DR (1997) Staphylococcal enterotoxin B and related pyrogenic toxins In the textbook of military medicine, warfare, weaponry, and the casuality Medical aspects of chemical and biological warfare Falls Church, VA: Office of the Surgeon General, Department of the Army Available at: www.bordeninstitute.army.mil/ cwbw/Ch31.pdf 92 Unaydin BG, Aslantas O, Demir C (2011) Detection of superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus strains from subclinical bovine mastitis Trop Anim Health Pro 43(8):1633–1637 93 Van der Donk CF, Schols JM, Schneiders V, Grimm KH, Stobberingh EE (2013) Antibiotic resistance, population structure and spread of Staphylococcus aureus in nursing homes in the Euregion Meuse-Rhine Eur J Clin Microbiol Infect Dis 32(11): 1483-1489 94 Varshney AK, Wang X, Cook E, Dutta K, Scharff MD, Goger MJ, Fries BC (2011) Generation, characterization, and epitope mapping of neutralizing and protective monoclonal antibodies against Staphylococcal enterotoxin B induced lethal shock J Biol Chem 286: 9737–9747 95 Waters AE, Contente-Cuomo T, Buchhagen J (2011) Multidrug-resistant Staphylococcus aureus in US meat and poultry Clin Infects Dis 52(10): 1227– 1230 96 Wieneke AA, Roberts D, Gilbert RJ (1993) Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969-90 Epidemiol Infect 110: 519-531 97 Woody MA, Krakauer T, Stiles BG (1997) Staphylococcal enterotoxin B mutants (N23K and F44S): biological effects and vaccine potential in a mouse model Vaccine (2): 133-139 98 Yang Z, Zhang L, Zhang Y, Zhang T, Feng Y, Lu X, Lan W, Wang J, Wu H, Cao C, Wang X (2011) Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method PLoS ONE 6: e22981 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Trần Minh Trí, Ng uy ễn Thị Hoà i Thu , Bùi Văn Ngọc, Lê Trọng Văn, Phạm Thùy Linh, Nghiêm Ngọc Minh (2014) Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin B (SEB) từ đoạn gen đột biến điểm seb 534 nucleotide Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(1): 173-180 ... chế tạo que thử phát nhanh SEB phục vụ nhu cầu nước Xuất phát từ lý trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn. .. không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát nhanh độc tố SEB? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo kháng nguyên SEB độc tính có độc tính thấp đảm b? ??o tính kháng... gen seb đột biến .48 3.3.1 Thiết kế vector pET22 (b+ ) mang gen seb đột biến 48 3.3.2 Giải trình tự gen seb đột biến vector biểu 49 3.4 Tối ưu điều kiện biểu gen seb đột biến tế b? ?o