Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế

Bò sát là động vật có nhiều đặc điểm sống khá phong phú và hấp dẫn đồng thời có nhiều lợi ích. Từ nhiều thế kỷ trước, khoa học đã dành khá nhiều thời gian và công sức để tìm hiểu về nh

MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Bò sát là động vật có nhiều đặc điểm sống khá phong phú và hấp dẫnđồng thời có nhiều lợi ích Từ nhiều thế kỷ trước, khoa học đã dành khá nhiềuthời gian và công sức để tìm hiểu về nhóm động vật có số lượng không nhiềunày, nhưng vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tìm hiểu của con người

Ở Việt Nam, các loài bò sát đã được chú ý dùng làm thuốc chữa bệnhtừ thế kỉ XIV, nhưng mãi đến thời kỳ thực dân Pháp xâm lược nước ta mới cónhững công trình nghiên cứu thực sự về Bò sát của các tác giả người nướcngoài, đặc biệt là R.Bourret và cộng sự trong thời gian từ năm 1924 – 1944.Tuy nhiên từ sau năm 1945 đến nay các công trình nghiên cứu về Bò sát đãđược đẩy mạnh nhiều hơn.

Trong số loài thằn lằn được biết ở Việt Nam, Leiolepis belliana (Gray,

1827) là một loài thuộc họ Nhông (Agamidae) Tên phổ thông ở Việt Nam lànhông cát Nhông cát thường gặp ở các dãi cát ven biển Việt Nam.

Từ rất lâu nhân dân ta đã biết sử dụng nhông cát để chữa các bệnh nhưhen suyễn, ghẻ lở, còi xương ở trẻ con Ngoài ra nhông cát còn được sử dụngđể ngâm rượu làm thuốc bổ như tắc kè và rắn Do thịt nhông thơm và ngonnên được sử dụng để làm thực phẩm Mặt khác khi phân tích thành phần thứcăn tự nhiên của chúng thấy có nhiều loài động vật và thực vật khác nhau,trong đó có nhiều loài côn trùng có hại như cào cào, châu chấu, bọ xít, bướm,ruồi Do đó có thể nói nhông cát được xem là loài động vật phổ biến ở cácvùng cát ven biển miền Trung Việt Nam đã cùng với các loài động vật kháctrong hệ sinh thái giữ vai trò nhất định, không những đảm bảo nâng dần năngsuất sinh học trong thiên nhiên mà còn có vai trò ổn định thế cân bằng trongcác hệ sinh thái.

Như vậy, nhông cát là một trong những nguồn tài nguyên thiên nhiêncó giá trị Nghiên cứu khai thác, sử dụng và bảo vệ nguồn tài nguyên động vậtvà thực vật trong đó có nhông cát là rất cần thiết để góp phần vào sự nghiệpphát triển kinh tế, văn hóa, khoa học và đời sống.

Trên thế giới và Việt Nam, việc nghiên cứu về nhông cát vẫn chưanhiều, phần lớn các công trình chỉ tập trung vào các vấn đề đặc điểm sinh học,sinh thái học, phân bố, phân loại dựa vào các đặc điểm về hình thái cấu tạo vàcác đặc điểm sinh học Năm 1991, tác giả Ngô Đắc Chứng trong luận án phótiến sĩ của mình đã mô tả kĩ về đặc điểm hình thái và sinh thái ở hai phân loài

của loài Leiolepis belliana là Leiolepis belliana belliana và Leiolepis bellianaguttata Cuvier Luận án đã bổ sung một số hiểu biết về nhông cát mà các tài

liệu có được cho đến nay chưa đề cập hoặc đề cập còn ít, cung cấp một số cơsở khoa học cho việc khai thác, sử dụng chăn nuôi và bảo vệ nguồn lợi này ởnước ta Tuy nhiên, do yêu cầu, mục đích của luận án và do số liệu chưa đầy

đủ nên chưa chứng minh Leiolepis belliana belliana và Leiolepis bellianaguttata Cuvier là hai phân loài, loài hay dạng sinh thái mà tác giả chỉ tạm

công nhận đó là hai phân loài.

Theo xu hướng hiện nay, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tửvào nghiên cứu phân loại động, thực vật và vi sinh vật rất phổ biến trên thếgiới Như đã nói ở trên, hai loài nhông cát ở Thừa Thiên Huế đã được nghiêncứu về hình thái học, tuy nhiên vẫn chưa được nghiên cứu ở mức độ phân tử

Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu

tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên

Huế”.

II MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU1 Mục tiêu

- Mô tả một số đặc điểm hình thái của nhông sọc Leiolepis bellianaguttata Cuvier.

- Phân tích ADN của nhông sọc về mặt định tính và định lượng.

2 Nhiệm vụ

- Thu mẫu nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thủy Phù –

Hương Thủy - Thừa Thiên Huế

- Mô tả đặc điểm hình thái về trọng lượng thân, chiều dài cơ thể, vẩy môi trên, vẩy môi dưới, lỗ đùi, một số tính trạng kích thước so với chiều dài thân và chiều dài đầu.

- Tách chiết và tinh sạch ADN, sau đó xác định nồng độ và chất lượng

ADN của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier

hình vẽ của Hardwicke từ mẫu thu ở Penang (Malaysia) Năm 1864, trong

“Reptiles of British India”, Gunther gọi là Leiolepis guttata Tên Leiolepisbelliana lại được Gray đặt vào năm1845 trong “Catalogue of the Lizards inthe British Museum” Về sau, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng tên này như:

Ridley (1869), Boulenger (1890), Annandale (1900), Laidlaw (1901), Schmidt(1927), Smith (1935), Taylor và Elbel (1950), Nertens (1961), Tên loài nàycũng được một công trình khác của C.H Pope nhắc đến Gần đây, trong công

trình nghiên cứu về nhiễm sắc thể, A KynpurHoBa cũng gọi là L.belliana.

Đặc biệt trong cuốn “Từ điển tên gọi các loài động vật năm thứ tiếng” (TiếngNga) xuất bản năm 1989 đã nêu tên 5 loài thằn lằn thuộc giống Leiolepis

trong đó có loài Leiolepis belliana (Gray).

Cho đến nay, việc nghiên cứu các mặt của các phân loài và loàitrong giống Leiolepis trên thế giới tương đối còn ít Trong số đó, đáng chú ýlà các công trình sau:

M Smith (1935) đã mô tả loài Leiolepis belliana ở Ấn Độ, Miến

Điện và Srilanca Cũng vào năm 1935, trong công trình nghiên cứu Bò sát ởtrung Quốc, C.H Pope trình bày khoá để xác định các giống trong họAgamidae ở Trung Quốc và các loài trong giống Leiolepis Theo C.H Popethì ở Trung Quốc họ Agamidae có các giống sau: Draco, Phoxophrys,Japalura, Genocephalus, Phisignathus và Leiolepis Riêng Leiolepis có một

loài là Leiolepis belliana (Gray) Loài này phân bố từ nam Miến Điện đến các

quần đảo Đông Nam Á và đảo Sumatra thuộc Indonesia, còn ở Trung Quốc đãtìm gặp ở Quảng Châu, Quảng Đông và đảo Hải Nam.

Căn cứ vào mẫu vật thu được ở một số vùng thuộc các tỉnh Loei,Kanchanaburi, Rat Buri và Sisaket (Thái Lan), E.H Taylor và R Elbel đã giới

thiệu một số dẫn liệu hình thái của L belliana belliana trong một công trình

về Ếch nhái – Bò sát ở Thái Lan.

Sau đó, trong bài “Các loài thằn lằn của Thái Lan” đăng trên tạp chí“The University of Kansas Science Bulletin”, E.H Taylor đã mô tả đặc trưngcủa loài này như sau: “Thân dẹp theo hướng lưng bụng; không có mào lưng;vẩy bình thường, nhỏ, xếp sát nhau, hình nón hay hình tháp, ít nhiều hóa sừng;túi họng không thấy rõ, nhưng có một hoặc hai nếp hầu nằm ngang; cả cá thểđực và cái đều có lỗ đùi; đuôi dài, đôi khi dày lên ở gốc, vảy gần như đồnghình; vảy bụng xếp đè lên nhau, tạo thành những vảy gần như ô vuông” Theo

E.H Taylor thì có hai phân loài được ghi nhận ở Thái Lan là L bellianabelliana (Gray) và L belliana rubritaeniata Mertens thuộc các vùng phía Tâyvà Trung Bắc; còn L.belliana guttata Cuvier có thể gặp ở các vùng xa về phía

Đông Thái Lan.

Năm 1976, trong luận án của mình, D.C Leroy có nói đến

L.belliana Theo ông, đặc trưng của chúng là không có mào lưng và sống ở

dưới đất Người ta thường gặp loài này ở vùng Nam Á và Indonesia.

Nhìn chung các công trình nói trên chỉ tập trung mô tả các đặc điểm

hình thái dùng trong phân loại và sự phân bố địa lí của Leiolepis belliana ở

các vùng nghiên cứu và trên thế giới Ngoài ra có các cồng trình nghiên cứuđối tượng này trên các lĩnh vặc khác như:

Về tập tính hoạt động và nơi ở của nhông cát có các dẫn liệu củaC.H.Pope và D.C.Leroy Theo các tác giả trên khi nghiên cứu ở Tây Pakistanvà Bắc Ấn Độ thì nhông cát ở trong các hang tự đào vùng đất cát dài từ 2,44 –2,74 m (8 – 9 feet) và sâu 1,22 – 1,52 m (4 – 5 feet) Những lúc trời rét và banđêm chúng chui vào hang và lấp kín cửa hang.

Đặc điểm cấu tạo giải phẩu đã được A.G.Edmund, R.Hoffstetter vàJ.P.Gase trình bày trong “Biology of the Reptilia” Khi nghiên cứu về răng

của các loài trong họ Agamidae, A.G.Edmund cho rằng L belliana có 3 – 4

răng trước hàm, 12 răng hàm và 12 răng ở phần trước xương răng Các răng ởphần trước xương răng thường lớn và theo kiểu răng nanh Đặc điểm của cộtsống và xương sườn của Leiolepis cũng giống như các loài trong họ Teiidaevà Agamidae nhưng có phần thân đốt và phần gian thân đốt không phân biệtrõ.

Đặc điểm của các loài trong họ Agamidae cũng như Iguanidae có cấutạo giống Sphenodon Còn cấu tạo của xương khẩu cái, xương hàm, xương lámía và ống đổ của cơ quan Jacobson theo kiểu “lỗ khoan cổ” như nhiều loàithằn lằn khác.

Về cấu trúc nhân có công trình nghiên cứu của A.KynpurHoBa, khi

nghiên cứu kiểu nhân của ba loài thằn lằn họ Agamidae là Stellio chernovi,Stellio himalayanus và Leiolepis belliana belliana Kết quả nghiên cứu này

cho thấy các loài trên có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36.

Về số lượng loài của giống Leiolepis Cuvier, theo công trình của nhiều

tác giả mà B.E.CokovoB làm chủ biên cho thấy có năm loài là L.belliana(Gray), L guttata Cuvier, L peugensis Peters, L.reevessi (Gray) vàL.triploida Peters, tất cả đều sống ở châu Á.

Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả

loài nhông Leiolepis guentherpetersi (Theo Cuvier, 1829) là Leiolepisbelliana guttata Cuvier) Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh

vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên.Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức phân tử đối với loài này [4].

2 Ở Việt Nam

Tài liệu đầu tiên nói đến nhông cát L.belliana (Gray) của R Bourret.Trong đó tác giả mô tả đặc điểm của loài và hai phân loài của L.belliana làL.belliana belliana và L.belliana guttata khác nhau về số lượng lỗ đùi ở mỗi

bên, Theo tác giả thì L.belliana phân bố ở Nam Miến Điện, Thái Lan, Đông

Dương, đảo Hải Nam, Nam Trung Quốc, Malaysia và Sumatra Ở Việt Namđã gặp ở Cù Lao Chàm, Nha Trang và Quảng Trị.

Căn cứ vào các mẫu vật đã thu được và các công trình đã công bố,Đào Văn Tiến đã công bố danh sách 77 loài thằn lằn hiện có ở Việt Nam cùngvới đặc điểm hình thái dùng trong phân loại cũng như khoá định loại các loàithằn lằn đó Trong số 17 loài thằn lằn thuộc họ Agamidae của danh sách này

có hai phân loài của L.belliana là nhông thường L.belliana belliana và nhônggutta L.bellana guttata Cuvier.

Năm 1981, trong “Kết quả điều tra cơ bản động vật miền Bắc ViệtNam” của Uỷ ban Khoa học và kĩ thuật Nhà nước do tác giả Trần Kiên,Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc thực hiện đã thu mẫu và xác định

L.belliana phân bố ở Hà Tĩnh và Vĩnh Linh (Quảng Trị).

Gần đây, theo kết quả điều tra về khi hệ động vật các đảo có nguồn gốclục địa của Viện Địa lý (Viện HLKH Viễn Đông – Liên Xô) cho thấy có

L.belliana ở Cù Lao Chàm trong số các đảo đã khảo sát từ vịnh Bắc Bộ đến

Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng”.

Đặc điểm hình thái của con cái tương tự như con đực, chỉ khác ở mộtsố điểm sau: Con cái da ở hai bên sườn không thể bạnh ra khi ở tư thế dọa nạt;ở con đực mặt lưng từ đầu đến đuôi màu phân ngựa với những vùng sẫm ở haibên, riêng mặt lưng phần thân có những chấm màu vàng viền đen hình mạnglưới, mặt bụng từ đầu đến đuôi màu trắng đục, đặc biệt hai bên thân có hai dảichấm màu da cam thể hiện khá rõ khi nhông bạnh nếp da hai bên sườn, còncon cái các chấm vàng viền đen ở mặt lưng sắp thành bốn dãy dài chạy dọclưng từ sau gáy tới gốc đuôi, ngoài ra ở hai bên sườn không có các dãy chấmmàu da cam.

Về tính trạng khối lượng cơ thể, chiều dài thân thì cá thể đực thườnglớn hơn cá thể cái (cá thể đực có khối lượng trung bình là 41,17 g và chiều dàithân trung bình là 114,0 mm; trong khi con cái là 30,52 g và 107,4 mm) Sốlượng lỗ đùi trung bình của cá thể đực ít hơn cá thể cái (con đực là 17 và concái là 18).

Đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana guttata Cuvier cũng tươngtự như ở phân loài L.belliana belliana, chỉ khác ở một số tính trạng sau: Mặtlưng của L.belliana guttata Cuvier không có các chấm vàng viền đen mà có

các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộngtrung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốcchân trước đến gốc chân sau Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấmmàu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn.

L.belliana guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g và

chiều dài thân trung bình là 120,83 mm Số lượng lỗ đùi là 20 – 23

Ở Thừa Thiên Huế, nhông cát sinh sống ở hai vùng sinh cảnh khácnhau là vùng cát ven biển và vùng nương rẫy ở đồng bằng các xã Thuỷ Phù,Thuận An và Lộc Hải.

Quan sát và theo dõi hoạt động của nhông cát ngoài tự nhiên, tác giảthấy rằng nhông hoa hoạt động ban ngày những hôm trời nắng với nhiệt độ

không khí từ 30 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 33 – 40oC và độ ẩm từ 30 – 78 %.Nhông sọc hoạt động ở nhiệt độ không khí từ 27 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ27 – 59oC và độ ẩm 30 – 64 % Chúng hoàn toàn không hoạt động vào nhữngngày mưa, trời âm u hoặc trước lúc bắt đầu mưa và về mùa đông (từ tháng XI– tháng III) khi nhiệt độ không khí nhỏ hơn 25oC và độ ẩm trên 90 % Vàonhững ngày nắng nóng (nhiệt độ tren 38oC) chúng vẫn hoạt động với điều kiệnlà độ ẩm thấp.

Ngoài ra vào những ngày nắng nóng nhiệt độ mặt đất tăng lên quá caocó thể trên 50oC, nhông cát vẫn hoạt động Lúc đó chúng kiếm ăn trong cácbóng râm hoặc chạy rất nhanh trên cát hoặc các cây cỏ khác.

Từ tháng XI đến tháng III nhông cát trú đông trong hang Vào thời kìnày nhiệt độ trung bình trong hang xuống thấp từ 18,5 – 24,4oC, độ ẩm trungbình từ 83 – 92oC

Về vấn đề sinh sản của nhông cát, tác giả lưu ý một số vấn đề sau: “Đốivới loài nhông hoa, kích thước và khối lượng của tinh hoàn và của buồngtrứng vào các tháng IV và VI lớn hơn các tháng còn lại Trong khi đó khốilượng thể mỡ lại bé vào các tháng IV, V và VI và lớn hơn vào các tháng khác.

Đối với nhông sọc, khối lượng của buồng trứng vào các tháng IV, VIvà VII, trong khi khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng này và lớn hơn vàocác tháng khác.

Trứng có kích thước lớn hơn 4 mm chỉ thấy xuất hiện vào tháng IV vàVI ở phân loài nhông hoa và vào tháng IV, VI và VII ở phân loài nhông sọc.

Như vậy mùa sinh sản của nhông hoa là từ tháng IV đến tháng VI, củanhông sọc là từ tháng IV đến tháng VII hàng năm Đặc biệt, trong tất cảnhững mẫu vật thu được ở Thuỷ Phù và Lộc Hải không có cá thể nào là đựcnên đưa đến khả năng nhông sọc là loài thằn lằn trinh sinh, tức là trứng pháttriển không có sự thụ tinh [4] Tuy nhiên, tác giả cũng nhấn mạnh đây có phảilà loài trinh sinh hay không vẫn còn là vấn đề nghi vấn và cần tiếp tục theodõi.

II TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước.

Trong những thập kỷ qua, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tử,phân loại học phân tử đã có những bước tiến bộ đáng kể Đã có nhiều côngtrình nghiên cứu về lĩnh vực này trên các đối tượng động vật, thực vật và visinh vật Những thành tựu này đặc biệt có ý nghĩa đối với những loài mớiđược phát hiện hay với những loài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên

Việc nghiên cứu tính đa hình các cá thể trong một quần đàn, các quầnđàn trong một giống, các giống với nhau, các họ với nhau hoặc các bộ vớinhau nhằm mục đích cải biến di truyền, chọn giống, hoàn thiện cây tiến hóa,tìm hiểu lịch sử di cư liên quan tới địa lý, nghiên cứu sự liên quan giữa tính đahình và khả năng chống chịu bệnh tật hoặc dễ nhiễm bệnh và pháp y hình sự.

Để nghiên cứu tính đa hình và phân loài người ta thường sử dụng cácphương pháp sinh hóa cổ điển như isoenzyme đa hình, hay các phương phápchỉ thị phân tử hiện đại như ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RADP),ADN đa hình chiều dài các phân đoạn được cắt giới hạn (RELP), ADN đahình độ dài các phân đoạn được khuếch đại (AFLP), vi vệ tinh, đa hìnhnucleotide đơn (SNP) hay đọc trình tự rồi trực tiếp so sánh các trình tự ADNvới nhau Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định,không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau đêr hoàn thiện kết quảnghiên cứu Đặc biệt khi các phương pháp phân loại hình thái đã bão hòakhông thể đi sâu được nữa, thì các phương pháp sinh học phân tử sẽ trợ giúpmột cách có hiệu quả.

Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tảmột loài nhông mới thuộc giống Leiolepis CUVIER, 1829 có nguồn gốc từ

Việt Nam là Leiolepis guentherpetersi Đây là một trong hai loài nhông có

mặt ở Thừa Thiên Huế Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinhvật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên.Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức độ phân tử đối với loài này.

Turbeville et a (1991) dựa trên sự phân tích 18S rRNA để nghiên cứusự phát sinh chủng loại của chân khớp Cũng bằng phương pháp này, Passhleyet al (1993) đã phân loại Bộ côn trùng biến thái hoàn toàn.

Miya và Nishida (1998) đã nghiên cứu sự phát sinh chủng loại và tiếnhóa ở mức độ phân tử của các loài cá sống ở vùng biển sâu thuộc giốngSternoptyx dựa trên phân tích gen mã hóa 12S – rRNA và 16S – rRNA ở tythể.

Boyce et al (1999) nghiên cứu cấp phân loại phụ của quần thể cừu

sừng lớn (Ovis canadensis) dựa trên phân tích 515 bp đầu tiên của vùng khởi

động ADN ty thể.

Nhiều nghiên cứu theo hướng đa dạng di truyền và nhận dạng các loàiở mức phân tử cũng đã được tiến hành (Carvalho et al 2001; Garrjardo et al.2002)

2.Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hai loàinhông cát ở Thừa Thiên Huế Tuy nhiên các công trình này chỉ nghiên cứu vềhình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học cũng như hoạtđộng ngày đêm của chúng (Ngô Đắc Chứng 1986, 1992, 1993, 1994) Ở ViệtNam nói chúng phân loại phân tử vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ Gần đâymột số công trình nghiên cứu theo hướng sử dụng các phương pháp sinh họcphân tử để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng của một sốloài đã được công bố.

Quyền Đình Thi và cộng sự (2003) đã sử dụng các kỹ thuậtmicrosatellite, mtRFLP, RAPD để phân tích đa hình của các quần thể đàn tômsú, cá tra nuôi ở Việt Nam Nhóm nghiên cứu đã tìm được nhiều chỉ thị phântử đặc trưng như RAPD để phân biệt các quần đàn cá tra nuôi trong các trại cákhác nhau Những chỉ thị này có thể được nghiên cứu tiếp phục vụ công tácchọn giống [13].

Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa dạngphân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng PCR – RAPD Cũngbằng kĩ thuật này, Đinh Thị Phương Anh (2005) đã nghiên cứu tính đa dạngcủa thạch sùng vùng núi Bà Nà, Đà Nẵng [1,3].

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH

Có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình, mỗi phương phápđều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng cóthể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu.

1 Phương pháp isoenzyme cổ điển

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc biệt phản ứng hóahọc và là chất xúc tác sinh học Isoenzym là những dạng khác nhau của mộtenzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưng lại khác nhau về phươngdiện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus gene khácnhau xác định Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym dochỉ một locus gene xác định (Prakash, 1969) [7,10].

Hiện tượng các phân tử enzym có nhiều biến dạng tồn tại trong quầnđàn tự nhiên là kết quả của các đột biến gây ra sự thay thế các acid amin trongcấu trúc bậc một của chuỗi polypeptid Chính vì vậy khi điện di trên gelagarose, tinh bột thuỷ phân, polyacrylamide cùng với việc phối hợp nhuộm tếbào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, pháthiện các isoenzyme và các allozyme.

Các hệ thống isozyne đa hình là các mô hình rất thuận lợi cho việcnghiên cứu, do bản chất di truyền tương đối đơn giản và hầu hết được biểuhiện di truyền đồng trội Do đó khi sử dụng các dữ kiện về đa hình isozymekhông những biết kiểu gen của cá thể mà còn biết mức độ dị hợp của quầnđàn Mặt khác, mỗi biến dạng phân tử enzyme là một “chỉ thị” của gene,

nghiên cứu quan hệ họ hàng, nguồn gốc của vật nuôi, gia súc Dựa trên tần sốallele, người ta xác định được khoảng cách di truyền giữa các quần đàn.

Nhiều nghiên cứu trên động vật, côn trùng, sử dụng các phương phápđánh giá trên cho thấy số đo khoảng cách di truyền có tương quan rõ rệt vớicác thứ hạng phân loại của nhóm sinh vật nghiên cứu (Manwell và Barker,1970; Namikawa, 1972) [7,10].

Những chỉ thị isozyme chỉ thể hiện ở những giai đoạn khác nhau trongquá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mởgene Mặt khác do có số lượng không nhiều mà sự biểu hiện lại phụ thuộc vàogiai đoạn phát triển cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền củamột tính trạng nên chỉ thị isozyme được sử dụng tương đối hạn chế.

2 Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN

Chỉ thị ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình của ADN Nócó thể là những dòng gene có sẵn hay dưới dạng những thông tin di truyềnđược lưu giữ và chuyển tải trong các file dữ liệu máy tính (ví dụ như trình tựcác mồi SSR, RAPD, AFLP) Người ta chia chỉ thị ADN thành 3 loại chính:

- Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết enzyme hạn chế (RFLP vàAFLP).

- Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên (RAPD).- Chỉ thị dựa trên các trình tự ngắn lặp lại nhiều lần (tiểu vệ tinh)

2.1 Phương pháp RAPD

RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạnDNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên Phương pháp này do William(1990) Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn nhưngvới một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide Do kích thước bộgen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi

được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, vàthymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tựmồi ngẫu nhiên Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy,ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA(khác nhau) trên điện di đồ.

Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàntoàn giống nhau Kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những band vạchDNA có kích thước như nhau Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khácnhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ chomột số band vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ.

Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thểtrong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loàitrong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao.Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [12].

Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thướctừ 5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học Tuỳ theo hãng sản xuất,các mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau Yêu cầu cơ bản làmồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA nằmgiữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên Mồi càngngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng nhiều.Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân đoạnPCR càng ít đi.

Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làmvà ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giốngđộng vật, thực vật và vi sinh vật, còn gọi là phân loại phân tử [12].

2.2 Phương pháp RFLP

RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là DNA đahình chiều dài các phân đoạn DNA được cắt giới hạn Chỉ thị này lần đầu tiên

được biết đến khi Botstein sử dụng nó để lập bản đồ các gen có liên quan đếnbệnh ở người Các RFLD được sinh ra bởi những điểm cắt enzyme giới hạntrong DNA hệ gen Nó biểu thị sự khác nhau giữa các loại DNA, do nhữngđột biến tự nhiên gây ra như đột biến gene tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọigiống, loài thậm chí mỗi cá thể Bởi vậy khi sử dụng các enzyme hạn chế đểcắt các phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt đượctrên điện di đồ, thành các phân đoạn có nhỏ hơn có kích thước khác nhau thìcó thể phân biệt được trên điện di đồ.

Nếu hai trình tự phân đoạn DNA gần giống nhau hoàn toàn, tức là cómột vài nucleotide khác nhau trong trình tự, thì thực sự rất khó phát hiện ra sựkhác nhau giữa chúng trên điện di đồ nhưng chúng lại không đồng nhất vớinhau khi so sánh sơ đồ cắt enzyme hạn chế Khi người ta xử lý các mẫu DNAvới cùng một enzyme giới hạn nào đó sẽ tạo ra các phân đoạn cắt có kíchthước khác nhau Các phân đoạn cắt này được coi là các “điểm chỉ” đặc trưngcho từng loại DNA.

Ví dụ: Nếu chúng ta có hai phân tử DNA gần giống nhau về trình tựbase, dài 1000 bp, ngoại trừ sự đa hình sau: DNA1 có trình tự GGATCC tại vịtrí bắt đầu với base 324, trong khi DNA2 có trình tự GGTTCC đã bị thay thếbởi GGTTCC cùng vị trí Khi xử lý mỗi DNA đó với cùng một enzyme giới

hạn BamHI thì điều gì sẽ xảy ra với GGATCC? Kết quả điện di đoạn DNA

chỉ ra một sự khác nhau: với DNA1 cho hai band vạch DNA, trong khi đóDNA2 chỉ cho một band vạch, BamHI không cắt DNA2 do trình tự GGATCCđã bị thay thế bởi GGTTCC Vì vậy band chính khác từ một sự đa hình ditruyền rất nhỏ Đó gọi là sự đa hình RFLP.

Khác với phương pháp RAPD, phương pháp RFLP phải dùng hai mồicó những trìn tự nhất định để khuếch đại một phân đoạn DNA nào đó.

2.3 Phương pháp AFLP

AFLP là DNA đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cộng sựtìm ra vào năm 1993 Là một kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên mà thực hiệntrong điều kiện phản ứng PCR nghiêm ngặt Các mồi thường dài khoảng 17 –21 nucleotide và có đầu mút giống nhau hoàn toàn AFLP không bị ảnh hưởngbởi các thông số khuếch đại (chu kỳ, nhiệt độ, nồng độ khuôn, chu kỳ PCR)[12].

2.4 Microsatellite

Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequênc Repeats) là những trình tựnucleotide đặc biệt được tạo thành lặp lại nhiều lần từ một phân đoạnoligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh Phươngpháp truy tìm các phân đoạn ADN đơn giản lặp đi lặp lại được gọi là phươngpháp vi vệ tinh.

Bộ gene sinh vật nhân thực có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn dàingắn khác nhau tuỳ theo từng loài [12] Các chuỗi lặp lại này thường từ 1- 6nucleotide SSR được phát hiện và sử dụng đầu tiên ở người, hiện nay được sửdụng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực vật SSR cũngđược sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật.

Bản chất đa hình của SSR là ở chỗ nó có thể được sinh ra đa hình từ rấtnhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp hệ gene và có bản chất đồng trội, dễdàng phát hiện bằng PCR.

2.5 Đọc trình tự ADN

Có lẽ kỹ thuật quan trọng nhất có thể có được cho các nhà Sinh họcphân tử là đọc trình tự ADN, mà trong đó các vị trí nucleotide của phân đoạnADN được xác định một cách chính xác Các phương pháp xác định tình tự

trở thành nhanh chóng và có hiệu quả từ cuối thập kỷ 70 của thế kỷ trước.Phân tử ADN đầu tiên được xác định trình tự là hệ gene của bacteriophageoX174 (5386 bp) được hoàn thành vào năm 1975 Tiếp theo là các đoạn trìnhtự của virus SV40 (5243 bp) vào năm 1977 và pBR322 (4363 bp) vào năm1978 Dần dần đọc trình tự được áp dụng cho các trình tự dài hơn.

Có hai kỹ thuật khác nhau được phát triển đồng thời, phương pháp xácđịnh trình tự của F Sanger và A R Coulson (Anh) và phương pháp phân huỷhóa học của A Maxam và W Gilbert (Mỹ) Cả hai phương pháp đều chophép đọc trình tự với chiều dài hàng vài kb trong thời gian ngắn nhất.

Trong phân tích đa hình, tiến hóa, người ta thường đọc trình tự nhữnggene cấu trúc rồi đem so sánh với nhau tìm ra phần trăm đồng dạng và khácbiệt Phương pháp này có ưu điểm chính xác, nhưng không thực hiện được vớisố lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

2.6 Phân tích ADN ty thể

Ty thể là bào quan có kích thước hiển vi phổ biến ở mọi sinh vật, cả visinh vật hiếu khí Chức năng chủ yếu của ty thể là trung tâm giải phóng nănglượng của tế bào Ty thể có đầy đủ các thành phần quan trọng như: ADN,ARN, ATP và các hệ enzyme, do đó chúng có khả năng tự tổng hợp proteinđặc thù, cùng với lục lạp góp phần qui định tính di truyền của tế bào chất [11].mtDNA ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng, kích thước khoảng 15-20kb, trong đó bao gồm 13 gene mã hóa protein, 22 gene tRNA, 2 gen rRNA vàvùng không mã hóa dài khoảng 1000bp gọi là vùng điều khiển (vùng giàu A-T ở động vật không xương sống và vùng D-loop ở động vật có xương sống, làvùng không mã hóa duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mãmtDNA mtDNA là vật chất di truyền nằm ngoài nhân, di truyền theo dòngmẹ Sự đa dạng mtDNA có thể sử dụng rộng rãi trong phân loại phân tử bởicác đặc tính sau: (1) mtDNA có mặt ở hầu hết trong hệ gene động vật, (2) Tỷlệ tiến hoá của chúng nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì một gene nhân nào;

hơn nữa vùng điều khiển tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các vùng kháccủa mtDNA Vì vậy trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là mộtcông cụ rất hữu hiệu để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các quần đàncùng loài

- Nhông cát được thu ở Thủy Phù (Hương Thuỷ) và Lộc Hải (Phú Lộc)- Thừa Thiên Huế.

- Enzym proteinase K (Hãng Sigma, Mỹ)- ADN chuẩn (Hãng Pharmacia, Thụy Ðiển).

2 Dụng cụ

Để tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, tách chiết, điện di và

đánh giá độ tinh sạch của ADN nhông cát L.b.guttata Cuvier, chúng tôi đã sử

dụng các trang thiết bị thể hiện ở bảng 1:

Trang thiết bị Công ty sản xuấtBể ổn nhiệt

Máy soi ADN Mini – TransilluminatorTủ lạnh sâu - 200C

Tủ lạnh sâu - 700CCân

Thước đo mmKính lúp, compa

Bảng 1 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

3 Hóa chất

- Agarose

- Ethanol, phenol, cloroform, isoamyl.

Các hoá chất trên được mua tại các hãng Sigma (Mỹ), Serva (Đức),Pharmacia (Thụy Điển).

4 Dung dịch và đệm

- Đệm TE, pH 8.0

+ 10 mM Tris – Cl, pH 8.0 + 1 mM EDTA, pH 8.0

- Đệm TAE

+ 40 mM Tris – Cl + 2 mM EDTA, pH 8.3 H2O đến 1 lít

- Đệm cắt (Digestion buffer) + 100 mM NaCl

+ 10 mM Tris – Cl, pH 8.0 + 25 mM EDTA, pH 8.0 0,5 % (w/v) SDS

0,1 mg/ml proteinase K- Đệm tra mẫu (Loading buffer) 0,1 ml bromophenol blue 10% 0,3 ml glycerin 100%

H2O đến 1ml

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Phương pháp nghiên cứu lí thuyết

Thu thập và xử lý các tài liệu liên quan đến đề tài.

2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.1 Phương pháp thu mẫu

Có nhiều cách để thu mẫu như: bắt bằng bẫy ống, bắt bằng thòng lọng,bắt bằng lưỡi câu, bắt bằng cách đào hang [4] Ở đây chúng tôi tiến hành thumẫu theo 2 cách chủ yếu:

2.1.1 Bắt bằng cách đào hang

Khi quan sát thấy nhông chui vào hang hoặc quan sát miệng hang đúnglà hang nhông, dùng que tre hoặc cành cây thọc vào hang để khỏi hất dấuhang rồi dùng cuốc hoặc xẻng để đào

Nhông thường có hang phụ nên trước khi đào phải bít miệng hang nàylại đồng thời thường xuyên theo dõi vì nhông có thể theo vết đào chạy ngượcra để tẩu thoát.

2.1.2 Bắt bằng cách giăng lưới

Khi quan sát miệng hang đúng là hang nhông thì dùng một miếng lướirộng hơn miệng hang để bịt lại và dùng các que cây giữ lưới Khi đó, nếunhông chui ra khỏi hang hoặc chui vào hang đều bị mắc lại ở lưới Cách nàyđơn giản hơn nhưng phải đợi tương đối lâu để bắt nhông.

Mẫu sau khi bắt phải còn sống và được nhốt trong lồng để cân trọnglượng, đo các tính trạng kích thước của cơ thể và dùng trong thí nghiệm phântích DNA Một điểm thuận lợi là nhông cát có thể không ăn trong nhiều ngàymà vẫn sống, chỉ cần thỉnh thoảng vẩy nước cho chúng.

2.2 Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái

- Dùng cân để cân trọng lượng của mẫu vật.

- Dùng thước và compa để đo các tính trạng: chiều dài thân, chiều dàiđầu, khoảng cách từ mũi đến mõm, từ mắt đến mõm, khoảng cách giữa haimắt, giữa hai mũi, khoảng cách từ tai đến mõm, từ mép miệng đến mõm,chiều dài mắt, chiều rộng đầu, chiều dài đùi, chiều dài ống chân.

- Dùng kính lúp để đếm chính xác số vẩy môi trên, vẩy môi dưới và lỗđùi.

- Xử lý các số liệu thu được theo phương pháp thống kê sinh học

2.3 Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế.

* Nguyên tắc:

Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm củacác base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ởbước sóng260 nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu, và cho phépxác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD-