Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

MỞ ĐẦU Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng.

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên, Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, ThS Phạm Thị Vân cùng tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu trong suôt quá trình hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè nhứng người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2011

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid Bp Base pair

dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate LB Luria and Bertani

PCR Polymerase Chain Reaction

IAA Indolaxetic Acid

NAA α- naphthalenneacetic Acid

X-gluc 5-bromo-4- chloro-3- indolyl glucuronide EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid

MỞ ĐẦU

Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng Vì vậy, thuốc lá là một trong những đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tượng chuyển gen

Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá sợi vàng Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus) và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra Trong đó, TMV loại virus có phổ ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật được mô tả sớm nhất ở nước ta

Những phương pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá như sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng ) Tuy nhiên, những biện pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hưởng xấu tới môi trường

Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực vật

Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã được lựa chọn cho nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào giống thuốc lá

C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen

mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bước đầu phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp PCR

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ

1.1.1 Phân loại

Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana.sp thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana Trong chi Nicotiana có 50-70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta phân chia thành 4 loại chính:

- Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tươi Đây là loại

phổ biến nhất chiếm 90% diện tích thuốc lá trên thế giới

- Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích thuốc

lá trên thế giới

- Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng , phớt hồng hay tím

Thường chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồ n dự trữ gen cho lai tạo, ít được dùng trong sản xuất

- Loài Nicotiana polidiede L : có hoa màu trắng Loài này cũng ít được

dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số quốc gia

Hình 1.1: Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)

Trên thế giới cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ.Tại Việt Namcây thuốc lá được canh tác từ Bắc chí Nam, chủ yếu ở các tỉnh sau: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Dak Lak (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam)

1.1.2 Giá trị của cây thuốc lá

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có

tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư

nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [10], [15].Trồng thuốc lá có hiệu quả cao hơn nhiều so với các loại cây trồng khác (1000- 1200 USD/ tấn lá khô) [8] Các hãng sản xuất thuốc lá của các nước tư bản đều nhận được nguồn lợi nhuận khổng lồ từ cây thuốc lá

Ở nước ta, cây thuốc lá cũng mang lại giá trị kinh tế cao, sử dụng hiệu quả đất đai, góp phần tạo công ăn việc làm, tận dụng được nguồn lao động của địa phương, tăng thu nhập cho người lao động Lợi nhuận cao từ sản xuất thuốc lá đã sự quan tâm của nhiều cấp chính quyền trong cả nước, tại một số tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, cây thuốc lá đã nằm trong cơ cấu cây trồng truyền thống, thực sự mang lại hiệu quả kinh tế cao

Tại An Giang nhờ vào cây thuốc lá nên giải quyết được khoảng 200 lao động với thu nhập trung bình 30.000- 40.000 đồng/ ngày [49]

Năm 2010, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam đạt kim ngạch xuất khẩu trên 175 triệu USD, tăng 17% so với năm 2009 Xuất siêu gần 54 triệu USD, nộp ngân sách vượt mốc 5.000 tỉ đồng, tăng 6% so với năm 2009 [47] Đời sống, việc làm và thu nhập của người lao động được bảo đảm ổn định

Đối với ngành công nghệ sinh học cây thuốc lá được sử dụng như thực vật mô hình cho những nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng nhờ khả năng dễ dàng

tiến hành nuôi cấy in vitro và chuyển gen [26]

1.1.3 Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam

Là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao hiện thuốc lá được trồng ở nhiều địa phương trong cả nước Diện tích trồng thuốc lá năm 2008 khoảng 25.000 ha Theo định hướng của chính phủ, dự kiến diện tích trồng thuốc lá năm 2010 là 39.200 ha và phát triển ổn định tới năm 2020 là 40.300 ha [50] Theo đánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của

nước ta có chất lượng tương đối tốt, có thể thay thế được nguyên liệu Trung Quốc Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá là đơn vị đi đầu trong nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá đã phát triển sản xuất đại trà các giống thuốc lá K326, C9-1, K176 đồng thời sản xuất thử nghiệm thành công một số giống lai như VTL1H, VTL5H tại vùng núi phía Bắc (theo báo cáo Văn phòng chương trình KC06) hay khảo nghiệm một số giống như RGH04, PVH09, PVH51 trên khu vực đất cát ở Gia Lai Những nghiên cứu của Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá cho thấy sự quan tâm của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam trong công tác phát triển giống mới nhằm thúc đẩy sự phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại nước ta Đặc thù của sản xuất thuốc lá điếu là phải có sự phối trộn nhiều loại nguyên liệu thuốc lá từ các vùng khác nhau để tạo nên tính phong phú của sản phẩm Hàng năm, ngành thuốc lá vẫn phải nhập khẩu một lượng đáng kể nguyên liệu từ các nước trên thế giới và nguyên liệu trong nước cũng được xuất khẩu với số lượng đến chục ngàn tấn Sản xuất thuốc lá vẫn là một lĩnh vực kinh tế cần thiết khi ngành thuốc lá Việt Nam đóng góp cho ngân sách Nhà nước trên bảy ngàn tỷ đồng mỗi năm Hút thuốc lá có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng nên nhà nước có chủ trương hạn chế sản xuất thuốc lá điếu cho tiêu thụ nội địa Hiện nay thuốc lá nguyên liệu sản xuất trong nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu cho các nhà máy thuốc điếu, mặt khác nhu cầu nguyên liệu cho xuất khẩu khá lớn nên Chính phủ khuyến khích phát triển sản xuất nguyên liệu trong nước Chiến lược phát triển Ngành thuốc lá Việt nam đến năm 2020 đã được Chính phủ phê duyệt, trong đó nhấn mạnh chủ chương phát triển thuốc lá nguyên liệu để hạn chế nhập khẩu, tăng cường xuất khẩu, tạo công ăn việc làm và nâng cao hiệu quả kinh tế cho nhà nông [50] Vùng trồng thuốc lá của Việt Nam tập trung chủ yếu tại các tỉnh miền núi, nên việc phát triển trồng thuốc lá tại đây sẽ hiện thực hoá chủ trương của Đảng và Nhà nước “Xóa đói, giảm nghèo” cho đồng bào các dân tộc miền núi Chín tỉnh trồng thuốc lá tập trung tại Việt Nam (gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái

Nguyên, Bắc Giang, Gia Lai, Đắc Lắc, Ninh Thuận Bình Thuận và Tây Ninh) do tổng công ty hỗ trợ phát triển đã chiếm hơn 90% diện tích vùng trồng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam Trong những năm qua, Tổng công ty cũng đã không ngừng mở rộng thị trường xuất khẩu thuốc lá nguyên liệu và thuốc điếu với giá trị kim ngạch xuất khẩu năm 2008 đạt trên 80 triệu USD

1.2.1 Bệnh virus trên cây thuốc lá

Trong sản xuất nông nghiệp thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất lớn Đối với cây hàng năm, sự thiệt hại thể hiện qua việc giảm năng suất hoặc gây mất mùa toàn bộ trong vụ Đối với cây lâu năm, cây thân gỗ bệnh virus không những làm giảm chất lượng và năng suất ngay đối với cây bị nhiễm bệnh mà, mà còn có nguy cơ lây lan cho các cây khỏe mạnh những năm sau [1] Hiện nay, có khoảng hơn 2000 loại virus thực vật đã được phát hiện và nghiên cứu, trong số đó khoảng một nửa là nh ững loài gây hại chính cho cây trồng Mức độ thiệt hại do các bệnh virus gây ra cho cây trồng là rất nghiêm trọng, có thể lên tới 95 - 100% Sự thiệt hại không những chỉ dừng ở mức độ suy giảm về năng suất mà còn ảnh hưởng cả đến chất lượng sản phẩm thu hoạch [2]

Riêng đối với cây thuốc lá thiệt hại về kinh tế do virus gây ra ở thuốc lá khá lớn lên tới hàng chục tỷ đồng [40] Bệnh virus không những làm giảm năng suất, chất lượng cây thuốc lá, mà còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống [3]

Một số loại bệnh virus trên cây thuốc lá

Bảng 1.1: Bệnh virus trên thuốc lá [52]

Tên bệnh Tên virus gây bệnh

Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus( virus khảm linh lăng)

Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus ( virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần)

Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá)

Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dưa chuột)

Vàng hoại tử rau diếp

Vàng hoại tử rau diếp(trong Nicotiana glutinosa)

Còi cọc cây lạc Peanut stunt virus Bệnh hình hoa

lá

Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)

Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)

Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá)

Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua)

Viền gân lá Potato virus ( virus Y khoai tây)

U vết thương Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thương)

1.2.2 Bệnh khảm lá do virus

Bệnh khảm lá do virus gây ra là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của lá thuốc, nhất là đối với thuốc lá sợi vàng Bệnh còn có tên là bệnh “hoa lá vàng” Bệnh nặng và phân bố rộng ở nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm [3]

Bệnh xuất hiện càng sớm thì càng ảnh hưởng đến năng suất, tỉ lệ phục hồi hoàn toàn khá thấp (2,3- 5,2%) Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thường bị tác hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy, lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng

Biểu hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại biến thành dạng khảm Trên bề mặt của lá có biểu hiện của các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt Ngoài ra còn có các biểu hiện khác như: phiến lá nhăn nheo, lồi lõm do các gân lá bị kìm hãm sinh trưởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thước lá bị thu nhỏ lại

Ngoài đồng, đôi khi cây bệnh ở dạng tiềm ẩn (không biểu lộ triệu chứng ra ngoài) ở các mức độ khác nhau [3]:

 Ẩn bệnh toàn phần: cây hoàn toàn không biểu lộ triệu chứng;

 Ẩn bệnh cục bộ: chỉ có vài triệu chứng ở lá ngọn nhưng không tiêu biểu lắm;

 Ẩn bệnh tạm thời: chỉ biểu lộ triệu chứng ở giai đoạn sau của bệnh;

 Ẩn bệnh vĩnh viễn: không biểu lộ triệu chứng trong suốt giai đoạn cây phát triển

Do TMV cần thời gian ủ bệnh tương đối dài nên hiện tượng ẩn bệnh có thể giải thích do do cây bị nhiểm bệnh vào giai đoạn trưởng thành nên TMV không kịp gây ra triệu chứng Tuy nhiên năng suất và phẩm chất thuốc vẫn bị ảnh hưởng nghiêm trọng Chỉ có thể phát hiện được cây ẩn bệnh bằng phương pháp phản ứng huyết thanh Ngoài ra, trong điều kiện nóng (>30o

C), cây cũng dễ bị mất triệu chứng

Hình 1.2: Bệnh khảm lá trên cây thuốc lá

TMV và CMV là hai loại virus gây bệnh khảm phổ biến và nghiêm trọng nhất cho cây thuốc lá hiện nay

CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromovirus Đây là virus thực vật có phổ cây bệnh rộng nhất với khoảng trên 1000 loài cây khác nhau [29].Virus có dạng hình tròn kích thước 28- 30mm, CMV lây lan qua vật chủ trung gian chủ yếu là qua rệp Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dương (RNA1, RNA2 và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF)

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome CMV

Các chủng CMV đã được phân chia thành hai nhóm I và II dựa vào huyết thanh học [42] [22], lai acid nucleic [50], trình tự gen [27] Phân nhóm I và II có mối quan hệ khá xa nhau và genmon của chúng chỉ có 75% nucleotid tương đồng Trong đó phân nhóm I lại được chia thành IA và IB, độ tương đồng của chúng lên tới 92%-95% [29] [31] Các chủng CMV phân nhóm IA và II xuất hiện hầu như khắp thế giới trong khi các chủng CMV phân nhóm IB chủ yếu có mặt ở Châu Á [21] [9]

Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thường xuyên hơn RNA1 và RNA2 [31] Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh giá bảng đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinhc ủa chủng CMV

TMV thuộc loại Tobamovirus, phổ ký chủ virus TMV có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật được mô tả sớm nhất ở nước ta Đây là một trong những virus gây bệnh thực vật được mô tả sớm nhất bởi

Mayer (1886), Iwanowshi (1882), Allard (1914), Stanley (1935) Ở Việt Nam, có thể có hai dòng TMV chủ yếu: dòng mạnh và dòng yếu Dòng mạnh sẽ làm cây biến dạng nhiều, thường lá có dạng sợi chỉ Dòng yếu làm cây biến dạng ít hơn, thường chỉ gây khảm lá Bệnh có thể mất triệu chứng ở thấp hơn 11˚ C hoặc cao hơn 37˚C [4]

Virus TMV là virus đơn dương (ssRNa) có hình cuộn xoắn, dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị capsid ( capsomeres), cứ 16 capsomeres tạo thành một vòng xoắn Mỗi capsomeres có 158 amino acid và có trọng lượng 1800 Daltons Virion có chiều dài 300 mm và đường kính là 18mm [34] TMV là virus RNA đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn [9]

Hình 1.4: Hình ảnh hiển vi virus TMV

Hình 1.5: Sơ đồ cấu trúc genome của TMV

RdRp: replicase; CP: protein vỏ; helicase: enzyme liên quan tới quá trình duỗi xoắn;

MP: protein vận chuyển Chiều mũi tên thể hiện chiều dịch mã

Virus TMV xâm nhiễm vào cây thông qua con đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào thông qua vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ mà không qua côn trùng TMV có độ bền vững cao đối với nhiệt độ Đa số TMV bị mất hoạt tính ở 90-100oC trong 10 phút, nhưng vẫn còn một số rất ít TMV tồn tại và chúng còn khả năng gây bệnh tùy theo chủng [4] 1.3 BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC

Bện virus là bệnh khó phòng chống, chúng không thể tiêu diệt xử lý bằng các chất hóa học như những bệnh nấm, vi khuẩn hay sâu bọ Hiện nay đã có rất nhiều phương pháp được đưa ra nhằm chống lại bệnh virus như:

1.3.1 Sử dụng giống kháng bệnh:

Sử dụng các loại giống đã được nghiên cứu có thể kháng lại những virus gây bệnh Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được cây sạch bệnh Tuy nhiên hạn chế của biện pháp này đó là số lượng biện pháp g ặp nhiều hạn chế về số lượng giống kháng bệnh cũng

6,395 nt

MP

Helicase

như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống

1.3.2 Sử dụng giống sạch bệnh

Giống sạch bệnh thu từ cây thuốc lá khỏe chọn giống chống bệnh bằng cách lai với các giống thuốc lá dại.Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng Nhược điểm của biện pháp này là các loại cây trồng có thể bị nhiễm virus trong quá trình canh tác trên đồng ruộng

1.3.3 Các biện pháp canh tác

 Luân canh: nên luân canh với lúa (thuốc lá - luá - lúa - thuốc lá) vì trong điều kiện ngập nước, phần lớn TMV sẽ bị tiêu diệt Tránh độc canh hoặc luân canh với cây trồng cạn

 Vệ sinh đồng ruộng: làm sạch cỏ dại, thiêu hủy xác cây bệnh trước và sau khi thu hoạch, phát hiện bệnh sớm và thiêu hủy cây bệnh, , cẩn thận khi tiếp xúc với cây bệnh Không nên để vụ thuốc tái sinh ở những ruộng bị nhiễm bệnh[51]

- Phòng trị bệnh cho cây con ở vườn ươm: đây là biện pháp có hiệu quả kinh tế cao Chọn đất sạch mầm bệnh để làm vườn ươm, cách xa ruộng sản xuất đại trà Chỉ chọn cây con không bệnh đem đi trồng

- Sử dụng các biện pháp kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh: các loại rệp, bọ trĩ

1.3.4 Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học

Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này [14] Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phương pháp CP tạo cây trồng kháng virus Phương pháp này đã được áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm [21] Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus thường khá cao [32]

Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector

chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây

chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen [38] Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY [43][33]cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [18], Tobacco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY[35], Tomato yellow leaf curl virus TYLCV [46]Rice tungro bacilliform virus RTBV, African cassava mosaic virus ACMV [41] … Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây

Người ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất[33][44] Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu

chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng

lên đến 93% Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự [ 26] đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh[19]

Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus

Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh được sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau như: các cấu trúc của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang được quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi

1.3.4.1 Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus

1.3.4.2 Cơ chế hoạt động của RNAi

RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA Ở thực vật có ba con đường ức chế RNA trong đó con đường đầu tiên là sự

ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering RNA) được sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là con đường quan

trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA kép hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp Trong trường hợp virus DNA, dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp [13] Cơ chế cũng xảy ra tương tự như ở động vật Khi có sự xâm nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide, gọi là siRNA Sau đó, các siRNA kép hình thành được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ RISC Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA này Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tương đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’ Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuclease

[16] (Hình 1.6)

Hình 1.6: Cơ chế hoạt động RNAi

1.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS Lê Trần Bình và PTS Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện

KH&CN Việt Nam được tiến hành trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus”

là đã tạo được các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự [7] (Phòng Công

Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học) đã tạo được dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV với tỷ lệ 74,5% và kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV với tỷ lệ 70,8%[7] Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi trong việc tạo giống cây trồng kháng virus

Kỹ thuật RNAi cũng đã được tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng điểm cấp nhà nước thuộc chương trình phát triển công nghệ sinh học (KC04-03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng bệnh virus Đề tài đã được nghiệm thu cấp nhà nước trong tháng 9/2010 Một trong những kết quả đạt được của đề tài là đã tạo ra được các dòng đu đủ chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng

Bên cạnh cây trồng chuyển gen kháng virus cũng đã có rất nhiều thành công trong việc tạo cây có khả năng kháng bệnh cây trồng, kháng vi khuẩn, kháng côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi mang lại hiểu quả kinh tế cao[6] Tất cả đang mở ra một thời kì mới cho nền nông nghiệp Việt Nam

CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1.Vật liệu thực vật

Hạt giống thuốc lá C9-1 do công ty TNHH Một thành viên KTKT thuốc lá lai tạo

2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen:

Hình 2.1 Vector pCB_GUS

2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng

- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Glucose, Trypton, KCl, EDTA, MgCl2, NaOH Các loại kháng sinh : kanamycin, rifamycine, cefotaxime, streptomycine, spectinmycine Các chất điều hòa sinh trưởng như: BAP, NAA, và các hóa chất thông dụng của các hãng Fermentas, Invitrogen, Mecrck, Sigma

- Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm: MS, môi trường lây nhiễm lỏng IM, môi trường tạo mô sẹo, môi trường tạo chồi, môi trường ra rễ và môi trưởng nuôi khuẩn LB Thành phần như trong phụ lục 1

- Máy móc và thiết bị: Buồng cấy vô trùng , máy đo pH, máy đo OD, tủ nuôi lắc, nồi khử trùng, máy ly tâm lạnh,máy điện di, cùng với các thiết bị khác của Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm:

2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo

Khử trùng toàn bộ dụng cụ trước thí nghiệm

Đặt cốc thủy tinh chứa 100ml Javen vào bình khử trùng Hạt thuốc lá được cho bình pyrex (dung tích 100ml) Bình Pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá Đậy kín bình khử trùng và dán parafin

Sau 4h lấy hạt đã khử trùng ra để trong box cấy 30 phút để bay hết khí rồi tiến hành gieo hạt

2.2.1.2 Gieo hạt

Gieo hạt vào môi trường MS (100 hạt/ bình)

Sau 4 ngày hạt bắt đầu nảy mầm Khi cây phát triển được 1 tuần, đánh giá tỉ lệ nảy mầm và cấy chuyển sang môi trường MS mới

2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens

2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium

có bổ sung các kháng sinh chọn lọc ( Cefotaxime 25mg/l, kanamycin 50mg/l

đối với chủng A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa câu trúc

pCB_GUS; Rifamycine 50mg/l, streptomycine 100mg/l, spectinomycine

100mg/l đối với chủng vi khuẩn A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa

cấu trúc TMV_RNAi) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ - Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc như khi nuôi ở môi trường LB đặc Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 28˚C nuôi qua đêm Lấy 0.5ml dịch huyền phù chuyển sang 50ml LB lỏng (không kháng sinh) nuôi phục hồi khuẩn trong vòng 4h Ly tâm 4000v/p trong 10p ở 4˚C và hòa tan trong dung dịch IM (MS, pH 5.8)

lỏng Sử dụng vi khuẩn A.tumerfaciens có mật độ đạt OD600=0.7 -1.0 để biến nạp

2.2.2.2 Tạo nguyên liệu chuyển gen

Chọn lá có kích thước vừa phải ở các cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương, tạo thành các mảnh lá có hình vuông kích thước khoảng 0,25 cm2

Lá bị tổn thương sau đó được đặt úp trong môi trường lây nhiễm IM để tránh bị khô

2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20 ml dung dịch IM có bổ sung

100µl dịch khuẩn Agrobacterium Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch

trên trong 30 có lắc nhẹ trong vòng 30 phút Sau đó đặt vào bình chứa môi trường MS,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8

Hình 2.3 : Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch IM có bổ sung dịch khuẩn

2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen

Sau 3 ngày chuyển các mảnh lá sang môi trường tạo chồi chứa MS, 1mg/l BAP,30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime

Sau 3- 4 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mảnh lá Tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trường MS, 30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime

2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh

Khi các xuất hiện các chồi và các chồi đạt chiều cao khoảng 2- 3 cm tiến hành tách các chồi nhỏ này và chuyển sang môi trường ra rễ ( MS + 0,1mg/l NAA, 30g/l glucose,8g/l aga, pH 5,8)

Sau 3 tuần các cây in vitro được đưa ra ngoài môi trường Cây non được

chuyển sang môi trường cát + trấu ( 50% trấu, 50% cát) và chuyển ra trồng trong nhà lưới

2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào

Thu mẫu từ các cây con sau 2 tuần phát triển trong nhà lưới Đối với những

cây được chuyển cấu trúc pCB_GUS, biểu hiện của gen gus được kiểm tra

bằng nhuộm trong dung dịch X-gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7; 10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-

100; 1,5mM glucuronide) Mẫu lá thuốc lá được ngâm trong dung dịch gluc và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37ᵒ C, thời gian ủ từ 24- 48 giờ

X-Sau thời gian ủ , mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu được đưa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát và chụp ảnh

2.2.4 Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương pháp PCR

ADN tổng số từ lá thuốc lá được tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

2.2.4.1 Tách chiết ADN tổng số

Tách ADN tổng số được tiến hành theo các bước sau:

(1) Lấy 100mg lá non (trong ống effendorf 1.5ml) nghiền trong nitơ lỏng cho tới khi thành dạng bột mịn

(2) Bổ sung 500µl dung dịch đệm (0,2M Tris-HCl pH9.0; 0,4M LiCl; 25mM EDTA pH8.0; 1%SDS) vào từng ống Ly tâm 13000 vòng/ phút, trong 5 phút

(3) Hút 350µl dịch trong ở phía trên ra từng ống effendol mới (4) Bổ sung 350µl isopropanol vào từng ống, mix đều

(5) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa

(7) Hòa tan ADN trong 40µl H2O deion

2.2.4.2 Thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri [8] với trình tự như sau:

TMV-Fi: 5’- CACCATGAAACCTTCACCACA-3’ TMV-Ri: 5’- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3’