Nghiên cứu chuyển cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của smw vào giống thuốc lá c9 1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Nguy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo đ - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tậ - Tác giả luận văn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trƣờng tái sinh in vitro…………… 22 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số……………………… 25 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi 26 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CPi 27 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 9-1………………………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 ấu trúc hệ gen SMV Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi in vitro 11 - ……………………………………… 29 3.2 Các mảnh đƣợc ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens , mảnh sau rửa khuẩn đƣợc cấy môi trƣờng chọn lọc cụm chồi đƣợc tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trƣờng chọn lọc…………………………………… 31 , chồi màu xanh đƣợc tách môi trƣờng chọn lọc chồi chuyển gen sau tuần môi trƣờng tạo rễ………… ………………………………… 33 ………………………………………………………… 34 Hình 3.5 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ dịng thuốc chuyển gen…………………………………………………………… 35 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GW-SMV-CPi thuốc chuyển gen 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) cs Cộng ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trƣờng tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference dsRNA Double Stranded ribinucleic acid mRNA Messenger siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TMV Tobacco Mosaic Virus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence Region YEP Yeast extract peptone Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v MỤC LỤC vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG…… …… 1.1.2 Bệnh khảm virus đậu tƣơng …………………… 1.2 KỸ THUẬT RNAi 10 1.2.1 Cơ chế ức chế gen RNAi 10 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng virus 12 1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 13 1.3.1 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…………………………………… 13 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 21 2.2.2 Phƣơng pháp lây nhiễm tạo thuôc chuyển gen 21 2.2.3 Phân tích có mặt cấu trúc chuyển gen pK7GW-SMVCPi phƣơng pháp PCR……………………………… 24 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 in vitro …………………………………………… 28 3.2 Kết chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào thuốc 29 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 35 …………………………………… 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 34 lệ tạo đa chồi cao 70% Tuy nhiên, có số mảnh không mọc chồi chiếm 30% Từ cụm chồi chọn 127 cho vào mơi trƣờng rễ có bổ sung kháng sinh chọn lọc, số có số không rễ Kết thu đƣợc 30 cho môi trƣờng trấu : cát cuối 20 trồng nhà lƣới 3.4) 3.4 ên Cịn mẫu đối chứng ĐC1 khơng chuyển gen khơng cấy lên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc mà cấy lên môi trƣờng tạo đa chồi, kéo dài chồi mơi trƣờng rễ bình thƣờng thu đƣợc kết hầu hết cụm chồi đƣợc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 35 mọc lên mép mảnh Từ cụm chồi chọn 105 cho vào môi trƣờng rễ không bổ sung kháng sinh chọn lọc Kết thu đƣợc 15 cho môi trƣờng trấu:cát, sau số trồng nhà lƣới lại Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lƣới đƣợc khoảng 3-4 tuần tiến hành thu để thực phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Các mẫu non 20 dòng thuốc chuyển gen hệ T0 trồng nhà lƣới sau - tuần đƣợc để tách DNA tổng số Sau DNA tổng số đƣợc dùng làm khn để kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GWSMV-CPi thuốc chuyển gen phản ứng PCR Kết tách DNA tổng số đƣợc thể ảnh điện gel agarose 1% hình 3.5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20  Hình 3.5 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ dòng thuốc chuyển gen Trên ảnh điện di hình băng ADN tổng số 20 mẫu thuốc thu đƣợc gọn, có độ nguyên vẹn tinh cao Trƣớc tiến hành phản ứng PCR, DNA đƣợc pha lỗng nồng độ 50 ng/µl Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 Sự có mặt gen chuyển đƣợc kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/SMV-CPi-R, đoạn gen thu đƣợc có kích thƣớc 294 bp Vì số gen thƣờng so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR đƣợc thực với 35 chu kỳ Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% đƣợc thể hình 3.6 (-) (+) M 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 500 bp ~294 bp 250 bp Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu trúc pK7GW-SMV-CPi thuốc chuyển gen 1-20: 20 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-SMVCpi; (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) Kết thể hình 3.6 cho thấy, có 18/20 dịng thuốc dƣơng tính PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 294bp, tƣơng tự nhƣ kết mẫu đối chứng dƣơng Kích thƣớc hồn tồn phù hợp với CPi Vì vậy, khẳng định pK7GW-SMV -CPi đƣợc chuyển thành công vào thuốc cấu trúc 9-1 Gen ngoại lai đƣợc biến nạp vào tế bào tồn tế bào chủ trạng thái: (1) Tạm thời dạng DNA tự do; (2) tồn lâu dài dƣới dạng thể plasmid độc lập tự nhân; (3) tồn ổn định nhƣ đoạn DNA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 hệ gen tế bào chủ đƣợc nhân lên theo dạng tƣơng hợp hay không tƣơng hợp Kết dƣơng tính với PCR bƣớc đầu giúp đầu kiểm tra xem gen đƣợc chuyển vào hay không Tuy nhiên, PCR dƣơng tính nhƣng chƣa thể khẳng định xem gen có hoạt động tồn đƣợc qua nhiều hệ hay khơng [2], [10] có nhiều cách giải thích tồn DNA mẫu phân tích : (i) Vi khuẩn A tumefaciens mang gen tồn khối mô hay gian bào mẫu phân tích Hiện tƣợng xuất nhiều đối tƣợng Nếu mẫu phân tích thực vật qua nhân giống hữu tính, tức qua hệ T1, T2 dƣới dạng hạt ; (ii) Gen chuyển tồn tự tế bào chất, hồn tồn biến qua sinh sản hữu tính; (iii) Gen chuyển không hoạt động, tức không đƣợc biểu thành protein có chức sinh học [2] virus (2007) khảm thuốc lá) (virus RNAi Các giống thuốc vector K326 Longjiang 911 đƣợc chuyển gen thông qua A.tumefaciens biểu real-time PCR cho thấy TMV 326 911 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 38 90% [40] Thơng kẹp tóc cDNA gen CP virus khoai tây ( kháng PVY 83,54% [41] [31], [39]… CMV (Cucumber mosaic virus 84,1%, ng TMV đồng thời hai loại virus (Tobacco mosaic virus) 74,5% 70,8% [7], [8], [13] Tuy nhiên, nhóm tác giả TMV CMV thấy tỷ lệ kháng bệnh dòng chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen đƣợc lựa chọ 7GW-SMV-CPi v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 1.1 9-1 , in vitro p 1.2 C RNAi pK7GW-SMV-CPi - A tumefaciens 1.3 h sau Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Cơng nghệ chuyển gen, Nxb Đại học Sƣ phạm, Huế Trần Văn Điển (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011) Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam: 316 – 326 Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004) Đánh giá tính đa dạng dịng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 Trần Đăng Kiên, Nông Văn Hải, Vũ Đức Quang, Trần Thị Vui, Đào thị Xuân Nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc có khả kháng sâu bệnh Báo cáo đề tài khoa học 1999 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 10 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Cơng nghệ 11 Lị Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê V Soybean Mosaic Virus 36 (1se), tr 283-292 12 , - , 115 (02), tr 111-115 13 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2008), Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dƣa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A): 679-687 14 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265275 Tài liệu tiếng Anh 15 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: 161-165 16 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl Acad Sci USA 88:7887-7891 17 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis9 Berger, P.H., Adams, M.J., Barnett, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 O.W., Brunt, A., Hammond, J., Hill, J.H., Jordan, R.L., sion by aphids J Gen Virol 76:265-270 18 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 19 di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNAmediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 989-94 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 20 Fischhoff, D.A., Bowdish, K.S., Perlak, F.J., Marrone, P.G., MvCormick, S.M., Niedermeyer, J.G., Dean, D.A., Kusano-Kretzmer, K., Mayer, E.j., Rochester, D.E., Rogers, S.G and Fraley, R.T (1987) Insect tolerant tomatoplants Biotechnology 5:807-812 21 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., and Raccah, B 1992 A zucchini yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:2183-2187 22 Genetics and genomics of soybean, Springer, Gary Stacey, 2008 23 Hill, J (1999) Soybean mosaic Pp 70-71 In Hartman, G.L., Sinclair, J.B., and Rupe, J.C (eds.) Compendium of soybean diseases 4th edition APS Press St Paul, MN 24 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:20672077 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 25 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus J Gen Virol 72:1001-1003 26 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 27 Kota, M., Daniell, H., Varma, S., Garczynski, S.F., Gould, F and Moar, Ƣ.J (1999) Overexpression of the (BT)Cry2Aa2 protein in chloroplast confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects Proceedings of the National Academy of Scienes USA 96:840-1845 28 Liao, L., Chen, P., Buss, G.R., Yang, Q & Tolin, S.A (2002) Inheritance and allelism of resistance to Soybean mosaic virus in Zao18 soybean from China Journal of Heredity 93(6), 447-452 29 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 30 Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B., McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed, G., Biever, D and Fischhoff, D.A (1993) Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles Plant Molecular Biology 22:313-321 31 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 32 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 33 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319-20 34 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 35 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 36 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 37 Wang, A (2009) Soybean mosaic virus: research progress and future perspectives Proceedings of World Soybean Research Conference VIII (www.wsrc2009.chức năng), Beijing, China 38 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 39 Qiong H., Yanbing N., Kai Z., Yong L., Xueping Z (2011), “Virusderived transgenes expressing hairpin RNA give immunity to Tobacco mosaic virus and Cucumber mosaic virus”, Virology Journal, : 41 40 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 41 Zhang C., Song Y., Jiang F., Li G., Jiang Y., Zhu C., Wen F F (2012), “Virus resistance obtained in transgenic tobacco and rice by RNA interference using promoters with distinct activity”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 742-748 42 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 43 http://faostat.fao.org/ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÔI TRƢỜNG MS( Mura Shige Skoog ,1962) MSI: Pha 1000ml, dùng lấy 20ml Stock STT THÀNH NỒNG ĐỘ PHẦN mg/ml GHI CHÚ Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng CaCl2 440 ( 440.50=22000mg) - Cân 22g hòa tan 1000ml H2O MSII: Pha 1000ml, dùng lấy 20ml Stock Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng KH2PO4 170 ( 170.50=8500mg) Cân 8,5g hòa tan 1000ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng KNO3 1900 ( 1900.50=95000mg) - Cân 95g hòa tan 1000ml H2O MgSO4.7H2 O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 370 ( 370.50=18500mg) - Cân 18,5g hòa tan 1000ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng NH4NO3 1650 (1650.50=82500mg) -Cân 82,5g hịa tan 1000ml H2O Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MSIII: Pha 250ml, dùng lấy 5ml Stcok Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng H3BO3 6,2 (6,2.50=310mg) - Cân 0,31g hịa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit mơi trƣờng KI 0,83 (0,83.50=41,5mg) - Cân 0.0415g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng MnSO4.4H2O 22,3 (22,3.50=1115mg) - Cân 1,115g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng ZnSO4.7H2O 8,6 (8,6.50=430mg) - Cân 0,43g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 10 CoCl2.H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 11 CUSO4.5H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hịa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit mơi trƣờng 12 Na2MoO4.2H2O 0,025 (0,025.50=125mg) - Cân 0,00125g hòa 250ml H2O Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MSIV: Pha 250ml, dùng lấy 5ml Stcok 13 14 FeSO4.7H2O Na2 EDTA 27,8 Pha Stcok cho 50lit mơi trƣờng (27,8.50=1390mg) -Cân 1,390g hịa tan 250ml H2O 37,3 Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng (37,3.50=1865mg) - Cân 1,865g hòa tan 250ml H2O Lƣu ý : EDTA tan nƣớc nóng nên pha cân cho vào bình tam giác với số lƣợng nhỏ tan hết hồn tồn sau cân FeSO4.7H2O vào hòa cùng) MSV: Pha 250ml, dùng lấy 5ml Stcok Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 15 Glycine (2.50=100mg) - Cân 0,1g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 16 Thiamin HCl 0,1 (0,1.50=5mg) - Cân 0,005g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng Pyridocine 17 HCl 0,5 (VitaminB6) (0,5.50=25mg) - Cân 0,025g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 18 Nicotinic acid 0,5 (0,5.50=25mg) - Cân 0,025g hòa tan 250ml H2O Pha Stcok cho 50lit môi trƣờng 19 MyO- inositol 100 (100.50=5000mg) - Cân 5g hòa tan 250ml H2O Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... chuyển gen Xuất phát từ lí tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9- 1 phục vụ tạo chuyển gen kháng virus? ?? Mục tiêu nghiên cứu Chuyển đƣợc cấu. .. cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi SMV vào giống thuốc C9- 1 tạo đƣợc chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh giống thuốc C9- 1; (2) Tái sinh tạo thuốc. .. thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng virus 12 1. 3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 13 1. 3 .1 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…………………………………… 13 16 Số