LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) nghiên cứu chuyển cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của SMW vào giống thuốc lá c9 1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus

1 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro…………… 22 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số……………………… 25 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi 26 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CPi 27 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 9-1………………………………………………… 31 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 ấu trúc hệ gen SMV Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi in vitro 11 - ……………………………………… 29 3.2 Các mảnh ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens , mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường chọn lọc…………………………………… 31 , chồi màu xanh tách môi trường chọn lọc chồi chuyển gen sau tuần môi trường tạo rễ………… ………………………………… 33 ………………………………………………………… 34 Hình 3.5 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ dòng thuốc chuyển gen…………………………………………………………… 35 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GW-SMV-CPi thuốc chuyển gen 36 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) cs Cộng ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trường tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trường rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference dsRNA Double Stranded ribinucleic acid mRNA Messenger siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TMV Tobacco Mosaic Virus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence Region YEP Yeast extract peptone vii Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v MỤC LỤC vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG…… …… 1.1.2 Bệnh khảm virus đậu tương …………………… 1.2 KỸ THUẬT RNAi 10 1.2.1 Cơ chế ức chế gen RNAi 10 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng virus 1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 12 1.3.1 Phương 13 pháp chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…………………………………… 13 16 18 viii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 21 2.2.2 Phương pháp lây nhiễm tạo thuôc chuyển gen 21 2.2.3 Phân tích có mặt cấu trúc chuyển gen pK7GW-SMVCPi phương pháp PCR……………………………… 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 in vitro …………………………………………… 28 3.2 Kết chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào thuốc 29 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 35 …………………………………… 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 40 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ đậu (Fabaceae), trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê thức Chính phủ, đậu tương trồng 28 tỉnh khắp nước, 70% miền Bắc 30% miền Nam Gần nhà khoa học nghiên cứu phát đậu tương có vai trị chữa điều trị số bệnh nan y ung thư, đái tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não tim mạch [4] Tuy nhiên, diện tích trồng đậu tương phân tán, suất đậu tương giảm chất lượng chưa ổn định nhiều ngun nhân sâu bệnh , mơi trường, chất lượng hạt giống, kĩ thuật canh tác Đậu tương loại trồng dễ mẫn cảm với nhiều tác nhân gây bệnh, có bệnh tác nhân virus gây Bệnh khảm đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) gây ra, lần ghi nhận Hoa Kỳ vào năm 1915 Clinton (1916) Gardner Kendrick đặt tên năm 1921 Sau tìm thấy Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Canada, Brazil, Úc nhiều quốc gia khác SMV thuộc chi Potyvirus có vật liệu di truyền sợi RNA đơn dương [42] SMV lây truyền rệp, bọ trĩ làm môi giới Sự lan truyền từ bệnh sang khỏe rệp ngồi đồng chủ yếu, bệnh cịn truyền qua hạt Bọ trĩ, rệp nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh lớn Hiện dừng lại biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị Phương pháp chuyển gen để tạo trồng kháng virus xem biện pháp có hiệu ngành chọn giống trồng nói chung chọn giống đậu tương nói riêng Gần đây, RNAi xem kỹ thuật đại hữu hiệu chống lại bệnh virus gây thực vật q trình sinh lý tự nhiên tế bào Cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều virus mục tiêu sử dụng để chuyển vào cây, biểu thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hpRNA) chuyển gen kích thích chế RNAi hoạt động có xâm nhập virus vào Nhiều giống trồng kháng loại bệnh virus khác tạo kỹ thuật chuyển gen Xuất phát từ lí tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9-1 phục vụ tạo chuyển gen kháng virus” Mục tiêu nghiên cứu Chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9-1 tạo chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh giống thuốc C9-1; (2) Tái sinh tạo thuốc (3) Phân tích có mặt đoạn gen chuyển gen kỹ thuật PCR ; chuyển Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Nguồn gốc Đậu tương có tên khoa học Glycine max (L) Merrill loài trồng biết đến từ sớm Các chứng lịch sử, địa lí khảo cổ học đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc Đậu tương hóa trồng làm thực phẩm Trung quốc vào khoảng kỉ 17 trước cơng ngun Sau đó, truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng kỉ thứ 8, du nhập vào nhiều nước châu Á khác Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam…vài kỉ sau Ngày nay, Hoa Kì quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu giới, chiếm 50% sản lượng toàn giới, nước Trung Quốc, Ấn Độ…[43] Đậu tương trồng thuộc Đậu Fabales, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae, chi Glycine Có nhiều hệ thống phân loại khác nhau, hệ thống phân loại vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng nhiễm sắc thể Hymowit Newell (1984) xây dựng xây dựng rộng rãi Theo cách phân loại ngồi chi glycine cịn có chi phụ Soja Chi glycine chia thành loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm lồi có lồi đậu trồng Glycine max (L) Merrill [6] Ở Việt Nam, đậu tương trồng lâu đời, từ kỷ 13 Lê Quý Đôn ghi “Vân đài loại ngữ” đậu tương trồng số tỉnh vùng Đông Bắc, miền Bắc nước ta [4], [6] Mặc dù, trồng từ sớm vài chục năm gần đậu tương quan tâm, phát triển ngày xem giống trồng có giá trị dinh dưỡng cao, chiếm vị trí quan trọng kinh tế Nhưng diện tích trồng sản lượng chưa cao so với nước giới Đậu tương (Glycine max (L.) Merril) hai mầm, thân thảo Thân có nhiều lơng nhỏ, cịn non thân có màu xanh màu tím, già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc thân cho ta biết màu hoa sau Nếu thân có màu xanh, hoa có màu trắng, thân có màu tím sau hoa có màu tím đỏ Chiều cao thân từ 0,3 - 1m Khác với trồng khác thân đậu tương phát triển mạnh lại vào lúc hoa rộ Đây lúc mà giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sinh trưởng sinh thực cạnh tranh dẫn đến khủng hoảng dinh dưỡng Vì vậy, trồng trọt cần ý cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho trước chúng bước vào giai đoạn [6] Cây đậu tương có loại mầm, nguyên kép Lá mầm (lá tử diệp) mọc có màu vàng hay xanh lục, tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng ni mầm, trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ chọn hạt to mọc khoẻ, sinh trưởng tốt Lá nguyên (lá đơn) xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng Lá đơn to màu xanh bóng biểu sinh trưởng tốt Lá đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét Lá đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Mỗi kép có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le thường có màu xanh tươi già biến thành màu vàng nâu Lá có nhiều hình dạng khác tuỳ theo giống, giống nhỏ dài chịu hạn khoẻ thường cho suất thấp Những giống to chống chịu hạn thường cho suất cao Nếu kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét [6] lệ tạo đa chồi cao 70% Tuy nhiên, có số mảnh không mọc chồi chiếm 30% Từ cụm chồi chọn 127 cho vào môi trường rễ có bổ sung kháng sinh chọn lọc, số có số khơng rễ Kết thu 30 cho môi trường trấu : cát cuối 20 trồng nhà lưới 3.4) 3.4 ên Còn mẫu đối chứng ĐC1 không chuyển gen không cấy lên môi trường kháng sinh chọn lọc mà cấy lên môi trường tạo đa chồi, kéo dài chồi môi trường rễ bình thường thu kết hầu hết cụm chồi mọc lên mép mảnh Từ cụm chồi chọn 105 cho vào môi trường rễ không bổ sung kháng sinh chọn lọc Kết thu 15 cho mơi trường trấu:cát, sau số trồng nhà lưới lại Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới khoảng 3-4 tuần tiến hành thu để thực phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dịng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Các mẫu non 20 dòng thuốc chuyển gen hệ T0 trồng nhà lưới sau - tuần để tách DNA tổng số Sau DNA tổng số dùng làm khn để kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GWSMV-CPi thuốc chuyển gen phản ứng PCR Kết tách DNA tổng số thể ảnh điện gel agarose 1% hình 3.5 123 45678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20  Hình 3.5 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ dòng thuốc chuyển gen Trên ảnh điện di hình băng ADN tổng số 20 mẫu thuốc thu gọn, có độ nguyên vẹn tinh cao Trước tiến hành phản ứng PCR, DNA pha loãng nồng độ 50 ng/µl Sự có mặt gen chuyển kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/SMV-CPi-R, đoạn gen thu có kích thước 294 bp Vì số gen thường so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR thực với 35 chu kỳ Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% thể hình 3.6 (-) (+) M1 23 45 678 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 500 bp ~294 bp 250 bp Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GW-SMV-CPi thuốc chuyển gen 1-20: 20 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GWSMVCpi; (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) Kết thể hình 3.6 cho thấy, có 18/20 dịng thuốc dương tính PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 294bp, tương tự kết mẫu đối chứng dương Kích thước hồn tồn phù hợp với CPi Vì vậy, khẳng định pK7GW-SMV -CPi chuyển thành công vào thuốc cấu trúc 9-1 Gen ngoại lai biến nạp vào tế bào tồn tế bào chủ trạng thái: (1) Tạm thời dạng DNA tự do; (2) tồn lâu dài dạng thể plasmid độc lập tự nhân; (3) tồn ổn định đoạn DNA hệ gen tế bào chủ nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp Kết dương tính với PCR bước đầu giúp đầu kiểm tra xem gen chuyển vào hay khơng Tuy nhiên, PCR dương tính chưa thể khẳng định xem gen có hoạt động tồn qua nhiều hệ hay không [2], [10] có nhiều cách giải thích tồn DNA mẫu phân tích : (i) Vi khuẩn A tumefaciens mang gen tồn khối mô hay gian bào mẫu phân tích Hiện tượng xuất nhiều đối tượng Nếu mẫu phân tích thực vật qua nhân giống hữu tính, tức qua hệ T1, T2 dạng hạt hoàn toàn ; (ii) Gen chuyển tồn tự tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính; (iii) Gen chuyển khơng hoạt động, tức khơng biểu thành protein có chức sinh học [2] virus (2007) khảm thuốc lá) (virus vector RNAi Các giống thuốc K326 Longjiang 911 chuyển gen thông qua A.tumefaciens biểu real-time PCR cho thấy TMV 326 911 90% [40] Thơng kẹp tóc cDNA gen CP virus khoai tây ( kháng PVY 83,54% [41] [31], [39]… CMV (Cucumber mosaic virus 84,1%, ng TMV (Tobacco mosaic virus) 74,5% TMV CMV đồng thời hai loại virus 70,8% [7], [8], [13] Tuy nhiên, nhóm tác giả thấy tỷ lệ kháng bệnh dòng chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen lựa chọ 7GW-SMV-CPi v 1.1 9-1 , in vitro p 1.2 C RNAi pK7GW-SMV-CPi - A tumefaciens 1.3 h sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, Nxb Đại học Sư phạm, Huế Trần Văn Điển (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011) Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam: 316 – 326 Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004) Đánh giá tính đa dạng dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 Trần Đăng Kiên, Nông Văn Hải, Vũ Đức Quang, Trần Thị Vui, Đào thị Xuân Nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc có khả kháng sâu bệnh Báo cáo đề tài khoa học 1999 10 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Cơng nghệ 11 Lị Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê V Soybean Mosaic Virus 36 (1se), tr 283-292 12 , - , 115 (02), tr 111-115 13 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2008), Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A): 679-687 14 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265275 Tài liệu tiếng Anh 15 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: 161-165 16 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl Acad Sci USA 88:7887-7891 17 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis9 Berger, P.H., Adams, M.J., Barnett, O.W., Brunt, A., Hammond, J., Hill, J.H., Jordan, R.L., sion by aphids J Gen Virol 76:265-270 18 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 19 di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNAmediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 989-94 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 20 Fischhoff, D.A., Bowdish, K.S., Perlak, F.J., Marrone, P.G., MvCormick, S.M., Niedermeyer, J.G., Dean, D.A., Kusano-Kretzmer, K., Mayer, E.j., Rochester, D.E., Rogers, S.G and Fraley, R.T (1987) Insect tolerant tomatoplants Biotechnology 5:807-812 21 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., and Raccah, B 1992 A zucchini yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:2183-2187 22 Genetics and genomics of soybean, Springer, Gary Stacey, 2008 23 Hill, J (1999) Soybean mosaic Pp 70-71 In Hartman, G.L., Sinclair, J.B., and Rupe, J.C (eds.) Compendium of soybean diseases 4th edition APS Press St Paul, MN 24 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:20672077 25 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus J Gen Virol 72:1001-1003 26 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 27 Kota, M., Daniell, H., Varma, S., Garczynski, S.F., Gould, F and Moar, Ư.J (1999) Overexpression of the (BT)Cry2Aa2 protein in chloroplast confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects Proceedings of the National Academy of Scienes USA 96:840-1845 28 Liao, L., Chen, P., Buss, G.R., Yang, Q & Tolin, S.A (2002) Inheritance and allelism of resistance to Soybean mosaic virus in Zao18 soybean from China Journal of Heredity 93(6), 447-452 29 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 30 Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B., McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed, G., Biever, D and Fischhoff, D.A (1993) Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles Plant Molecular Biology 22:313-321 31 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 32 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 33 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319-20 34 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 35 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 36 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 37 Wang, A (2009) Soybean mosaic virus: research progress and future perspectives Proceedings of World Soybean Research Conference VIII (www.wsrc2009.chức năng), Beijing, China 38 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 39 Qiong H., Yanbing N., Kai Z., Yong L., Xueping Z (2011), “Virusderived transgenes expressing hairpin RNA give immunity to Tobacco mosaic virus and Cucumber mosaic virus”, Virology Journal, : 41 40 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 41 Zhang C., Song Y., Jiang F., Li G., Jiang Y., Zhu C., Wen F F (2012), “Virus resistance obtained in transgenic tobacco and rice by RNA interference using promoters with distinct activity”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 742-748 42 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 43 http://faostat.fao.org/ PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS( Mura Shige Skoog ,1962) MSI: Pha 1000ml, dùng lấy 20ml Stock STT THÀNH NỒNG ĐỘ PHẦN mg/ml GHI CHÚ Pha Stcok cho 50lit môi trường CaCl2 440 ( 440.50=22000mg) - Cân 22g hòa tan 1000ml H2O MSII: Pha 1000ml, dùng lấy 20ml Stock Pha Stcok cho 50lit môi trường KH2PO4 170 ( 170.50=8500mg) Cân 8,5g hòa tan 1000ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường KNO3 1900 ( 1900.50=95000mg) - Cân 95g hòa tan 1000ml H2O MgSO4.7H2 O Pha Stcok cho 50lit môi trường 370 ( 370.50=18500mg) - Cân 18,5g hòa tan 1000ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường NH4NO3 1650 (1650.50=82500mg) -Cân 82,5g hịa tan 1000ml H2O Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MS54: Pha 250ml, dùng lấy 5ml Stcok Pha Stcok cho 50lit môi trường H3BO3 6,2 (6,2.50=310mg) - Cân 0,31g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường KI 0,83 (0,83.50=41,5mg) - Cân 0.0415g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit mơi trường MnSO4.4H2O 22,3 (22,3.50=1115mg) - Cân 1,115g hịa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường ZnSO4.7H2O 8,6 (8,6.50=430mg) - Cân 0,43g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 10 CoCl2.H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 11 CUSO4.5H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 12 Na2MoO4.2H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hòa 250ml H2O 13 14 FeSO4.7H2O Na2 EDTA 27,8 Pha Stcok cho 50lit môi trường (27,8.50=1390mg) -Cân 1,390g hòa tan 250ml H2O 37,3 Pha Stcok cho 50lit mơi trường (37,3.50=1865mg) - Cân 1,865g hịa tan 250ml H2O Lưu ý : EDTA tan nước nóng nên pha cân cho vào bình tam giác với số lượng nhỏ tan hết hồn tồn sau cân FeSO4.7H2O vào hòa cùng) MSV: Pha 250ml, dùng lấy 5ml Stcok Pha Stcok cho 50lit môi trường 15 Glycine (2.50=100mg) - Cân 0,1g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 16 Thiamin HCl 0,1 (0,1.50=5mg) - Cân 0,005g hòa tan 250ml H2O Pyridocine 17 HCl Pha Stcok cho 50lit môi trường 0,5 (VitaminB6) (0,5.50=25mg) - Cân 0,025g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 18 Nicotinic acid 0,5 (0,5.50=25mg) - Cân 0,025g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trường 19 MyO- inositol 100 (100.50=5000mg) - Cân 5g hòa tan 250ml H2O ... cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9- 1 phục vụ tạo chuyển gen kháng virus? ?? Mục tiêu nghiên cứu Chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9- 1 tạo chuyển gen. .. RNAi tạo trồng chuyển gen kháng virus 1. 3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 12 1. 3 .1 Phương 13 pháp chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…………………………………… 13 16 18 viii... kháng virus khảm thuốc (TMV) kháng đồng thời loại virus 1. 3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ Chuyển gen biện pháp công nghệ ứng dụng để tạo dòng thuốc kháng virus Do hệ thống tái sinh thuốc