Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)

Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV ( Luận án tiến sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi, số kết cộ Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần đƣợc cơng bố Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ đồng tác giả, phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ ững ý kiến quý báu tận tình giúp đỡ tơi q trình tiến hành thí nghiệ ề tài luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K & Nhân văn miền núi tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành khố học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị bạn bè động viên, khuyến khích, giúp đỡ tơi, ln quan tâm chỗ dựa cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn - Tác giả Lê Thị Hồng Trang Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………… ii MỤC LỤC……………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………… ………………… v DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………… viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 1.1 Cây đậu tƣơng……………………………………………………… 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm nông sinh học đậu tƣơng…………… 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới nƣớc……… 1.2 Bệnh khảm virus gây bệnh khảm SMV, BYMV……………… 10 1.2.1 Bệnh khảm đậu tƣơng…………………………………………… 10 1.2.2 Virus gây bệnh khảm SMV BYMV………………………… 11 1.3 Kỹ thuật RNAi…………………………………………………… 12 1.3.1 Cơ chế ức chế gen kỹ thuật RNAi…………………………… 12 … 14 ………… 16 1.4.1 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen vào mơ đích………… 16 1.4.2 Chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens ………………… 17 1.4.3 Hệ thống tái sinh hệ thống chọn lọ 1.4.4 ……… 19 22 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………… 24 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ………………………… 24 24 ………………………………………………………… 2.1.3 Thi 25 25 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………… 26 2.2.1 Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp…………… 26 2.2.2 Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách mầm……………………… 27 2.2.3 Phƣơng pháp tái sinh đậu tƣơng từ nách mầm…………… 28 2.2.4 Phƣơng pháp lây nhiễm tạo đậu tƣơng chuyển gen……… 28 2.2.5 Phân tích đậu tƣơng chuyển gen…………………………… 32 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen…………………… 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 KẾT QUẢ TẠO A TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)…………………………………… 35 3.2 …… 37 3.3 TƢƠNG 41 3.3.1 Tái sinh in vitro chuyể 41 giống đậu tƣơng ĐT12 DT2008 3.3.2 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 CƠNG 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine Bp Base pair (cặp base) BYMV Bean yellow mosaic virus CCM Cocultivation medium CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO (Tổ chức lƣơng thực nông nghiệp liên hợp quốc) GA3 Gibberellic acid GM Mơi trƣờng nảy mầm gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Km Kanamycin Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng theo Murashige Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid PCR Polymerase chain reaction RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference SIM Môi trƣờng tạo chồi SEM Môi trƣờng kéo dài chồi siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u T0,T1 Các hệ đậu tƣơng chuyển gen T0 Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 Vir Virulence Region v/p Vòng/phút YEP Yeast extract peptone Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới từ năm 2008 đến 2012………………………………………………………… ậu tƣơng củ Bảng 1.2 nƣớc đứng đầu giớ ố 2010, 2011, 2012 Bảng 1.3 Sản xuất đậu tƣơng Việt Nam từ 2007 – 2013…………… Bảng 2.1 Thành phần loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………… 29 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số………………………… 32 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng nghiên cứu 33 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng phƣơng thức gây tổn thƣơng nách mầm đến khả tạo đa chồi…………………………………… Bảng 3.2 - 38 A tumefaciens …………………………………………… 43 Bảng 3.3 Khả phát sinh chồi, kéo dài chồi khả rễ hai giống ĐT12 DT2008 trình chuyển gen Bảng 3.4 Số hóa Trung tâm Học liệu 44 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen SMV………………………………… 11 Hình 1.2 Cơ chế RNA can thiệp……………………………………… 13 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh chuyển gen vào đậu tƣơng… 30 Hình 3.1 Kết điệ ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc…………………………………………………… Hình 3.2 36 37 Hình 3.3 Kết gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách mầm phƣơng thức khác hai giống ĐT12 DT2008…… 39 Hình 3.4 Kết tái sinh chuyển gen giống đậu tƣơng ĐT12 DT2008 42 Hình 3.5 Kết tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi đƣa giá thể… 45 số tách từ Hình 3.6 Đ 2008 46 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấ Hình 3.7 ậu tƣơng chuyể - 12 47 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu Hình 3.8 trú chuyể ậu tƣơng - 2008 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 ... NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN... ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi loại trồng quan trọng khác [55] lựa chọn đề tài: Tạo đậu Xuất phát từ lý tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi hai loài SMV BYMV Mục tiêu nghiên... (hairpin RNA, hpRNA) chuyển gen kích thích chế RNAi hoạt động có xâm nhập virus vào Nhiều giống trồng kháng đƣợc loại bệnh virus khác đƣợc tạo RNAi, nhƣ đậu tƣơng chuyển gen kỹ thuật chuyển gen