Nghiên cứu tính mẫn cảm với một số thuốc trừ sâu của ấu trùng ruồi đục lá liriomyza sativae blanchard ở ba quần thể: Song Phương - Hà Nội, An Bình và Đình Tổ - Bắc Ninh

MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 II.1. MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN 3

MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ

Rau xanh là nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho cơ thể conngười

Tuy nhiên, hiện nay rau xanh đang đứng trước tình trạng bị nhiều loài côntrùng phá hoại, gây khó khăn cho công tác phòng trừ dịch bệnh trong đó có

loài ruồi đục lá Lyriomyza sativae Blanchard.

Hiện tượng côn trùng kháng thuốc được phát hiện lần đầu tiên vào năm1887 (Dẫn theo Babos Patts; 1951) Kể từ đó cho tới nay có nhiều loài khángthuốc ngày càng tăng và việc phòng trừ chúng gặp rất nhiều hết sức khó khăn.

Về phương diện sinh học, tính kháng thuốc trừ sâu là một hiện tượngtiến hóa sinh học ở mức độ quần thể có liên quan mật thiết tới các gen trongcơ thể chống thuốc, khi sinh vật tiếp xúc liên tục và lâu dài với thuốc bảo vệthực vật sẽ xảy ra quá trình chọn lọc Các cá thể mang gen kháng thuốc sẽđược chọn lọc và dẫn đến sức đề kháng tăng qua các thế hệ dưới áp lực chọnlọc của thuốc trừ sâu Trước khi tiếp xúc trực tiếp với thuốc trừ sâu tần sốalen kháng thuốc trong QT thường là thấp, sau nhiều thế hệ tiếp xúc vớithuốc làm cho tần số alen kháng thuốc trong QT tăng lên Tính kháng thuốccủa dịch hại lúc đầu là tăng từ từ, sau đó nhanh dần lên và cuối cùng tạoquần thể kháng mạnh.

Sử dụng thuốc hóa học là phương pháp cơ bản và có hiệu lực cao

trong việc phòng trừ sâu hại nói chung và ruồi đục lá Lyriomyza sativae

Blanchard nói riêng Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng quá mức các loại thuốchóa học như: sử dụng với cường độ và liều lượng quá cao, không đúng thờiđiểm, tần suất phun , đã làm tăng tính kháng thuốc ở sâu hại gây ra nhiềuhậu quả nghiêm trọng như: Làm giảm năng suất và chất lượng của nông sản,ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, để lại lượng lớn dư lượng thuốc

trừ sâu trong nông sản gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm, làm ảnh hưởngđến sức khỏe của con người, gây tâm lý bất an cho cộng đồng.

Để góp phần vào việc phòng trừ ruồi đục lá hại rau đậu có hiệu quả vàlàm cơ sở cho việc đề xuất một quy trình sử dụng hợp lý thuốc trừ sâu, ngănchặn sự gia tăng khả năng kháng thuốc của sâu hại và đảm bảo an toàn vệ sinhthực phẩm, cần phải đẩy mạnh nghiên cứu tính kháng thuốc của sâu hại và đưara được các phương pháp phòng trừ tối ưu có hiệu quả nhằm mang lại lợi íchcho con người mà vẫn đảm bảo sự cân bằng sinh thái ở mức cao nhất có thể

Xuất phát từ những vấn đề thực tế nêu trên chúng tôi đã lựa chọn tiếnhành thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU TÍNH MẪN CẢM VỚI MỘT SỐ TTS

CỦA ẤU TRÙNG RUỒI ĐỤC LÁ Liriomyza sativae Blanchard Ở BA QUẦN THỂ

SONG PHƯƠNG HÀ NỘI, AN BÌNH VÀ ĐÌNH TỔ BẮC NINH”

Mục đích nghiên cứu của đề tài:

Nhằm đánh giá độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở 3 quần thể tự

nhiên với 5 loại TTS, từ đó có cơ sở đưa ra những phương pháp sử dụng

TTS hợp lí giúp người nông dân phòng trừ hiệu quả được các loại sâu hại

Nội dung nghiên cứu của đề tài

1- Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu trên rau, đậu của các hộ nôngdân tại các địa điểm nghiên cứu.

2- Xác định độ mẫn cảm với 5 loại thuốc thuộc các nhóm khác nhau

của ấu trùng ruồi đục lá tuổi 1 tại 3 quần thể: Song Phương- Hà Nội, AnBình và Đình Tổ- Bắc Ninh.

3- Tạo dòng kháng với thuốc Sherpa 25EC của QT ruồi đục lá ở Song PhươngNhững đóng góp mới của luận văn này:

-Đánh giá độ mẫn cảm với một số loại TTS thông dụng của ấu trùng ruồiđục lá ở những quần thể tự nhiên tại những địa điểm nghiên cứu làm cơ sởcho biên pháp sử dụng TTS hợp lý

- Cung cấp thêm tư liệu về quá trình tạo dòng kháng, từ đó có thể giải thích

được sự hình thành một số quần thể sâu hại kháng TTS trong tự nhiên

Hay tính kháng thuốc là sự giảm sút tính mẫn cảm của quần thể sinhvật với một loại thuốc trừ dịch hại sau một thời gian dài quần thể này liên tụctiếp xúc với thuốc đó, khiến cho những loài này chịu được lượng thuốc lớncó thể tiêu diệt được hầu hết các cá thể cùng loài chưa chống thuốc Khảnăng này được di truyền qua đời sau, dù cá thể đời sau có hay không tiếp xúcvới thuốc (Who,1976) Điều này phân biệt hẳn với hiện tượng quen thuốccủa sâu bệnh vì tính quen thuốc không di truyền cho thế hệ sau [10]

I.1.2 Tính kháng chéo (Cross Resistance)

Tính kháng chéo là hiện tượng khi một nòi sâu bệnh hay côn trùng nàođó không những kháng với các hợp chất thuốc được sử dụng liên tục quanhiều thế hệ mà còn kháng được một hay nhiều hợp chất khác mà dòngkháng đó chưa hề tiếp xúc[8].

Hiện tượng kháng chéo xảy ra khi các hợp chất được sử dụng liên tụcvà các hợp chất chưa từng được sử dụng ở QT có cùng cơ chế kháng

I.1.3.Tính đa kháng (Multiple resistance)

Tính đa kháng là hiện tượng một nòi sâu bệnh hay côn trùng nào đótăng khả năng chịu đựng với nhiều loại thuốc trừ sâu Hiện tượng đa kháng

xảy ra là do nhiều cơ chế kháng khác nhau cùng tồn tại và hoạt động trongnòi kháng, tạo ra phổ kháng tương đối rộng cho từng nòi sâu hại Nòi đakháng được hình thành khi có phổ kháng với nhiều nhóm thuốc trừ sâu riêngbiệt sử dụng đồng thời hay liên tiếp trong một thời gian dài ở địa phương (8) * Để đánh giá mức độ kháng thuốc của sâu hại dựa vào chỉ số khángthuốc (Ri* -Resistance index):

Theo FAO: Ri* =

với Ri* >10 thì dòng đó kháng thuốc

với Ri* <10 dòng đó chỉ chịu đựng với thuốc

- Khi nghiên cứu tính kháng TTS của sâu tơ, do Việt Nam chưa có QTmẫn cảm để làm QT so sánh, vì vậy hai tác giả Tào Minh Tuấn và Đặng HữuLanh đã sử dụng chỉ số kháng Ri* * bằng cách so sánh giá trị LC95 và LKC(Ri* *

 ), các tác giả cho rằng khi Ri* * >50 thì QT sâu hại nghiêncứu mới có thể được coi là đã kháng với loại thuốc trừ sâu đó[7].

I.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG TTS Ở CÔN TRÙNG VÀRUỒI ĐỤC LÁ.

I.2.1 Trên thế giới

Tính kháng thuốc của sâu hại là hiện tượng phổ biến ở nhiều loài sinhvật, nhưng xuất hiện nhiều nhất là ở côn trùng và nhện

Hiện tượng kháng thuốc của côn trùng phát hiện đầu tiên vào năm1887 (Babos và Patts, 1951) Kể từ đó đến nay số loài kháng thuốc ngàycàng tăng Ban đầu hiện tượng kháng thuốc được phát hiện ở nhiều loài côntrùng và nhện và mới chỉ chống với một số thuốc Clo, lân hữu cơ, Carbamat,thì nay nhiều nhóm thuốc mới như Pyrethroid, các chất điều hòa sinh trưởngcôn trùng, các thuốc trừ sâu vi sinh vật cũng bị chống

Theo thống kê của FAO: đến năm 1970 đã có 224 loài côn trùng hình

thành tính kháng thuốc Đến năm 1980, con số đó đã tăng lên 428 loài và đếncuối năm 1989 tổng số loài chân khớp kháng thuốc là 504 loài trong đó 481loài gây hại kháng thuốc thì có đến 283 loài gây hại trong nông nghiệp(chiếm khoảng 58,8%) và 198 loài (chiếm khoảng 41,2%) gây hại cho ngườivà động vật [12] Như vậy chỉ trong khoảng mười năm, số loài chân khớpkháng thuốc đã tăng đáng kể (gần gấp đôi) Trong tổng số các loài chân khớpkháng thuốc, phần lớn thuộc bộ hai cánh (Diptera) với 177 loài chiếmkhoảng 35,1%, sau đó là Lepidoptera (74 loài, chiếm tỉ lệ 14,7%); Cleoptera(72 loài, chiếm 14,3%); Acarina (71 loài, chiếm tỉ lệ 14,1%) Số lượng nàyphần nào phản ánh áp lực chọn lọc của TTS hóa học đã được người nông dânsử dụng để diệt côn trùng gây hại [27]

Tính đến nay các nghiên cứu về tính kháng trên đối tượng ruồi đục lávới các thuốc trừ sâu chưa nhiều, mặc dù hiện tượng kháng thuốc trừ sâu củaruồi đục lá đã được đề cập cách đây đã khá lâu Năm 1980, Sharma và cộngsự đã đưa ra báo cáo đối với loài L.sativae đã trở nên khó phòng trừ ởCalifornia vì chúng đã rất kháng với một số loại TTS[27]

Hiện tượng kháng cao với một số nhóm thuốc trừ sâu Pyrethroid nhưPermethrin và Fenvarelate của nhiều quần thể ruồi L.sativae và L.triforlicũng đã được Manson và cộng sự (1987)[23] ghi nhận trên nhiều loài câytrồng ở Hawai Tác giả cũng chỉ ra rằng các quần thể của loài L.sativae vàL.triforli đã chống với với TTS từ trước khi hai loại thuốc Pyrithroid đượcdùng phổ biến ở Mỹ Như vậy Pyrithroid chỉ là nguyên nhân phụ hình thànhtính kháng ở hai loài ruồi này, mà nguyên nhân chính có thể từ sức ép trựctiếp của loại thuốc nhóm Clo hữu cơ được sử dụng rộng rãi ở địa phương từnhiều năm trước, vì DDT có thể gây nên tính kháng chéo ở các loài ruồi nàyvới nhóm thuốc Pyrithroid.

Đứng trước tình trạng tính kháng TTS của côn trùng ngày càng tăng, tổchức FAO và WHO năm 1963 đã thành lập các nhóm chuyên gia trên thế

giới chuyên nghiên cứu về vấn đề kháng thuốc của côn trùng để tìm ra biệnpháp khắc phục.

I.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về tính kháng TTS trên sâu hạichưa nhiều, cho đến thời điểm này thì đã có một số công trình nghiên cứutrên các đối tượng như: sâu tơ, rầy nâu, bọ phấn và ruồi đục lá

Trên đối tượng sâu tơ, năm 1967 các chuyên gia của FAO đã nhận định:Sâu tơ ở Việt Nam đã kháng cao với các TTS OP và Car như Dianizon,Malathion, Methomyl và Carbaryl [15]

Ở Quần thể Song Phương, theo tác giả Đặng Thị Thanh Mai (2002) đã kếtluận rằng sâu tơ ở quần thể này đã kháng cao với loại thuốc Sherpar 25EC [5] Nghiên cứu tính kháng TTS của bọ phấn ở cả hai địa điểm Vân Nội vàSong Phương tác giả Nguyễn Đình Thông (2006) đã kết luận: Ấu trùng bọphấn ở hai quần thể trên còn mẫn cảm với thuốc Padan 95SP, Selecron500EC và giảm tính mẫn cảm với thuốc trừ sâu Sherpar 25EC [9].

Trên đối tượng ruồi đục lá, một số công trình nghiên cứu như của TSLê thị Kim Oanh, Nguyễn Thị Ngọc, Trần Phan Hữu cho rằng ruồi đục lá làđối tượng sâu hại nghiêm trọng thuộc khu vực đồng bằng Sông Hồng Đâylà loài sâu hại đa thực có phổ ký chủ rộng gây hại trên hầu hết trên các loạirau xanh và cây trồng màu

Theo Lê Thị Kim Oanh (2003) thì ruồi đục lá tại Song Phương- HàTây nay thuộc Hà Nội và Vân Nội- Đông Anh- Hà Nội ở thời điểm nghiêncứu năm 2002 đã thể hiện tính kháng đối với thuốc có hoạt chấtcypermethrin tuy nhiên chưa thấy loài sâu hại này kháng với thuốcAbamectin, spinosad và Cyromazine

Do chưa có dòng mẫn cảm chuẩn tác giả đã dựa vào chỉ số kháng Ri*qua việc so sánh giữa tỉ lệ LC50của quần thể tự nhiên với LC50của quầnthể được cho là dòng mẫn cảm nhất với mỗi thuốc trừ sâu Cũng qua báo cáo

này tác giả cho thấy chỉ số kháng trong một năm ở các thời điểm khác nhaulà khác nhau.

Tác giả cũng tính chỉ số kháng Ri* * để đánh giá mức độ kháng củacác QT nghiên cứu

Với hai cách tính như trên thì tác giả Lê Thị Kim Oanh đã kết luận haiquần thể ruồi đục lá ở Song Phương và Vân Nội đã kháng với thuốc có hoạtchất Cypermethrin.

Theo Nguyễn Thị Ngọc (2002) cùng thời gian và địa điểm nghiên cứucũng có nhận xét tương tự Tuy nhiên ruồi đục lá ở những địa điểm nghiêncứu vẫn còn mẫn cảm cao với các loại thuốc Trigard 75WP, vertimec 1.8EC, Padan 95 SP và Selecron 500 EC.

Theo Trần Phan Hữu (2004) ấu trùng ruồi đục lá quần thể Vân Nội –Đông Anh và quần thể Song Phương Hà Tây nay thuộc Hà Nội cũng dùngphương pháp như trên khảo nghiệm với 4 loại thuốc và cũng dựa vào cáchtính chỉ số kháng Ri* , Ri* * với liều khuyến cáo, tác giả đã rút ra nhận xét ởcác quần thể nghiên cứu vẫn còn mẫn cảm với 4 loại thuốc nghiên cứu làvertimex 1.8EC; Confidor 100SL Success 25EC và Sherpar 25EC Đối vớiquần thể Song Phương mẫn cảm với 3 loại thuốc, nhưng độ mẫn cảm đãgiảm sút đáng kể đối với Sherpar 25EC (Cypermethrin)

Và tác giả Mai Thị Thuỷ (2006) cũng nghiên cứu về tính kháng ở 3quần thể ruồi đục lá Song Phương, Vân Nội và Hải Phòng cũng đã đưa rakết luận là đối với quần thể Song Phương đã thể hiện tính kháng với thuốctrừ sâu Sherpar 25EC.

I.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC TÍNH KHÁNG TTS ỞCÔN TRÙNG

Hiện nay đã có nhiều tài liệu bàn luận về sự di truyền tính kháng với mỗiloại thuốc trừ sâu Trong đó có một số nghiên cứu di truyền tính kháng trênsâu tơ và một số đối tượng khác đối với TTS sinh học BT, TTS phethoate và

fenvalare của một số tác giả trên thế giới sẽ được chúng tôi tham khảo

1.3.1 Nghiên cứu di truyền tính kháng với nhóm TTS Bacillusthuringiens [34]

Di truyền tính kháng TTS sinh học Bacillus thuringiens đã đượcTabashnik; Hama và một số ctv bắt đầu nghiên cứu trên đối tượng sâu tơ từnăm 1992 đến năm 1995 Dòng kháng với BT kí hiệu là BS;dòng mẫn cảmkí hiệu là S.

Để tiến hành nghiên cứu Tabashnik và Hama đã sử dụng dòng mẫncảm S đã nuôi trong phòng thí nghiệm từ năm 1980 với trên 200 thế hệ, cáchly hoàn toàn với TTS do công ty hoá chất công nghiệp Hokko cung cấp, vàdòng kháng BS đã được chọn lọc trong năm 1994 ở Bang Bua Thong tạiThái Lan và duy trì 17 thế hệ trong phòng thí nghiệm không có áp lực chọnlọc của BT, cũng do Công Ty hoá chất công nghiệp Hokko cung cấp, ấutrùng được nuôi trong phòng thí nghiệp ở tại nhiệt độ 25±20

C (theo phươngpháp của Koshihara và Yamada,1976) Trong 17 thế hệ đã được duy trì thìTabashnik cho rằng tính kháng của sâu tơ vẫn không thay đổi và các tác giảđã tiến hành cho lai thuận nghịch giữa 2 dòng mẫn và kháng với nhau nhằmtạo ra con lai Sau đó tiến hành thử thuốc để thu thập số liệu và xử lý số liệubằng probit trên máy tính tác giả thu được:

+ LC50 của con lai F1 giữa dòng mẫn và dòng kháng của các phép laithuận là 6,03 (4,04-9,01) và của phép lai nghịch là 7,02 (4,75-10,9), như vậyta thấy là có sự gối lợp giá trị 95% của LC50 tức về mặt xác suất thống kê làkhông khác nhau về ý nghĩa Như vậy, giá trị giống nhau giữa LC50 của conlai thuận nghịch F1 cho biết cơ sở di truyền tính kháng BT là dược kiểm soátbởi gen nằm trên NST thường.

+ LC50 của con lai nằm ở khoảng giữa bố và mẹ

-Nếu tính kháng BT trong QT BS được điều khiển bởi một nhân tố di

truyền trên NST thường (chỉ có một alen kháng và một alen mẫn) thì quầnthể S là SS, quần thể BS là RR, thế hệ F1 là RS Và khi cho lai trở lại vớidòng kháng BS thì con lai F2 là 50% RR và 50% RS.

Như vậy: Tính kháng TTS BT của sâu tơ được kiểm soát bởi alen lặnkhông hoàn toàn nằm trên NST thường.

Tuy nhiên trong những thí nghiệm khác, Sim và Stone (1991) báo cáosự chọn lọc tính kháng trong phòng thí nghiệm của sâu đục chồi thuốc lá,Helicoverpa virescens, (với 130-kDa delta-nội độc tố) của BT là di truyềntrên NST thường, trội không hoàn toàn và được điều khiển bởi 1 vài locus.Trong thí nghệm với loài P.interpunctella, cho biết tính kháng là không ổnđịnh khi chọn lọc không liên tục và được di truyền như tính trạng lặn(McGaughey,1985).

I.3.2 Nghiên cứu tính kháng với thuốc Phethoate và Fenvalaretrên sâu tơ [33]

+ Đối với Phethoate:

- Chọn lọc tiếp tục những dòng kháng phethoate (OKR-R v à R)từ kết quả của 12 thế hệ đã làm mức kháng tăng lên, sau một thời gianchọn lọc giá trị LC50 đối với phenthoate (48,00 và 44.800µg) tăng hơn sovới báo cáo trước đây (16.200 và 13.600µg)[33].

OSS chọn lọc tiếp tục của những dòng mẫn cảm phenthoate (OKROSS S vàOSS-S) ba thế hệ không làm tăng tính mẫn cảm phenthoate.

Tính kháng phenthoate ở con lai F1 của phép lai thuận nghịch R×OKR-S nằm ở khoảng giữa bố mẹ (D của LD50 và của LD95 bằng0,15;0,15 và 0,47;0,55), giá trị D được so sánh giữa hai phép lai là nhỏ.

OKR-Tương tự tính kháng của con lai F1 ở phép lai thuận nghịch R×OSS-S) nằm ở khoảng giữa bố mẹ (D của LC50 và của LC95 bằng0,15;0,11;0,50 và 0,32), sự khác nhau giữa giá trị D của hai phép lai thuậnnghịch này là nhỏ.

(OSS-Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng sự di truyền tính khángphenthoate ở sâu tơ đã được tri phối bởi nhiều gen trội không hoàn toàn nằmtrên nhiễm sắc thể thường

* Đối với TTS Fenvalerate:

- Cũng bắt đầu tiến hành chọn dòng kháng, dòng mẫn rồi sau đó cho laithuận nghịch giữa hai dòng, xác nhận tính kháng của con lai thông qua LC50và giá trị D Tính kháng của con lai F1 tạo ra từ phép lai thuận và phép lainghịch giữa hai dòng OKR-FR (dòng kháng với OKR-S (dòng mẫn cảm) nằmở khoảng giữa bố mẹ (D của phép lai thuận nghịch bằng -0,50 và -0,53)

Tương tự tính kháng của thế hệ F1 tạo ra từ phép lai thuận và phép lainghịch (KAR-FR×KAR) đối với Fenvalerate cũng nằm trong khoảng giữa bốmẹ (D của LC50 thuận nghịch bằng -0,53 và -0,44) Giá trị D cho thấy sựgiống nhau giữa các phép lai thuận và lai nghịch là có ý nghĩa về mặt thốngkê Vậy ở đây không có sự di truyền liên kết với giới tính đối với di truyềntính kháng.

Những kết quả nghiên cứu con lai thuận và lai nghịch là cơ sở để rút rakết luận là: tính kháng Fenvalerate ở sâu tơ có thể là do nhiều gen Liu (1981)và Hama (1989) cũng đã có báo cáo tính kháng Fenvalerate được di truyền quanhững gen lặn không có hiên tượng di truyền liên kết với giới tính

Tóm lại từ những kết quả nghiên cứu trên của một số tác giả trên thếgiới chúng ta thấy tính kháng thuốc trừ sâu ở côn trùng là do gen trội hoặcgen lặn không hoàn toàn không liên kết với giới tính tác động.Nếu tínhkháng được kiểm soát bởi 1 gen (chỉ có một alen kháng và một alen mẫn)thì dòng kháng có kiểu gen RR, dòng mẫn có kiểu gen SS nên thế hệ con laigiữa dòng kháng và dòng mẫn sẽ có kiểu gen RS Nếu thể dị hợp mang đặcđiểm giống bố hoặc mẹ hơn thì ta có thể kết luận rằng tính kháng được môtả như là tính trạng trội tính mẫn cảm là tính trạng lặn hoặc ngược lại.Tuynhiên kết luận trên không chính xác tuyệt đối vì có nhiều tác giả nghiên

cứu đã chỉ ra rằng tính kháng TTS hiếm khi là do alen trội hoặc lặn hoàntoàn chi phối.

“Tính trội không hoàn toàn” thường ám chỉ tới tính trội không đầy đủ,tương tự “tính lặn không hoàn toàn” thường ám chỉ tới tính lặn không đầyđủ “Tính đồng trội” là chỉ mức cùng biểu hiện của bố và mẹ, tính trội khônghoàn toàn là chỉ mức độ trung gian giữa trội và lặn ở con lai F1.

I.3.3.Một số kết quả nghiên cứu khác.

Có rất nhiều tài liệu cho rằng mức độ kháng thuốc của sinh vật là kếtquả của sự tương tác giữa các gen không alen (gen thuộc các locus khácnhau), sự tương tác này gọi là tính kháng đa gen.

Các mô hình học thuyết Darwin mới (moore;1984) cho rằng sự xuấthiện tính kháng là kết quả của sự tích luỹ nhiều đột biến, mỗi đột biến đóng gópmột hiệu quả nhỏ đối với tổng số.Nếu như vậy tính kháng TTS sẽ do đa gen cótác động cộng gộp Whiten và Mc.kenzic,1980 lại đưa ra báo cáo trong cácquần thể sinh vật đồng ruộng tính kháng hầu như do một gen chính đơn.

Tuy nhiên nhiều trường hợp tính kháng đa gen được biết rất rõ(Crow,1954;King,1954;Liu,1982; Wood và Bishop,1981).

Với đối tượng ruồi đục lá bước đầu tác giả Mai Thị Thuỷ (2006)bằngphương pháp nghiên cứu tương tự như trên cũng khẳng định là sự di truyềntính kháng với hoạt chất Cypermethrin của ấu trùng ruồi đục lá là do gen lặnkhông hoàn toàn nằm trên NST thường quy định.

I.4 Sù tiÕn ho¸ tÝnh kh¸ng TTS cña c«n trïng vµs©u h¹i

Hiện tượng kháng TTS bắt nguồn từ những sai khác tự nhiên, thuộc vềbản chất di truyền trong độ mẫn cảm đối với các chất độc của các cá thểtrong quần thể, chứ không phải sự phát sinh phát triển tính kháng thuốc của

côn trùng là một quá trình thích ứng sinh lý của cá thể Sự khác biệt di truyềnvề tính kháng TTS là đã có sẵn trong quần thể tự nhiên từ khi quần thể chưatiếp xúc với thuốc trừ sâu.

Khi một quần thể dịch hại chịu tác động lâu dài với một loại TTS thìsẽ xảy ra hiện tượng chọn lọc Những cá thể mang gen kháng thuốc sẽ tồntại, sinh ra thế hệ sau mang tính kháng thuốc Quá trình chọn lọc này về bảnchất là làm thay đổi tần số gen trong quần thể Khi chưa tiếp xúc với thuốc,tần số của gen kháng thuốc trong quần thể tự nhiên thường rất thấp do chúngchưa gặp điều kiện thuận lợi để phát triển Khi quần thể côn trùng tiếp xúcvới thuốc thường xuyên, trong các thế hệ nối tiếp sẽ có những biến đổi trongquần thể, tỷ lệ kiểu gen kháng thuốc tăng dần, ở những thế hệ đầu phần lớncác kiểu gen kháng thuốc ở trạng thái dị hợp, qua nhiều thế hệ kiểu genkháng thuốc ở trạng thái đồng hợp ngày một tăng Ở những thế hệ đầu, sựbiến đổi này xảy ra chậm chạp, từ từ

Theo tính toán của Sawiski (1979), trong quần thể tự nhiên, tỉ lệ các cáthể mang gen kháng thuốc là 104

, nếu cho tiếp xúc liên tục với thuốc trừ sâuqua 15 thế hệ, tỉ lệ này tăng tới 1/30 tiếp tục cho tiếp xúc thêm 7 thế hệ nữatỉ lệ này là 1/1 Điều này góp phần giải thích một hiện tượng mang tính quyluật thường xảy ra với những vùng dùng nhiều TTS hoá học là: Thời gianđầu dùng thuốc có hiệu lực rõ rệt, nhưng chỉ sau một thời gian sử dụng,thuốc sẽ có tác dụng thấp và dần dần mất tác dụng.

Như vậy hiện tượng kháng thuốc không phải là một quá trình thích nghisinh lý của cá thể trong quần thể Hiện tượng này bắt nguồn từ sự sai khác tựnhiên có bản chất di truyền về độ mẫn cảm với các chất độc giữa các cá thểtrong quần thể (ngay từ khi QT này chưa tiếp xúc với bất kì chất độc nào).

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình tiến hoá tính

kháng TTS của côn trùng được thể hiện qua bảng I.1.

Bảng I.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình tiến hoá tính khángTTS trên đồng ruộng Theo Geoghiou và Taylor (1976)

1.Di truyền

1.1 Tần số alen kháng

1.2.Số lượng các alen kháng 1.3.Tính trội của alen kháng

1.4.Mức ngoại hiện, độ biểu hiện, tác dụng tương hỗ của các alen kháng 1.5.Sự lựa chọn trước đó bởi các hoá chất

1.6.Phạm vi phối hợp của hệ gen kháng với các yếu tố thích nghi 2.Sinh học và sinh thái học.

2.1.Sinh học 2.1.1.Vòng đời

2.1.2.Con cháu mỗi thế hệ

2.1.3.Tính đơn giao/tính tạp giao,sự sinh sản.2.2.Tập tính/sinh thái học

2.2.1.Sự cách ly, di chuyển, sự di cư 2.2.2.Tính đơn thực/tính đa thực

2.2.3.Sự sống sót ngẫu nhiên, vùng trú ẩn.3.Tác động của TTS

3.1.Hoá chất

3.1.1.Bản chất hoá học của TTS

3.1.2.Mối quan hệ với các hoá chất sử dụng trước đó 3.1.3.Thời gian tồn tại của dư lượng, công thức áp dụng.3.2 Áp dụng.

3.2.1.Ngưỡng áp dụng3.2.2.Ngưỡng chọn lọc

3.2.3.Giai đoạn sống được chọn lọc3.2.4.Kiểu tác động

3.2.5.Không gian-giới hạn chon lọc3.2.6.Sự chọn lọc thay thế

+ Các yếu tố di truyền ảnh hưởng đến sự chọn lọc của tính kháng Tần số alen kháng (R) ban đầu có ảnh hưởng đến sự phát triển tínhkháng Tần số alen kháng ban đầu trong QT cao, tính kháng có một sự khởiđầu thuận lợi Thường thì tần số alen kháng ban đầu trong QT rất thấp Saunhiều thế hệ sử dụng TTS tần số này tăng dần lên Hình dung một quần thểvới alen R có tần số thấp Các cá thể đồng hợp tử RR có thể xuất hiện, nếuquần thể đủ lớn, nhưng số lượng sẽ rất hiếm Nếu tính kháng là lặn thì việcáp dụng TTS với một liều lượng phù hợp (Taylor và Georghiou.1979), khiđó tiếp tục sử dụng TTS thì tất cả các cơ thể đồng hợp mẫn (SS) và dị hợp(RS) sẽ bị loại khỏi quần thể côn trùng gây hại, chỉ còn rất ít cá thể RR Nếutrong QT thời điểm này có một dòng nhập cư là các cá thể mẫn, thì số ít cáthể RR trong quần thể gốc sẽ bắt cặp với những cá thể nhập cư SS, con cháucủa thế hệ tiếp theo hầu hết là RS và SS Những cá thể này có thể bị giết vớisự áp dụng của TTS tiếp theo, giữ cho quần thể dưới sự khống chế (theoGeorghiou P Georg and Taylor E Charles (1986), Factores influencing theevolution of resistance, pesticide resistance: strategies and tactic formanagement, National academy press, Washington D.C)

Nhờ các gen sửa đổi tần số alen kháng trong quần thể côn trùng tăngdần lên.

Theo Mayr (1963) hoặc Dobzhansky (1970) các gen sửa đổi giúp phốihợp các alen kháng với phần còn lại của hệ gen để tạo một “hệ gen đồng thíchnghi hài hòa” Nhiều alen kháng ban đầu là có hại nhẹ (Ferrairi và Georghiou,1981) Sau đó, khi có cơ hội cho các gen sửa đổi được chọn lọc và các ảnh

hưởng đa hiệu đã được bù đắp, thì sự bất lợi giảm bớt hoặc biến mất

Sự chọn lọc TTS trước đó có thể làm dễ dàng hơn cho tiến hóa củatính kháng với các TTS mới bởi tính kháng chéo Các cơ chế của tính khángđã được phát hiện và xác định tính kháng không chỉ với một nhóm TTS màvới nhiều nhóm khác Một ví dụ cổ điển cho kết luận này là phát hiện genkháng kdr Cả DDT và Pyrethroid can thiệp vào kênh Na+ dọc sợi trục của tếbào thần kinh.

Theo Sawicki và ctv (1984) chỉ ra rằng một Estease, E.033 đã đượcchọn lọc ở ruồi nhà bởi Malathion và Trichlophon, cũng xác định tính khángchéo nhẹ với các Pyrethroid Tự nó, Est không phải là kết quả của sự khốngchế ở ruồi nhà với pyr, bởi vì các liều lượng được sử dụng trong thực tế là đủmạnh để vượt qua tính kháng nhẹ mà nó xác định

Trong một vài quần thể, tuy nhiên kdr cũng hiện diện, dù ở tần sốthấp, có lẽ là kết quả của việc sử dụng DDT trước đó để khống chế ruồi nhà.Trong các quần thể này việc sử dụng pyr dẫn đến sự chọn lọc đồng thời kdrcũng như Est và sự thất bại nhanh chóng của các hợp chất thuộc nhóm thứ 3,pyr, qua sự chọn lọc của các cơ chế kháng chung [30]

Bọ cánh cứng Colorado là một vi dụ thích hợp minh họa cho vấn đề trên.Trên bán đảo Long Island, QT của các loài này cần 7 năm để phát triển tínhkháng với DDT, loại thuốc trừ sâu tổng hợp đầu tiên được sử dụng để khốngchế chúng Cũng QT này thời gian phát triển tính kháng ngắn dần với cáchóa chất sử dụng tiếp theo: 5 năm để phát hiện tính kháng vớiAzinphosmethyl, 2 năm với Carbofuran, 2 năm với Pyr và một năm cho cácPyr với chất điều phối [19].

+ Các yếu tố sinh học và sinh thái học

Sinh thái học và lịch sử đời sống có thể làm thay đổi đáng kể phản ứng

đối với sự chọn lọc dẫn đến sự phát triển tính kháng Rõ ràng nhất, tất nhiênphần lớn là số thế hệ mỗi năm

Biểu đồ 1.1 Mối liên hệ giữa số thế hệ mỗi năm và sự xuất hiện tínhkháng Trong các loài được chọn lọc bằng xử lý Aldrin/Diedrin trong đất [19].

Biểu đồ 1.1 minh họa mối liên quan giữa số thế hệ mỗi năm trong cácloài côn trùng gây hại sống trong đất và số năm chúng biểu hiện tính khángvới Aldrin/Dielrin xử lý trong đất (Georhiou,1980) Ta có thể thấy dòi rễ(Hylemya.spp) hoàn thành 3-4 thế hệ trong mỗi năm, phát triển tính khángsau 5 năm xử lý thuốc, trong khi Conoderus falli, với hai thế hệ mỗi năm vàxuất hiện tính kháng trong 6 năm Diabrotica longicarnis, Amphimallonmajalis và Popillia japonica, với một thế hệ mỗi năm, cần 8 đến 14 năm đểxuất hiện tính kháng trong khi bọ bổ củi (Melanotus tamsuyensis) ở Taiwan,với vòng đời 2 năm, mất 20 năm để phát triển tính kháng

Các loài côn trùng gây hại đa thực có khuynh hướng phát triển tínhkháng chậm hơn các loài đơn thực Có thể do một phần nhỏ các loài đa thực ítchịu sự chọn lọc TTS, do đó sự chọn lọc ít căng thẳng hơn trên các loài này.Bởi vì một vài côn trùng sẽ ở vùng trú ẩn nơi không xử lý TTS- cung cấpnguồn cá thể mẫn cảm Đây cũng có thể là cơ sở để giải thích sự hình thànhtính kháng trong bọ chét của gia súc ở Nam Phi xuất hiện đầu tiên ở các loài kíchủ đơn và sau đó mới xuất hiện ở các loài bọ chét tấn công trên 2 hoặc 3 vậtchủ (Whitehead và Baker, 1961; Whaton và Roulston, 1970)[19]

Sự nhập cư của các cá thể mẫn SS có thể làm chậm sự tiến hóa [36],[18] Ngược lại, nếu sự nhập cư không xảy ra hoặc số cá thể nhập cư quá ít,thì một số lượng đáng kể các cá thể RR sẽ tạo ra, quần thể phát triển tínhkháng nhanh[19].

Vùng trú ẩn có vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn cá thểnhập cư mẫn cảm, làm chậm quá trình tiến hóa (Georhiou và Taylor, 1976).Vùng trú ẩn giúp một phần các cá thể của QT trốn thoát khỏi sự chọn lọc.Vùng trú ẩn có thể bao gồm các mô thực vật, mầm cây, hoặc có thể là giaiđoạn sinh lý mẫn cảm thấp, như thời kì đình dục hoặc nhộng trong đất [19] Kẻ thù tự nhiên Xu hướng xuất hiện tính kháng của các loài côn trùnggây hại mạnh hơn kẻ thù tự nhiên của chúng một cách đáng kể (Tabashnik,Rouch cùng tập) [35].

Hiện tượng này được giải thích như sau: Giả sử một loại TTS giết mộtphần lớn con mồi và các vật ăn thịt trong vùng được xử lý TTS Đối với cuộcsống của con mồi sống sót là tương đối thuận lợi (nó được tự do khi không bịkhống chế bởi những loài vật ăn thịt), và QT con mồi có thể tăng lên nhanhchóng Trái lại, cuộc sống của của các con vật ăn thịt còn sống sót là tươngđối bất thuận lợi (do khó khăn trong việc tìm kiếm thức ăn) so với QT conmồi, do đó QT của chúng sẽ có khuynh hướng phục hồi chậm hơn [35] + Các yếu tố tác động của TTS

Quá trình xuất hiện tính kháng có thể có liên quan trực tiếp tới việc sửdụng TTS của con người, như thời gian, liều lượng và công thức sử dụng TTS Thời gian sử dụng TTS thường xuyên có thể là yếu tố quan trọng làmxuất hiện tính kháng Khi xử lí thuốc lần đầu tiên thì số cá thể RR có thểsống sót rất ít, nhưng các lần xử lí tiếp theo thì số cá thể này có thể tồn tạiđáng kể.[30].

Liều lượng TTS sử dụng là yếu tố nhằm xác định tính trội của tínhkháng Liên quan đến vấn đề này là công thức và tốc độ phân hủy TTS Nếu

một TTS mà tồn tại dai dẳng thì có thể giết các cá thể nhập cư mẫn cảm vàkết quả là ngăn cản sự nhập cư Điều này rất thích hợp cho sự phát triển vàhình thành tính kháng trong QT.

Việc lựa chọn loại thuốc trừ sâu là rất quan trọng Thường có một vài mứcđộ kháng chéo đối với các TTS khác nhau trong cùng một lớp Sự phụ thuộc vàocơ chế kháng, cũng có thể là tính kháng chéo giữa DDT và Pyr bởi gen krd và giữaCar và OP bởi sự chọn lọc của AchE vô cảm (Hama, 1983) [19].

Như vậy, tính kháng TTS đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trongnhững năm gần đây [18] Nhiều nghiên cứu cho thấy tính kháng TTS là mộthiện tượng tiến hóa, chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố: di truyền, sinh học,tác đông của TTS Hiểu biết đầy đủ sự ảnh hưởng của các yếu tố trên là rấtquan trọng giúp thiết lập các phương pháp quản lý tính kháng khả thi để làmchậm hoặc đoán trước được sự tiến hoá tính kháng TTS của côn trùng

I.5 C¸c c¬ chÕ cña tÝnh kh¸ng TTS ë c«n trïngI.5.1 Cơ chế di truyền của tính kháng TTS

Cơ chế di truyền của tính kháng TTS của côn trùng vô cùng phức tạp.Mức kháng của sinh vật thường là kết quả của sự tương tác giữa các alen củamột vài gen ở những locus khác nhau Sự tương tác này được gọi là tínhkháng đa gen Một sự phức tạp thêm nữa là sự tồn tại của gen ngoài nhiễmsắc thể, chúng có thể tác động riêng rẽ hoặc trong mối liên quan với các gentrên nhiễm sắc thể Ở thực vật, tính kháng thuốc diệt cỏ có thể được di truyềnhệ gen nằm ngoài tế bào chất.

Sự xuất hiện tính kháng có thể do đột biến gây nên, khi sử dụng mộtloại TTS nào đó kéo dài làm cho gen cấu trúc, hoặc gen điều hòa nào đó bịđột biến Một vài gen cấu trúc được dịch mã tạo sản phẩm (như các enzym,các thụ quan hay các thành phần trong tế bào như ribôxôm, tubilin ) là cácđích cho các TTS Đột biến của các gen cấu trúc có thể dẫn đến sự thay đổinghiêm trọng các sản phẩm gen, như giảm sự mẫn cảm của vị trí đích, hoặc

tăng khả năng chuyển hóa TTS Các sản phẩm của gen điều hòa có thểkhống chế tỉ lệ phiên mã gen cấu trúc Chúng cũng có thể nhận ra và kết nốiTTS và bằng cách đó chúng điều khiển sự cảm ứng của các enzym giải độcphù hợp[14].

Một vấn đề đặt ra rất quan trọng là có bao nhiêu gen quy định tínhkháng ở côn trùng? Có nhiều gen xác định tính kháng và mỗi gen xác địnhtính kháng đối với một loại TTS hay chỉ có một vài gen, mỗi gen xác địnhtính kháng đối với một số lớn các nhóm TTS?

Nếu có một số lớn các gen, mỗi gen xác định tính kháng đối với mộtloại TTS thì tính kháng sẽ được hạn chế và các TTS mới sẽ giải quyết đượcvấn đề kháng Trái lại nếu có một số giới hạn các cơ chế di truyền liên quan,thì các QT có thể sẽ kháng với các loại TTS mà chúng chưa hề tiếp xúc baogiờ Giả thiết thứ hai có vẻ hợp lý hơn Vì vậy sự phát triển các TTS mới cóquan hệ gần với các TTS hiện đang sử dụng về kiểu tác động hoặc conđường chuyển hóa sẽ không giải quyết được vấn đề [17].

Standard neo-Darwinian modells (Moore, 1984) cho rằng sự xuất hiệntính kháng là kết quả sự tích lũy của nhiều đột biến, mỗi đột biến đóng gópmột hiệu quả nhỏ đối với tổng số Nếu vậy tính kháng TTS ở côn trùng là donhiều gen chi phối, nhưng thực tế không như vậy (Whitten và Mc kenzic,1980), trong các quần thể trên đồng ruộng tính kháng hầu như luôn luôn bởimột gen chính đơn Bởi vậy, giả thiết tiến hóa chuẩn dường như không ápdụng đối với sự phát triển của tính kháng[17].

Giả thuyết gen điều hòa là phương thức phù hợp hơn để giải thích chosự biến đổi, đặc biệt ở mức QT hoặc loài phụ Các gen như vậy khống chếthời gian và bản chất biểu hiện của gen cấu trúc, phù hợp hơn để cung cấp cơsở di truyền của sự biến đổi thích nghi như sự phát triển của tính kháng(Levin, 1984) Theo quan điểm của Frederick W, Papp.j.R các dữ liệu vềtính kháng ủng hộ cho giả thuyết của Levin.

Có 2 kiểu gen điều hòa dường như cùng tồn tại, chúng khác nhau vềbản chất di truyền và sinh hóa Một kiểu di truyền theo kiểu tất cả hoặckhông (trội hoàn toàn hoặc lặn) và xuất hiện liên quan đến sự thay đổi trongkhối lượng của của prôtein được tổng hợp

Kiểu thứ 2 chỉ ra sự di truyền đồng trội và liên quan đến sự biến đổitrong bản chất của prôtein được tổng hợp

Tính kháng số lượng (kiểu kháng liên quan đến sự khác nhau trong sốlượng prôtêin được tổng hợp) về bản chất tương tự các operon vi khuẩn.Tính kháng kiểu này xuất hiện liên quan đến các yếu tố điều hòa ở gần kềcác gen cấu trúc mà không diễn ra trong gen cấu trúc Sự điều hòa theo kiểunày đã xác định gần như sự điều hòa gần (Paigen, 1979).

Tính kháng chất lượng, xuất hiện đối với sự hiện diện của một số cơchế cho phép sự sản xuất các dạng biến đổi của các enzym giải độc đặc biệttrong côn trùng kháng so với côn trùng mẫn Các nghiên cứu di truyền trênđối tượng ruồi nhà (Plapp, 1984) chỉ ra rằng sự biến đổi ở một locus ditruyền đơn xuất hiện để khống chế tính kháng liên quan với các enzym giảiđộc phức tạp Một cơ chế tương tự có thể rút ra từ các nghiên cứu ban đầuvới D melanogaster (Kikawa, 1964a,b) Khi một locus biểu hiện tác độngvào sự biến đổi của các enzym, gen có lẽ không gần kề đối với các enzymmà hoạt tính của enzym điều khiển nó Sự điều khiển như vậy, đã xác địnhnhư các điều hòa xa và các hệ thống như vậy có thể coi như “các đơn vị điềuhòa” (Plapp, 1984) Theo Paigen, các hệ thống này được quy định bởi sự ditruyền đồng trội của chúng hơn là kiểu “tất cả - hoặc – không” của các hệthống tương tự ở vi khuẩn [17]

I.5.2 Cơ chế hóa sinh của tính kháng TTS

I.5.2.1- Giảm khả năng thấm

Tính thấm giảm do tầng cuticul hoặc lớp mỡ dưới da dày hơn ở cơ thểkháng so với cơ thể mẫn hoặc kháng yếu TTS muốn tác động lên cơ thể côn

trùng gây hại nó phải thấm được vào cơ thể với một liều lượng nhất định rồisau đó nó mới tác động lên vị trí đích của thuốc Những dòng sâu hại khángthuốc có thể hạn chế hoặc ngăn cản sự xâm nhập của thuốc vào cơ thể quabiểu bì, ngăn cản thuốc thuốc xâm nhập qua sợi trục và nội quan Sự giảmtính thấm là cơ chế chủ yếu làm giảm mức độ nhạy cảm của các vị trí tácđộng đối với thuốc ở côn trùng (Moloyama 1990)

Theo Heyes và ctv (1974), ruồi kháng thuốc trừ sâu có lớp cuticul ởđốt bàn dày hơn nên thuốc cũng khó thấm hơn so với cá thể mẫn.

Octt cũng nêu lên (1970) rằng ruồi đục lá kháng TTS có lớp lipit, lớpsáp và prôtêin trong lớp cuticul hay do sự tăng kết cứng biểu bì nên đã làmgiảm khả năng xâm nhập thuốc vào cơ thể

Pery và Agosin cũng cho rằng những QT sâu kháng thuốc xuất hiệnmột lớp lipit mới có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của thuốc vào cấu trúctinh thể của hệ thần kinh làm thuốc mất tác dụng

T Miyata (1986) [24], N Motayama (1990) [25] đã công bố rằngnhững nòi sâu tơ kháng TTS như Fenvalerate, có khả năng hạn chế sự xâmnhập chất độc qua biểu bì.

Khi nghiên cứu so sánh khả năng thấm qua màng cuticul của thuốcFenialevate đã được đánh dấu phóng xạ cho thấy tỉ lệ thấm qua màng ở dòngkháng (R) là thấp hơn dòng mẫn cảm (S) [22], [25]

I.5.2.2.Giảm độ mẫn cảm đối với các vị trí tác động của TTS

TTS sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ tác động lên côn trùng ởcác vị trí đích nhất định gọi là vị trí tác động, ở các côn trùng kháng thuốc, tạicác vị trí tác động có hiện tượng giảm mẫn cảm đối với các loại thuốc trừ sâu

Ache.E là enzym thủy phân chất dẫn truyền thần kinh, nếu sự thủy phân nàykhông diễn ra, sự tích lũy AchE ở xinap thần kinh dẫn đến sự kích thích lặplại, cuối cùng làm chết côn trùng bởi sự kiệt sức[20].

Sự tồn tại tính không mẫn cảm của AchE với OP được phát đầu tiên ở dòng nhện đỏ (Tetranychus usticae) kháng paraoxon (Smissart, 1964) [20].

Các loài côn trùng có nhiều dạng AchE không mẫn cảm, mà mỗi dạngthể hiện đặc tính khác nhau qua tham số động học riêng của nó Các dạngAchE khác nhau đã được mô tả ở bọ phấn hại thuốc lá (Byrne vàDevonshire, 1993)

Tương tự như vậy, các dạng không mẫn cảm của AchE đã được báocáo ở bọ khoai tây Colorada, L decembineata (Wierenga và Holling.Worrth 1993)

Dạng AchE được phát hiện ở muỗi C Tritaeniorhymchus là nhân tốkhông mẫn cảm rất lớn (tới 7000 lần) chống lại Dichlorvos (Mamiya 1997) [13].Ở các nòi sâu kháng thuốc khi tiếp xúc với TTS, Cholinesterase trởnên “trơ”, không mẫn cảm với thuốc nữa Những TTS ức chế hoạt động củacác enzym này là các thuốc thuộc nhóm OP và Car [31].

* Các thụ thể GABA (acid – amibutiric) là đích cơ bản của TTSCyclodiene Hầu hết các trường hợp tính kháng Cyclodiene xuất hiện là dolàm giảm độ nhạy cảm thụ quan A tiểu loại GABA [29], một phần của kênhCl Giống với AchE, sự giảm tính nhạy cảm của các thụ thể GABA là domột sự thay đổi trong cấu trúc prôtein Nhưng không giống như ache, chỉmột đột biến đơn gây ra một Aa đặc hiệu bị thay bằng một Aa khác (mộtSerin hoặc một Glycine) dẫn đến các mức độ kháng cao với cyclodien.Ngoài ra cũng phát hiện một số đột biến điểm khác nhưng nó không gây nêntính kháng hoặc hiếm khi gắn liền với tính kháng [28].

* Các kênh Na đóng mở phụ thuộc vào điện thế màng tế bào thầnkinh, nó đóng một vai trò rất quan trọng trong việc dẫn truyền thần kinh.

Thuốc trừ sâu DDT và Pyrethroid bám vào kênh Na làm chậm tốcđộ đóng hoặc mở của chúng và hậu quả của việc ion Na đổ vào trong tếbào có thể tạo nên một loại điện thế thứ 2 và được nhân lên nhiều lần kết quảlà hệ thống thần kinh của sâu hại bị kích thích dữ dội làm sâu hại chết

Có một phản ứng kiểu hình liên quan đến tính kháng Knockdown (kdr)làm cho các kênh Na này trở nên ít nhạy cảm với sự gây độc Nguyên nhânlà do sự biểu hiện của một gen gắn liền với chức năng của kênh Na bị thayđổi hay do một đột biến cấu trúc xảy ra với các kênh dẫn đến tính kháng kdr.

* Các TTS giống hoocmon trẻ như Methoprene cạnh tranh thụ thể JHvới hoocmon tự nhiên Hầu hết tính kháng với các loại TTS giống JH được tạora bởi cơ chế chuyển hóa hay giảm sự xâm nhập của TTS qua màng cuticul.Thông báo duy nhất về sự không nhạy cảm ở điểm đích đối với TTS giả JH làcác đột biến được phân lập từ các dòng Drosophila ở trong phòng thí nghiệm[28] Gen kháng Met đã được phân lập từ các dòng này gắn liền với một prôtêinkết hợp với JH ít nhạy cảm Sự vận động các alen của gen Met bởi một yếu tốvận động TE có thể gây ra tính kháng [19] Protêin kết hợp với JH không nhạycảm, hoặc là kết quả của một đột biến làm thay đổi cấu trúc prôtêin đó, hoặc sựbiểu hiện chu kỳ sinh trưởng của côn trùng đã bị thay đổi.

* Đối với TTS Bt, vị trí tác động của thuốc là màng ruột giữa Nhữngnòi sâu tơ kháng Bt, nhiều tác giả đã chứng minh, là do sự giảm sút ái lựccủa màng ruột giữa đối với thuốc (Sun.C.N 1990)[31].

I.5.2.3 Tăng khả năng giải độc TTS cho côn trùng

Sự giải độc TTS trong cơ thể côn trùng là nhờ hoạt động của một sốen zym trong cơ thể như: Esterase, Microsomal oxidase, Glutathione- S-Transferase.

* Các Monooxygenase P450

Các cytochrome P450 là các protein chứa hem, nó tác động như enzymoxydase giới hạn trong hệ thống Monooxygenase Trong tế bào của sinh vật

nhân chuẩn có nhiều dạng P450 phức tạp Các monooxygenase rất đáng chúý vì chúng có thể oxy hóa các chất đa dạng và rộng rãi và có khả năng tạo ramột danh sách đáng ngạc nhiên các phản ứng (Kalkarni và Hodgson, 1980,Rendic và Dicarlo, 1997, Mansuy, 1998) Danh pháp và phân loại P450

cytochrome đã được xác định qua các công trình nghiên cứu của Nelson vàctv (1996), Rendic và Dicarlo (1997)

Các nghiên cứu sớm về Monooxygenase ở côn trùng nhận thấy tăng P

450 Cytochrome tổng số trong các dòng kháng so với dòng mẫn (tham khảoHolgson, 1985) Tuy vậy, các mức P450 tổng số thường tăng chỉ khoảng 3lần trong khi đó hoạt tính Monooxygenase tăng với mức cao hơn nhiều[29]

Tính kháng do Monooxygenase tạo thành có thể là kiểu phổ biến nhấtnhất của tính kháng TTS dựa vào sự chuyển hóa (Holgson và Kulkasus.1983; Oppenoorth 1985; Brattsten và ctv 1986; Scott 1991).

Các enzym Monooxygenase xúc tác một loạt các phản ứng giải độc ởcôn trùng bao gồm hydroxy hóa DDT, epoxid hóa các Cyclodiene, oxy hóacác phosphothloate[29]

P450 là kiểu biểu hiện vượt trội trong các quần thể kháng TTS và cácdạng đa kháng được nhận biết dựa trên các nghiên cứu protein (Ronis 1988)và các nghiên cứu về axit nucleic (Scott 1994)

Tuy nhiên, sự liên quan của nó với tính kháng TTS, cơ sở phân tử của sựbiểu hiện quá mức này cho tới nay vẫn còn nhiều điều chưa rõ.

* Hệ isozym Esterase (Est)

Đây là một nhóm các isozym không cùng nguồn và một đặc tínhchung của Est là có khả năng phá vỡ các liên kết este của axit cacboxylictrong các hợp chất phát sinh từ Naphthol, Indoxil Metholumbelliphirin.

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học đãcho biết một số isozym Est có liên quan đến tính kháng thuốc, các isozymEst liên quan đến tính kháng thuốc ở muỗi được nghiên cứu trong những

năm 1975 đến 1978 (Pasteur.N và Singre.G)[21], [26].

Năm 1993, khi tiến hành định lượng hàm lượng Est tổng số ở hai dòngmuỗi Culex quinquefasciatus (dòng kháng và dòng mẫn cảm với TTSMalathion), một số tác giả đã nhận thấy rằng, hàm lượng enzym này ở dòngkháng cao gấp 8,5 lần so với dòng mẫn[1].

Theo Maguyama.Y và ctv (1983), điểm tác động của các enzym thủyphân lên thuốc Malathion như sau: (2)

H3CO P S CH COO C2 H5

H3CO (1)

S CH COO C2 H5

(1.) Do phosphataza (3)(2.) tác động

(2,3) Do carboxyl esterase tác động

Một số tác giả khác thì cho biết dạng chuyển hóa của TTS do Est là nhưsau

P O Esterase P O

S O

Dạng độc Dạng không độc

P S Esterase P O

S O

Dạng độc Dạng không độc

Mặc dù hoạt tính Est có liên quan đến tính kháng OP ở nhiều loài sâu hại,nhưng cơ chế phân tử và hóa sinh của tính kháng cho Est chỉ được làm sángtỏ ở ít loài Hai chức năng khác nhau đã được thiết lập trong giới hạn khả

năng của các enzym này liên quan đến tính kháng OP là:

- Sản xuất vượt mức Est mà chúng tác động để tách estephosphat (dokhuếch đại gen)

- Biến đổi chất lượng trong cấu trúc enzym mang lại sự tăng tínhhoạt hóa đã được nghiên cứu ở rệp và muỗi Culex.

Ở muỗi, sự gia tăng lớn (250 lần) về số bản sao gen Est đã gặp ở nhữngdòng kháng mạnh (Mouches và ctv 1986) Hai năm sau, sự khuếch đại gen Estở M Persicae đã được xác nhận (Field và ctv 1988) và 5 năm sau các gen đãđược tách dòng và giải trình tự hoàn toàn (Frield và ctv 1993)

Các gen Est khuếch đại đã được phát hiện ở loài M.nicotionae (Field vàctv 1994) và các cơ chế tương tự cũng đã được ở những loài rệp khác,Schizaphisgramivaum (Rider và ctv.1998, Ono và ctv 1999).

Trong nhiều trường hợp, các mức độ Est tăng lên bởi sự khuếch đại genhoặc enzym bị đột biến thành các enzym Est bị thay đổi về cấu trúc là cơ chếkháng gây ra ở mức độ phân tử.

Hiện tượng khuếch đại các gen Est ở rệp M.pesicae và muỗi Culex là một vídụ điển hình nhất về cơ chế kháng ở mức độ phân tử.[16]

Sự nhân đôi quan sát được trong lượng esterase thông qua 7 dòng khángtăng dần đưa ra kết luận rằng sự khuếch đại gen là cơ sở cho sự tổng hợpenzym vượt mức tính kháng TTS (Devoshere và Sawiki,1979).

Các gen E4 được khuếch đại và khung ADN ở một dòng rệp (7945) cómột vị trí độc nhất trên nhiều đơn vị 24kb (các đơn vị khuếch đại gen-amplicaton) được sắp xếp như một dãy các đoạn lặp lại hướng đầu đuôi (theoRied và cộng sự, 1996) Những đoạn này rõ ràng được tạo ra bởi nhiều đứtgãy chỗ ngược dòng gen E4 ở vị trí tương tự một cchs chính xác để tạo ra sựlặp đoạn E4/FE4n khởi đầu tiếp theo sự sắp xếp lại để tạo ra nhiều chỗ nốimới (NJ) giữa các bản sao (Fiel và Devomhine.1997,1998).[hình 1] mô tảcách sắp xếp nay phù hợp với mô hình tạo ra ADN bởi sự trao đổi chéo

không cân giữa các cromatid chị em, do đó không có những đoạn tươngđồng khác nhau hay những vùng giàu adenine thường liên quan tới sự kiệnnhư vậy (Trifolia và cộng sự,1991)

Hình 1: Mô hình tạo mối nối mới (NJ) nhờ sự khuếch đại của gen E4và khung ADN

a-Kiểu hoang dại với chỉ một bản gen b-Các amplicon xếp thành chuỗi

Tính kháng tăng lên là do các esterase tương tác với TTS nhanh hơnvới chính điểm đích của chúng, khi các Est có mặt với tỷ lệ ngang bằng vớiloại TTS này [25]

Bọ xít xanh, Schinaphis graminum là một loại sâu hại lúa miến vàcũng thể hiện sự phát triển tính kháng với TTS OP như ở rệp (Ono 1994) đãcó sự xác nhận rằng các gen esterase E4/FE4 được khuếch đại củaM.persicae giống với gen mã hóa kiểu I ở S.graminum tới 73% trình tự cácaxitamin dự đoán của Ono (1999) nên có thể các gen này là cùng tổ tiên dẫnđến sự giống nhau giữa các gen có thể là dẫn đến kết quả quá trình khuếchđại các các gen giống nhau trong phản ứng với áp lực của chọn lọc do TTSOP đối với cả hai loài.

Ở muỗi, sự khuếch đại gen như là cơ sở phân tử của tính kháng đãđược tổng kết (Devonshire và Field, 1991; Soderlund vàBloomquist,1991;Soderlund,1997)[ 12]

Như vậy sự xuất hiện hiện tượng khuếch đại gen như là cơ chế khángở Culex và M.persicae là một vài cơ chế kháng ở mức phân tử và đặc tínhhóa sinh của cơ chế kháng được hiểu rõ nhất hiện nay

Sự biến đổi chất Sự có mặt của các esterase sửa đổi về chất liên quanvới tính kháng OP được đề cập tới trong một số loài kháng OP(Whyand,1985) Cơ sở của sự thay đổi về chất như thể được đề xuất liênquan đến sự sửa đổi cấu trúc của esterase để tăng khả năng phân giải TTScủa nó (Parker,1991) [30]

.* Gluthion - S- Transferase (GST)

GSTs là một họ các ezym đa chức năng hoạt hoá bổ sung nucleophiliccủa glutathion (GSH) khử (r-glutamyl-cystein-glycin) thành các cơ chấtelectroplilic (RX).

RX + GSH  GSR + HX

(Mannenrk và Danielsox.1988;Clark.1989)

Sự liên quan của các GST trong sự chuyển hoá TTS OP lần đầu tiênđược đề cập bởi Fukami và Shishido (1966) Họ phát hiện rằng trong các môcủa chuột và các côn trùng, Methyl parathion bị Dimethyl hoá bởi enzymhoà tan mà mỗi enzym này đòi hỏi Glutathione

Nhiều TTS OP có thể được chuyển hoá và giải độc bởi enzym này(Motoyama và Dautema.1980), nên các GST có thể đóng vai trò chính trongtính kháng OP đặc biệt những thuốc OP có nhóm Omethyl.

Sự loại hydrochlorid của DDT là con đường chính của sử giải độctrong một vài côn trùng, đặc biệt là ở ruồi nhà và một số loài muỗi(Oppenoorth.1985) Phản ứng được hoạt hóa bởi DDT dehydrochlorinase đòihỏi GSH hòa tan (DDTase) Clark và Shaman (1984) đã cung cấp bằng

chứng thể hiện rằng DDTase ở ruồi là GST Hiện nay có nhiều bằng chứngcho thấy một vài dạng GST có hoạt tính DDTase (Tang và Tu 1994;Prapanthadaza và ctv 1995)

Yang và ctv 1971 đã phát hiện rằng sự tách diazion phụ thuộc GST ởnhững con kháng của dòng kháng là cao hơn đáng kể so với dòng mẫn.

Hai cơ chất thường được dùng để nhận biết sự tăng hoạt tính GSTtrong sự liên quan với tính kháng là Chlorodinitrobenzen vàdichcloronitrobenzen.

Chương II

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Đối tượng nghiên cứu

- Ruồi đục lá (đối tượng sâu hại của nhiều câyrau và họ cây thập tự, trongđó có cây đậu trạch)

- Vị trí phân loại: Ngành:Động vật chân khớp (Athropoda) Lớp :Côn trùng (Insecta)

Bộ :Hai cánh (Diptera) Họ :Agomyzidae

Chi :Liriomyzae

Loài : Liriomyzae sativae Blanchard

II.1.1.Đặc điểm hình thái:

Ruồi đục lá là loài biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn làTrứng, sâu non, nhộng và giai đoạn ruồi trưởng thành

 Trứng: Hình bầu dục, khi mới đẻ có mầu trắng sữa, sau đó chuyểnthành mầu trắng đục Trứng được nằm gọn trong vết châm của ruồitrên lá.Những vết châm không có trứng thì mép không gọn và hìnhdạng có thể tròn, hoặc có góc cạnh.Những vết châm có trứng thì luôncó hình bầu dục và mép gọn Kích thước trung bình của trứng khoảngtừ 0,02 đến 0,13mm.

 Ấu trùng: Có ba độ tuổi.Móc miệng hình chữ Y rất linh hoạt Tuổi 1màu trắng trong, tuổi 2 mầu vàng nhạt, tuổi 3 màu vàng rơm.Kíchthước trung bình các độ tuổi lần lượt là: 0,7;1,3 và 2,3mm.

 Nhộng: Nhộng bọc hình bầu dục, có 10 đốt Kích thước trung bìnhkhoảng 2,8 đến 3,8mm.

Ảnh 1: Nhộng của ruồi đục lá

 Ruồi trưởng thành: Kích thước nhỏ, ruồi cái thường có thân hình vàcành dài hơn ruồi đực Đầu được bao phủ bởi một lớp lông màu đenbóng, có râu đầu.Mắt kép to màu nâu đỏ, ba mắt đơn nằm ở các khutrán-chân-môi Miệng kiểu liếm hút có hàm dưới to, bàn chân có 5 đốt,bụng 6 đốt giữa các đốt có màu vàng Bụng con đực thường nhỏ hơncon cái Con cái có máng đẻ trứng dài và nhọn; bộ phận sinh dục củacon đực tù, ngắn và nhỏ.

Ảnh 2: Ruồi đục lá trưởng thành (Liriomyza sativae Blanchard)

II.1.2 Đặc điểm sinh thái

 Nhộng thường vũ hóa thành con trưởng thành vào buổi sáng, nhiềunhất là khoảng từ 6h đến 8h sáng Sau khi đã vũ hóa khoảng 1h thìmàu sắc cơ thể mới ổn định Ruồi ăn thêm và thường sau 1 ngày mớibắt cặp giao phối Thời điểm giao phối nhiều nhất là khoảng thời giantừ 6h đến 8h và 14h đến 18h trong ngày Thời gian giao phối mỗi lần

kéo dài khoảng 40 đến 120 phút Một con cái có thể giao phối từ 1 đến3 lần, số lần giao phối quyết định đến lượng trứng đẻ của ruồi cái.Ruồi cái không giao phối vẫn có khả năng đẻ trứng nhưng số trứng đẻrất ít chỉ bằng 2/3 lần so với ruồi cái được giao phối và trứng không cókhả năng nở thành ấu trùng.

 Ruồi cái dùng máng đẻ châm lên mặt lá thành những lỗ nhỏ sau đó bòlùi lại cho miệng vào vết châm hút dịch đồng thời thăm dò vị trí đẻtrứng Ruồi thường đẻ trứng trên những lá bánh tẻ (không già, khôngnon) Một con ruồi cái có thể đẻ khoảng 250 trứng trong thời gian là 8-10 ngày.

 Vòng đời của ruồi đục lá ở nhiệt độ 25-30 0 C là khoảng từ 13 đến19 ngày Loài này gây hại cho cây trồng quanh năm Chủ yếu gâyhại cây trồng nặng nhất là vào các tháng 4,5 và từ tháng 7 đếntháng 11 trong năm.

 Triệu chứng và mức độ gây hại: Ấu trùng ruồi đục lá nằm dưới biểubì lá ăn lớp nhu mô để lại hai lớp biểu bì, tạo thành các đường đụcngoằn nghèo Giữa các đường đục có vệt phân do ấu trùng thải ramầu xanh hoặc mầu nâu đen Do đường đục lá bị khô héo làm chodiện tích lá bị thu hẹp dẫn đến làm giảm khả năng quang hợp và traođổi chất của cây trồng hậu quả là cây còi cọc, phát triển chậm ảnhhưởng đến năng xuất.

II.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu II.2.1 Địa điểm

Chúng tôi tiến hành đề tài này tại:

+ Trong phòng thí nghiệm: Phòng khảo nghiệm thuốc trừ sâu - Trungtâm kiểm định thuốc bảo vệ thực vật phía Bắc-Cục bảo vệ thực vật.

+ Ngoài đồng ruộng: Chúng tôi thu thập mẫu và tiến hành các thínghiêm ngoài đồng ruộng tại ba địa điểm có đặc điểm là vùng chuyên canh

trồng các loại rau màu đó là:

- Song phương Hoài Đức Hà Nội: Đây là một địa điểm có diện tíchtrồng rau quanh năm với nhiều loại rau màu mà trong đó có nhiều loại cây làkí chủ của loài ruồi đục lá, trong đó có cây đậu trạch Về mặt địa lý đây làmột vùng chuyên canh nằm phía tây và cách trung tâm thành phố Hà Nộikhoảng 12km.

- Đình Tổ -Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diện tích đất trồngmầu chủ yếu trong đó có nhiều loại cây chủ yếu là kí chủ của loại ruồi đục lá nàynhư các họ bầu bí, họ đậu, dưa chuột Nằm cách Hà Nội khoảng 30km.

- An Bình Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diên tích đất chủyếu trồng mầu cây trồng chủ yếu như dưa chuột, các cây bầu bí và đậu trạch.Nằm cách Hà Nội khoảng 50km.

Những địa điểm mà chúng tôi lựa chọn đều cách xa nhau nhằm hạn chế tốiđa sự di nhập của các cá thể trưởng thành giữa các quần thể.

II.2.2.Thời gian nghiên cứu:

Chúng tôi bắt đầu tiến hành nghiên cứu từ tháng 12 năm 2008 đếntháng 10 năm 2009

II.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm II.3.1 Dụng cụ

Dụng cụ để phục vụ trong quá trình nghiên cứu đề tài này gồm có:Nhà lưới, lồng lưới kích thước 120×60×60cm và lồng 60×60×60cm Cácthiết bị trong phòng thí nghiệm như bô can thủy tinh,đĩa petri,ống nghiệm,kính lúp, ống đong, dụng cụ đo nhiệt độ tủ lạnh

II.3.2.Vật liệu

- Gồm 5 loại thuốc được dùng trong nghiên cứu là:

+ Sherpa 25EC: Thuộc nhóm Pyrethroid, chứa hoạt chất Cypermethrinvới hàm lượng 25g hoạt chất/100ml Nó tác động vào kênh Na+ trên sợi trụctế bào thần kinh làm cho các kênh này kéo dài thời gian mở dẫn đến hưng

phấn kéo dài làm cho côn trùng chết Thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc + Trigard 75 WP: Thuộc nhóm thuốc ức chế điều hòa sinh trưởngcôn trùng (IRG); chứa 75g hoạt chất Cycromazine/100g sản phẩm.Thuốc cótác dụng tiếp xúc,ngăn cản quá trình tổng hợp kitin, ngăn cản quá trình lộtxác làm côn trùng chết.

+ Success 120SC: Nguồn gốc sinh học có chứa 120g hoạt chấtSpinosad trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc,tác động vị độc cao hơn tiếp xúc khoảng 5 lần Chúng ảnh hưởng đến sự hoạthóa thụ quan Nicotinic acetylcholine (nAch) và chức năng của GABA + Alfatin 1.8.EC: Có nguồn gốc sinh học chứa 1,8g hoạt chấtAbamectin trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng gây độc đường ruộtvà tiếp xúc, có khả năng thẩm thấu sâu, nhanh vào mô lá nên có tác dụng kéodài đối với nhiều loại côn trùng trích hút và gây hại ở phần thịt lá Abamectingây rối loạn hoạt động sinh lý hệ thần kinh của côn trùng.Tác động chủ yếulà kích thích làm tăng quá trình tạo GAGB, ngăn chặn xung điện thần kinhtrong hệ thần kinh vận động của côn trùng Khi côn trùng tiếp xúc hoặc ănphải chất độc sẽ bị tê liệt, ngừng ăn rồi chết.

+ Forfox 400EC: chứa 400g hoạt chất Chlopyrifos trong một lítthương phẩm

- Đây là những loại TTS thông dụng được các bà con trồng rau đã vàđang dùng hiện nay

- Ngoài ra cần có dung dịch mật ong để làm thức ăn bổ sung cho ruồi II.4 Phương pháp nghiên cứu

II.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu

Phương pháp tiến hành: Tại những địa điểm nghiên cứu chúng tôi tiếnhành điều tra tình hình sử dụng TTS của các hộ nông dân bằng cách phỏngvấn trực tiếp trên đồng ruộng, hay sử dụng phiếu điều tra có các hệ thốngcâu hỏi cụ thể và rõ ràng.