Nghiên cứu tính đa hình di truyền của thằn lằn Leiolepis belliana guttata tại Thừa Thiên Huế

Phương pháp isoenzyme cổ điển

Chính vì vậy khi điện di trên gel agarose, tinh bột thuỷ phân, polyacrylamide cùng với việc phối hợp nhuộm tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, phát hiện các isoenzyme và các allozyme. Nhiều nghiên cứu trên động vật, côn trùng, sử dụng các phương pháp đỏnh giỏ trờn cho thấy số đo khoảng cỏch di truyền cú tương quan rừ rệt với các thứ hạng phân loại của nhóm sinh vật nghiên cứu (Manwell và Barker, 1970; Namikawa, 1972) [7,10]. Mặt khác do có số lượng không nhiều mà sự biểu hiện lại phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền của một tính trạng nên chỉ thị isozyme được sử dụng tương đối hạn chế.

Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN

Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao. Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống động vật, thực vật và vi sinh vật, còn gọi là phân loại phân tử [12]. Bởi vậy khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt các phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được trên điện di đồ, thành các phân đoạn có nhỏ hơn có kích thước khác nhau thì có thể phân biệt được trên điện di đồ.

Nếu hai trình tự phân đoạn DNA gần giống nhau hoàn toàn, tức là có một vài nucleotide khác nhau trong trình tự, thì thực sự rất khó phát hiện ra sự khác nhau giữa chúng trên điện di đồ nhưng chúng lại không đồng nhất với nhau khi so sánh sơ đồ cắt enzyme hạn chế. Ví dụ: Nếu chúng ta có hai phân tử DNA gần giống nhau về trình tự base, dài 1000 bp, ngoại trừ sự đa hình sau: DNA1 có trình tự GGATCC tại vị trí bắt đầu với base 324, trong khi DNA2 có trình tự GGTTCC đã bị thay thế bởi GGTTCC cùng vị trí. Kết quả điện di đoạn DNA chỉ ra một sự khác nhau: với DNA1 cho hai band vạch DNA, trong khi đó DNA2 chỉ cho một band vạch, BamHI không cắt DNA2 do trình tự GGATCC đã bị thay thế bởi GGTTCC.

Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequênc Repeats) là những trình tự nucleotide đặc biệt được tạo thành lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh. Có lẽ kỹ thuật quan trọng nhất có thể có được cho các nhà Sinh học phân tử là đọc trình tự ADN, mà trong đó các vị trí nucleotide của phân đoạn ADN được xác định một cách chính xác. Ty thể có đầy đủ các thành phần quan trọng như: ADN, ARN, ATP và các hệ enzyme, do đó chúng có khả năng tự tổng hợp protein đặc thù, cùng với lục lạp góp phần qui định tính di truyền của tế bào chất [11].

Sự đa dạng mtDNA có thể sử dụng rộng rãi trong phân loại phân tử bởi các đặc tính sau: (1) mtDNA có mặt ở hầu hết trong hệ gene động vật, (2) Tỷ lệ tiến hoá của chúng nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì một gene nhân nào;.

NGUYÊN LIỆU 1. Nguyên liệu

Các hoá chất trên được mua tại các hãng Sigma (Mỹ), Serva (Đức), Pharmacia (Thụy Điển).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nhông thường có hang phụ nên trước khi đào phải bít miệng hang này lại đồng thời thường xuyờn theo dừi vỡ nhụng cú thể theo vết đào chạy ngược ra để tẩu thoát. - Dùng thước và compa để đo các tính trạng: chiều dài thân, chiều dài đầu, khoảng cỏch từ mũi đến mừm, từ mắt đến mừm, khoảng cỏch giữa hai mắt, giữa hai mũi, khoảng cỏch từ tai đến mừm, từ mộp miệng đến mừm, chiều dài mắt, chiều rộng đầu, chiều dài đùi, chiều dài ống chân. Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng260 nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu, và cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD-.

280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethimidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV.

- Nhuộm ADN bằng ethimidium bromide (EtBr): Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhẹ nhàng khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0,5 g/ml khoảng 10 – 15 phút trên máy lắc nhẹ. - Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi ADN, sau đó chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh gel tự động (Pharmacia Biotech, Thụy Điển). Vì vậy việc lựa chọn một phương pháp tách chiết ADN thích hợp nhất cho từng đối tượng và đạt hiệu suất, độ tinh sạch cao nhất để phục vụ cho những thí nghiệm sau là rất quan trọng.

Màng tế bào và màng nhân phải được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học (nghiền, lắc mạnh) và các chất tẩy mạnh (SDS..), ADN genom giải phóng ra được tách sạch protein nhờ proteinase K và hỗn hợp phenol, chloroform, izoamyl alcohol.

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 1. Đặc điểm hình thái chung

Như vậy khối lợng cơ thể trung bình và chiều dài thân trung bình của các mẫu vật chúng tôi phân tích nhỏ hơn kết quả nghiên cứu trước đây [4]: khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g, chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Sai khác này có thể là do chúng tôi thu mẫu vào giai đoạn sớm hơn trong quá trình sinh trưởng của nhông cát, vì vậy mà cơ thể của chúng chưa đạt kích thước tối đa. Sự khác nhau về số lượng lỗ đùi giữa các cá thể là tương đối lớn, cho ta thấy tính đa hình của loài nhông cát này.

Như vậy ta thấy số lượng vảy của nhông cát L.b.guttata Cuvier cũng biến thiên tương đối đa dạng. Các tính trạng kích thước cơ thể của nhông cát được đem tính % so với chiều dài thân và chiều dài đầu. Qua bảng trên cho thấy tỷ lệ % kích thước so với chiều dài đầu và chiều dài thân giữa các cá thể khác nhau không chênh lệch nhiều, chỉ có tỷ lệ.

PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ADN MÔ NHÔNG CÁT

- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết ADN là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị cắt bởi enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các ADN cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzym nội bào (deoxyribonuclease, ribonuclease).

Ðể đảm bảo điều kiện này, trước khi nghiền mẫu phải để lạnh cối, chày sứ trong tủ lạnh - 70oC. Sau khi nghiền mẫu, tế bào được hòa trong dung dịch đệm có chứa chất tẩy SDS và proteinase K. Sau khi tách được ADN, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

Sau khi nhuộm bằng EtBr, các vạch trong gel agarose phát quang dưới tia tử ngoại (UV). Kết quả cho thấy các phân tử ADN mô nhông cát (đuôi, cơ, gan) có phân tử lượng lớn, tập trung thành một băng chính.Và ta thấy các phân tử ADN tách chiết từ các loại mô của nhông cát L.b.guttata Cuvier đều có kích thước lớn hơn 12216 bp. Sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose, chúng tôi tiến hành đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN bằng máy đo quang phổ 8425A (Hewlet Packard, Mỹ): Các chế phẩm ADN được kiểm tra ở các bước sóng 260nm và 280nm.

Qua hình và bảng cho thấy phổ hấp thụ tử ngoại của các chế phẩm ADN đều có đỉnh cực đại ở bước sóng 260nm.