Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ Nguyễn Thị Nha Trang NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1 MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ Nguyễn Thị Nha Trang NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1 MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận đƣợc sự quan tâm, động viên giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Đỗ Thị Phúc - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể các thầy cô trong bộ môn Di truyền học- Khoa Sinh học- Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết đã luôn góp ý, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày .... tháng .... năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Nha Trang BẢNG KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu DNA Tiếng Anh TiếngViệt Deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ CDS Coding sequence Trình tự mã hóa cho protein CTAB Cetyl trimethylamoni bromide dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Ethylen diamin tetraacetic acid Kb Kilobase M Maker Thang chuẩn DNA PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA IRRI International Rice Research Institute Viện nghiên cứu lúa Quốc tế i MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3 1.1.Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ........................................................................ 3 1.2.Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật....................................... 5 1.2.1.Đất mặn .............................................................................................. 5 1.2.2.Cơ chế thích nghi stress mặn ở Thực vật................................... ........6 1.2.3.Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa...............................................7 1.3.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở Thực vật......................................................................................................................9 1.4. Protein HKT ở thực vật........................................................................... .10 1.4.1. Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật.......................... ... 10 1.4.2 Họ protein HKT ở lúa ...................................................................... 12 1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen..........13 1.6.Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 ................................... 14 1.7.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài ....................................... 15 1.7.1.Mục tiêu ........................................................................................... 15 1.7.2. Nội dung nghiên cứu....................................................................... 15 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 16 2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu ........................................................................ 16 2.1.2. Mồi phản ứng PCR ......................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất ......................................................................................... 17 2.1.3.1.Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số........................18 2.1.3.2.Môi trƣờng trồng thủy canh...................................................18 2.1.3.3.Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase 2.1.3.4.Sản phẩm phản ứng PCR.......................................................19 2.1.4. Thiết bị ............................................................................................ 19 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 19 2.2.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thuỷ canh và thí nghiệm xử lý mặn... 19 2.2.1.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh……..................20 2.2.1.2.Thí nghiệm xử lý mặn........................................................... 20 ii 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số ................................................................. 21 2.2.3. Phƣơng pháp PCR........................................................................... 22 2.2.4. Tinh sạch ......................................................................................... 23 2.2.5. Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu .......................................... 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25 3.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa.................................... 25 3.2.Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa.................................................................................................. 27 3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn .................. 27 3.2.2. Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn ........................ 30 3.2.3.Kết quả đánh giá khối lƣợng thân sau khi xử lý mặn....................31 3.2.4.Kết quả đánh giá khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn........................32 3.3. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa ......................................................... 33 3.4. Nhân bản gen OsHKT1 ......................................................................... 34 3.5.Giải trình tự gen OsHKT1 ở 8 giống lúa. .............................................. 36 3.6. Phân tích trình tự gen ở 8 giống lúa ..................................................... 36 3.7.Phân tích trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa bởi gen OsHKT1 từ 8 giống lúa ................................................................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 42 Kết luận ....................................................................................................... 42 Kiến nghị ...................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại chi Oryza[85]. ........................................................... 4 Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ...... 5 Bảng 1.3. Danh sách các protein thuộc họ protein HKT ở lúa ................... 12 Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa nghiên cứu ......................................... 16 Bảng 2.2. Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ....... 17 Bảng 2.3. Môi trƣờng đa lƣợng ............................................................. 18 Bảng 2.4. Môi trƣờng vi lƣợng ....................................................................... 18 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa...20 Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển........ 21 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 23 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................... 23 Bảng 3.1Vị trí sai khác acid amin...................................................................41 Bảng 3.2.Bảng số liệu sau 3 ngày xử lý mặn..................................................60 Bảng 3.3.Bảng số liệu sau 7 ngày xử lý mặn..................................................62 Bảng 3.4.Bảng số liệu sau 14 ngày xử lý mặn................................................64 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.) ................................................................ 3 Hình 2. Cơ chế thích nghi stress chung ở Thực vật ..................................... 7 Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao.....................................................9 Hình 4.Chức năng vận chuyển của protein HKT........... ....................... 11 Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín gen OsHKT ở lúa ........................................................................................ 13 Hình 6. Vị trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1 .................................................. 16 Hình 7. Lúa trồng trƣớc khi xử lý mặn ........................................................... 25 Hình 8. Lúa sau 3 ngày xử lý mặn .......................................................... 25 Hình 9. Lúa sau 7 ngày xử lý mặn .................................................................. 25 Hình 10. Lúa sau 14 ngày xử lý mặn .............................................................. 25 Hình 11. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 3 ngày ..................................................................................... 26 Hình 12. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 7 ngày .................................................................................... 26 Hình 13. Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 14 ngày .................................................................................. 27 Hình 14. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn ............... 28 Hình 15.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn ............... 29 Hình 16.Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn ............. 29 Hình 17. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn ................... 30 Hình 18. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 7 ngày xử lý mặn ................... 31 Hình 19.Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 14 ngày xử lý mặn .................. 31 Hình 20. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng thân ..................................................... 32 Hình 21.Đồ thị biểu diễn khối lƣợng rễ...........................................................33 Hình 22.DNA tổng số tách từ lá lúa...............................................................33 Hình 23. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 1 ...................................... 34 v Hình 24. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 2 ...................................... 34 Hình 25. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 ...................................... 35 Hình 26. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4 ...................................... 36 Hình 27. Hình ảnh cho thấy một phần kết quả giải trình tự đối với mẫu nếp nõn tre sử dụng cặp mồi 3 ............................................................................... 36 Hình 28. So sánh trình tự vùng mã hoá của gen giữa các giống lúa............... 38 Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hoá của gen giữa các giống lúa... 39 Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc giữa các giống lúa ........................................................................................... 40 Hình 31. Cấu trúc protein xuyên màng ........................................................... 41 vi MỞ ĐẦU Lúa là một trong năm loại cây lƣơng thực chính trên thế giới, diện tích trồng lúa và lƣợng tiêu thụ chủ yếu ở Đông Nam Á và Châu Phi... Hiện nay, lúa đƣợc trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [4, 61 ]. Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa với nền văn minh lúa nƣớc có trên 4000 năm lịch sử. Việt Nam còn đƣợc xếp vào hàng những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lƣợng gạo xuất khẩu năm 2014 lên tới 44,5 triệu tấn lúa (27,8 triệu tấn gạo). Lúa gạo cung cấp nguồn lƣơng thực chính cho chúng ta, tạo việc làm cho hàng triệu nông dân và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của Việt Nam. Tuy nhiên, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực, sự khan hiếm về nƣớc tƣới phục vụ cho nông nghiệp đã đƣợc báo động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề then chốt trong những năm tới. Với tầm quan trọng nhƣ vậy, ngƣời ta đã hoạch định một thứ tự ƣu tiên trong đầu tƣ nghiên cứu tính chống chịu mặn và chống chịu hạn trên toàn thế giới, trong lĩnh vực cải tiến giống cây trồng, sau đó là tính chống chịu lạnh, chống chịu ngập úng, chống chịu đất có vấn đề (acid, thiếu P, ngộ độc Fe, ngộ độc Al, thiếu Zn, Mg, Mn và một số chất vi lƣợng khác nhƣ Cu,…). Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần đƣợc quan tâm nghiên cứu. Cây trồng trên đất nhiễm mặn bị ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và năng suất. Khả năng điều hòa cân bằng hàm lƣợng ion Na + trong tế bào là một trong những cơ chế quan trọng giúp cây sinh trƣởng, phát triển trong điều kiện đất nhiễm mặn. Cơ chế điều hòa đƣợc thực hiện thông qua việc: Hạn chế lƣợng ion Na+ đƣa vào tế bào; khu trú ion Na+ vào không bào; thải loại ion Na+ ra ngoài môi trƣờng. Gen OsHKT1 mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na+ vào tế 1 bào ở cây lúa. Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của gen OsHKT1 giúp làm sáng tỏ cơ chế chịu mặn của cây lúa. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa” nhằm nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 ở lúa. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét sơ lƣợc về cây lúa Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lƣơng thực chính của nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới. Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nƣớc Châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180 - 200 kg/ngƣời, ở Châu Mỹ, Châu Âu khoảng 100 kg/ngƣời [6]. Hình 1. Cây lúa (Oryza sativa L.)[6] Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trƣớc đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là ngƣời đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài . Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế, Philippines năm 1994 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng[61]. 3 Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đƣa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome [61]. Danh sách các loài, số lƣợng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài đƣợc ghi ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Phân loại chi Oryza[61] Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23 loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. [3,6]. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa đƣợc gieo trồng khắp thế giới và đƣợc chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica. Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian nhƣ Javanica v.v.. Nghiên cứu biến đổi trình tự DNA của gen bằng phƣơng pháp địa lý thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng [2,7,8]. Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã đƣợc thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau 4 của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ là Indica và Japonica. Và đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm lúa đƣợc trình bày ở bảng 1.2. Bảng 1.2. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa[61] Đặc tính INDICA JAVANICA JAPONICA Thân -Thân cao -Thân cao trung bình Thân thấp Chồi -Nở bụi mạnh -Nở bụi thấp Nở bụi trung bình Lá -Lá rộng, xanh nhạt -Hạt thon dài, dẹp -Hạt hầu nhƣ không có đuôi Hạt -Trấu ít lông và lông ngắn -Hạt dễ rụng Sinh học -Tính quang cảm rất thay đổi -Lá rộng, cứng, xanh nhạt -Hạt to, dầy -Hạt không có đuôi hoặc có đuôi dài -Trấu có lông dài -Ít rụng hạt -Tính quang cảm rất yếu Lá hẹp, xanh đậm -Hạt tròn, ngắn -Hạt không đuôi tới có đuôi dài -Trấu có lông dài và dầy -Ít rụng hạt -Tính quang cảm rất thay đổi 1.2 Đất mặn và cơ chế chống chịu mặn ở Thực vật 1.2.1 Đất mặn Tất cả các loại đất đều có chứa một lƣợng muối tan nào dó. Trong số đó có nhiều loại muối là các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cây trồng. Tuy nhiên, khi số lƣợng các muối trong đất vuợt quá giá trị cho phép, thì sự phát triển, năng suất, chất luợng của hầu hết các loại cây đều bị ảnh hƣởng xấu, mức độ ảnh hƣởng tuỳ thuộc vào loại và số lƣợng muối có mặt trong đất, tuỳ thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng, vào loại thực vật và các yếu tố môi trƣờng. Do đó khi đất chứa một lƣợng muối gây cản trở và ảnh hƣởng đến chức năng cần thiết để cây sinh trƣởng, thì đất đó đƣợc gọi là đất bị ảnh hƣởng bởi mặn (salt affected soil). Tóm lại, rất khó có thể định nghĩa đất mặn một cách chính xác và đầy đủ, vì vậy dựa vào chỉ tiêu độ dẫn điện EC, hoặc phần trăm Na+ trao 5 đổi (EPS) hoặc tỉ lệ hấp thu Na+ (SAR) và độ pH của đất bão hòa nƣớc [19] đa số các nhà khoa học đã định nghĩa đất mặn là đất có độ dẫn điện EC cao hơn 4 dS/m ở nhiệt độ 250C, phần trăm Na+ trao đổi (ESP) thấp hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 [1,62]. Ðất mặn đƣợc chia làm 2 dạng: đất mặn duyên hải và đất mặn nội địa: - Ðất mặn duyên hải: xuất hiện ở vùng ven biển, tính mặn chủ yếu do tràn ngập của nƣớc biển và nƣớc thƣờng có pH thấp, đất mặn ven biển thƣờng có tổng số muối tan lớn hơn 0.5% (tƣơng đƣơng với > 0,15% Cl-) và nếu đạt mức nhiễm mặn trung bình thì tổng số muối tan lớn hơn 0,25% (˜ 0.05 % Cl-) - Ðất mặn nội địa: xuất hiện ở vùng khô và bán khô, tính mặn do nƣớc dẫn thủy hoặc nuớc ngầm, sự bốc hơi cao dẫn đến muối tập trung ở vùng rễ và đất thƣờng có pH cao [32]. 1.2.2 Cơ chế thích nghi stress mặn ở thực vật Nồng độ muối cao trong đất là nguyên nhân gây ra 2 vấn đề chính đối với thực vật: (1) giảm điện thế nƣớc trong đất gây khó khăn cho sự hấp thụ nƣớc, dẫn đến tính trạng thiếu nƣớc; (2) sự tích tụ hàm luợng Na+ và Cl- cao gây độc đối với tế bào thực vật [10] và gián tiếp gây độc do khó hấp thụ các chất dinh duỡng cần thiết khác. Khả năng chống chịu mặn của thực vật phụ thuộc vào sự thích nghi sinh lý, sinh hóa và phân tử đƣợc kích hoạt bằng bộ gen để sống sót trong môi truờng muối (Hình 2). Cơ chế thích ứng sẽ thiết lập lại sự vận chuyển nƣớc, giới hạn hấp thụ Na+ và Cl- hoặc làm giảm nồng độ của chúng trong tế bào chất và cho phép hấp thụ các ion cần thiết cho quá trình sinh trƣởng. Thực vật cảm nhận stress mặn là do điện thế nƣớc trong môi trƣờng thấp,cây không thể hút nƣớc và dẫn đến bị mất nuớc, kết quả là sự sinh trƣởng bị ức chế và dần bị chậm lại. Vì thế, để có thể chống chịu với điều kiện điện thế nƣớc thấp do stress mặn gây ra, thực vật phải điều chỉnh quá trình thoát hơi nƣớc, từ đó có thể giới hạn sự mất nƣớc hoặc là tiến hành điều chỉnh điện thế thẩm thấu [19]. 6 Stress thẩm thấu Tình trạng thiếu nƣớc Độc tính của Na+ và Cl- Stress Mặn Hoạt hóa gen Cơ chế chống chịu Stress ion Sự không cân bằng ion / Ca2+, K+, Mn2+, Mg2+, NO-, PO42-, 2- chung ở thực vật [19] Hình 2. Cơ chế thích nghi SO stress 4 Ngoài ra, stress ion do cây hấp thụ chủ yếu các ion độc Na+ và Cl- vào trong tế bào và sự không cân bằng các ion (Ca+, K+, Mn2+, Mg2+, NO3+, PO42,SO42- .v.v.) sẽ gây rối loạn trao đổi chất của tế bào, ức chế hoạt động enzyme và các chất kích thích sinh trƣởng [19]. Ðồng thời, các hoạt động sinh lý của tế bào cũng bị ảnh huởng nhƣ: quá trình quang hợp giảm mạnh [57], quá trình tổng hợp sắc tố bị ức chế trong khi đó quá trình hô hấp lại tăng nhanh, các cơ chất bị phân hủy lớn nhƣng hiệu quả năng lƣợng thấp, vì vậy thực vật không bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, chất dự trữ dần dần bị hao hụt, cây không sinh trƣởng đƣợc, còi cọc, năng suất thấp, và nếu kéo dài sẽ dẫn đến bị chết. Ðể có thể sinh trƣởng trên đất mặn, và hạn chế ảnh huởng của Na+ và Cl-, thực vật đã phát triển cơ chế điều hòa với chiến lƣợc: giảm sự xâm nhập và giảm nồng độ của Na+ trong tế bào chất bằng cách loại thải và khu trú ion Na+ vào không bào, ƣu tiên hấp thụ K+(là ion đóng vai trò quyết định trong việc đóng mở khí khổng, hoạt hóa enzyme, quang hợp và điều hòa áp suất thẩm thấu) để duy trì tỉ lệ K+/Na+ trong chất nền [19] . 7 1.2.3 Phản ứng chống chịu mặn của cây lúa Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trƣởng khác nhau đối với cây lúa. Cơ chế chống chịu mặn của cây đƣợc biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [55]. Mặn ảnh hƣởng đến hoạt động sinh trƣởng của cây lúa dƣới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau[56,57]. Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn hạt nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá 2-3), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trƣởng, kế đến nhiễm trong thời kỳ thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kỳ hạt chín[57,59].Tuy nhiên, một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trổ, nó không mẫn cảm với stress do mặn. Do đó, ngƣời ta phải chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng. Theo [62], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quan đến tính chống chịu mặn đƣợc tóm tắt nhƣ sau: • Hiện tƣợng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lƣợng muối dƣ thừa nhờ hiện tƣợng hấp thu có chọn lọc. • Hiện tƣợng tái hấp thu - Cây hấp thu một lƣợng muối thừa nhƣng đƣợc tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân. • Chuyển vị từ rễ đến chồi – Tính trạng chống chịu mặn đƣợc phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi . • Hiện tƣợng ngăn cách từ lá đến lá - Lƣợng muối dƣ thừa đƣợc chuyển từ lá non sang lá già, muối đƣợc định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngƣợc lại. • Chống chịu ở mô – Cây hấp thu muối và đƣợc ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hƣởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trƣởng của cây 8 • Ảnh hƣởng pha loãng – Cây hấp thu muối nhƣng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cƣờng tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lƣợng nƣớc trong chồi Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi đƣợc xem nhƣ là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chống chịu mặn [41,43].Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na +/K+ trong chồi (< 1) giúp cho cây sống đƣợc ở môi trƣờng nhiễm mặn. 1.3 Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật Đến nay, một loạt các hệ thống vận chuyển đã đƣợc báo cáo là có khả năng giúp thực vật cải thiện khả năng chịu mặn bằng cách ức chế sự hấp thụ Na+, hoặc vận chuyển Na+ vào không bào của tế bào (Hình 3). Mô hình đơn giản cho cơ chế hấp thụ K+ / Na+ , sự tuần hoàn và loại bỏ Na+ bởi các lớp khác nhau của Na+ channels/transporters đƣợc thể hiện trong (hình 3). Chẳng hạn nhƣ Kênh vận chuyển cation không chuyên biệt-Nonselective cation channels ( NSCCs ), kênh đồng vận chuyển cation- Cl- - cation-Cl−cotransporter (CCC), kênh vận chuyển cation ái lực thấp - low-affinity cation transporter (LCT) salt overly sensitive 1 (SOS1) , Na+ / H+ antiporter NHX1 và kênh vận chuyển K+ ái lực cao - high affinity potassium transporter (HKT / HAK). Tế bào rễ thực vật hấp thụ Na+ / K+ từ đất thông qua một vài kênh nhƣ (NSCCs, AKT1, LCT1 và CCC), transporter (KUP / HAK / KT và HKT) và apoplastic. Kênh thẩm thấu-Permeations Channel và apoplastic là những con đƣờng chính để hấp thụ Na+ dƣới tress muối. Con đƣờng SOS trung gian loại bỏ Na+ qua màng tế bào ra ngoài dung dịch đất hoặc apoplast. NHX1 phân vùng Na+ trong không bào và điều hòa nồng độ Na+ trong cytosol. AtHKT1; 1, OsHKT1; 5, TaHKT1; 5 và TmHKT1; 4/5 đƣợc chứng minh có vai trò lấy Na+ từ xylem vào các tế bào nhu mô xylem và ngăn chặn Na+ tích lũy trong chồi. Có giả thuyết cho rằng AtHKT1; 1 gián tiếp phục hồi Na+ từ chồi tới rễ thông qua việc loại bỏ các Na+ từ xylem và chuyên chở Na + vào . Các quá trình này đảm bảo cân bằng K+ / Na+ nội bào và cũng duy trì tỉ lệ K+ / Na+ cao để giúp thực vật duy trì sự sống khi bị stress muối[39]. 9 Hình 3. Điều hòa K+/Na+ ở thực vật bậc cao[39]. 1.4 Protein HKT ở thực vật 1.4.1 Vai trò, chức năng của protein HKT ở thực vật Vai trò quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn đã đƣợc khẳng định trong các thí nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ: biểu hiện của các gen: OsHKT1(hình bầu dục màu tím), OsHKT 8(hình bầu dục màu cam), AtHKT1(hình bầu dục màu hồng) ở thực vật cho phép chúng phát triển tốt hơn trong điều kiện mặn.(Hình 4) 10 Hình 4. Chức năng vận chuyển Na+ của protein HKT [42,62]. Nhƣ chúng ta đã biết ion Na+ là một ion có hại đối với tế bào, Na+ ở nồng độ cao sẽ ức chế sự tăng trƣởng của cây. Vì vậy protein HKT có 2 chức năng quan trọng là:  Chức năng vận chuyển ion qua màng tế bào: Protein HKT đƣợc mã hóa bởi họ gen HKT có vai trò quan trọng trong việc hấp thu Na+ từ ngoài môi trƣờng vào tế bào ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm . Tuy nhiên, kích thƣớc của họ gen HKT trong cây hai lá mầm là nhỏ hơn kích thƣớc họ gen HKT trong cây một lá mầm. [37,39]  Chức năng cân bằng nồng độ Na+ và K+ khi cây gặp điều kiện mặn bằng cách: Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây. Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn của cây. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Do vậy, cây chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na+/K+ trong chồi [53]. 1.4.2 Họ protein HKT ở lúa Ở lúa có chín gen thuộc họ gen HKT ( OsHKT1 -9) (Bảng1. 3) đã đƣợc xác định, chỉ có OsHKT5 đƣợc coi là một gen không có chức năng , do sự tồn tại của ba stop codons trong mRNA của nó [33,34].Tất cả các gen khác có 11 chức năng mã hóa các protein có vai trò vận chuyển riêng biệt thể hiện trong các mô / hoặc cơ quan khác nhau . [54]cho rằng OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển Na+ và OsHKT2 mã hóa cho protein đồng vận chuyển Na+ / K+. [34] cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận chuyển Na+ và OsHKT4 có ái lực thấp với vận chuyển Na+. OsHKT8 gần đây đã đƣợc biết đến là một gen mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na + , góp phần vào khả năng chịu mặn ở thực vật bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K+ [60] . Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion ở thực vật nhờ việc hạn chế ion Na+ đƣa vào tế bào trong điều kiện đất nhiễm mặn [13]. Bảng 1.3 Danh sách họ gen HKT ở lúa[34,42 ] TênProtein HKT Nucleotide Locus Protein OsHKT1 AB061311 Os06g48810 BAB61789 OsHKT2 AB06611313 OsHKT3 AJ491820 Os01g34850 CAD37187 OsHKT4 AJ491816 Os04g51820 CAD37183 OsHKT5 AJ506745 OsKHT6 AJ491818 Os02g07830 CAD37185 OsHKT7 AJ491853 Os04g51830 CAD37197 OsHKT8 AK108663 Os01g20160 BAB93392 OsHKT9 AJ491855 Os06g48800 CAD37199 BAB661791 Và vị trí, kích thƣớc các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT đƣợc biểu thị trên hình sau: 12 Hình 5. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thƣớc các đoạn exon, intron của chín gen OsHKT ở lúa[34,42,61 ] Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của intron được quy định bởi các vết cắt và thanh màu xám. Intron lớn được đưa ra khỏi cấu trúc mô hình gen và độ dài được ghi nhận. Các đường chấm chấm nối hai mảnh màu đen của OsHKT2 không cho thấy sự tương đồng với gen HKT khác. Đoạn này nằm ngoài cấu trúc mô hình, và chiều dài được ghi nhận. 1.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu, vai trò của nghiên cứu đa hình gen Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam . Kỹ thuật PCR(polymerase Chain Reaction) này thực chất tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. Điều kiện của phản ứng PCR: DNA, hai đoạn mồi(mỗi mồi dài từ 18-24 nucleotide), Taq polymerase, dung dịch đệm, ion Mg2+ Kỹ thuật RAPD phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể thực vật với nhau . 13 Dựa vào những kết quả đã đƣợc công bố, nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao, thời gian đƣợc rút gắn. Với lý do đó các kỹ thuật nghiên cứu đa hình gen đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu. 1.6. Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của gen mã hóa cho protein vận chuyển ion Na+ ở lúa. Biểu hiện của OsHKT1, OsHKT2 và OsVHA đã đƣợc nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và insitu PCR. Gần đây, một gen OsHKT từ giống lúa chịu mặn Nona Bokra đã đƣợc cô lập. Gen này có vùng 5' tƣơng ứng với gen OsHKT2, nhƣng vùng 3' tƣơng ứng với các OsHKT1. Gen mới này đƣợc gọi là OsHKT1-2 và nó là kết quả của đột biến mất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể số 6 của Nona Bokra, dẫn đến một liên kết giữa đầu 5' gen OsHKT2 và đầu 3' gen OsHKT1 [54] . Biểu hiện của OsHKT1-2 trong tế bào trứng ếch hoặc tế bào nấm men cho thấy rằng OsHKT1-2 cho phép hấp thu cả Na+ và K+ qua màng tế bào ngay cả khi nồng độ Na+ bên ngoài cao. Hoạt động của protein OsHKT12 là tƣơng tự với OsHKT2. Nhƣ OsHKT1 và OsHKT2, protein OsHKT1-2 đƣợc biểu hiện trong rễ cho phép vận chuyển ion K + qua màng tế bào. Trái ngƣợc với OsHKT1, biểu hiện của OsHKT1-2 giảm xuống trong điều kiện mặn nhƣng chức năng không bị mất đi. Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này trong OsHKT1-2 là ít nghiêm trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen OsHKT1 và OsHKT2. Điều này cho thấy OsHKT1-2 đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [54] . Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tƣợng gen OsHKT1 là nghiên cứu đột biến định hƣớng đƣợc thực hiện trên cDNA gen OsHKT1của giống lúa Nipponbare (Ni-OsHKT1) để xác định biến thể trên gen. Gen Ni-OsHKT1 đƣợc biểu hiện trong tế bào trứng ếch và đƣợc nghiên cứu chức năng khi đƣợc biểu hiện ở tế bào trứng. Ni- OsHKT1, khi biểu hiện trong tế bào trứng, giống nhƣ một Na+-K+ symport ở nồng độ Na+ và K+ rất thấp, và nhƣ là một Na+ Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20]. Ni- OsHKT1 đƣợc 14 chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện tích điện áp (I- V) .Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT1không tiếp tục vận chuyển K+ nữa. Một đặc tính đặc trƣng của OsHKT1 là có ái lực cao với K+. Các tính chất chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT1 ở lúa đƣợc so sánh với biến thể OsHKT1 biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận thấy không có sự khác biệt về tính thấm Na+ và K+ cũng nhƣ cho thấy tính chất chức năng chính của Ni- OsHKT1 đƣợc bảo toàn trong 6 biến thể: G17/V, G17/V D403/E, R21/K R32/K, R21/R32 K/ KD403/E, F61/ S và các biến thể D403/ E gen OsHKT1 trong tế bào trứng ếch [33]. 1.7. Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài 1.7.1.Mục tiêu Phát hiện sự sai khác trong trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trong trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng của protein OsHKT1 ở một số giống lúa có khả năng kháng mặn khác nhau . 1.7.2. Nội dung nghiên cứu  Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa.  Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa  Nhân bản gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống lúa  Xác định trình tự gen OsHKT1ở một số giống lúa.  So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trình tự acid amin suy diễn ở một số giống lúa nhằm phát hiện đa hình của gen OsHKT1. 15 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Mẫu vật nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 14 giống lúa khác nhau đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên thực vật và Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhƣ trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sách giống lúa nghiên cứu STT 1 2 3 4 5 6 7 Tên Giống Hom Râu Nếp ốc Nếp nõn tre Ngoi Nƣớc mặn dạng 2 Dâu Ấn độ Nếp vải STT 8 9 10 11 12 13 14 Tên Giống Chiêm cũ Ré nƣớc IR-29(Chuẩn nhiễm) Pokkali(Chuẩn kháng) Nipponbare IR-28(Chuẩn nhiễm) Nếp đèo đàng 2.1.2 Mồi phản ứng PCR Các mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng PCR đƣợc đặt tại IDT (Integrated DNA technologies), Mỹ. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu hình 6 Hình 6. Vị Trí bắt cặp mồi trên gen OsHKT1 Đoạn exon màu xanh lục, màu nâu tương ứng intron, hộp màu xanh lá cây là vị trí mã khởi đầu và hộp màu đỏ là vị trí mã kết thúc 16 M1.M2.M4.M5 tương ứng với ký hiệu từ cặp mồi 1 tới cặp mồi 4 Cặp mồi 1: Từ vị trí 24 tới 523 Cặp mồi 2: Từ vị trí 387 tới 1068 Cặp mồi 3: Từ vị trí 756 tới 1911 Cặp mồi 4: Từ vị trí 1435 tới 2103 Gen OsHKT1 có độ dài là 2286 nucleotide mã hóa cho 530 amino acids, gồm 3 exon có tổng chiều dài là 1593 nucleotide. Để nhân bản gen OsHKT1 các cặp mồi đƣợc sử dụng trong Bảng 2.2 Bảng 2.2. Các cặp mồi phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi 1 OsHKT1-1 2 OsHKT1-2 3 OsHKT1-3 4 OsHKT1-4 Trình tự Tm (0C) Fw: CATACTCGTTGGCTCGTTGC Rv: ATCACAGTGCTTGCCGAGTT Fw:TGAAGCCAAGCAACCCAGAA Rv:CAGCACCGAACAATGTGACC Fw: TGGCCTTATGGCTTCCTTGG Rv: ATTGGCTTGATGCCCAGTGT Fw: GGCATTTTCACAGCTTGCCT Rv: GGCATTTTCACAGCTTGCCT Kích thƣớc sản phẩm (bp) 54 499 55 828 54 603 55 668 Chú thích: Fw: mồi xuôi , Rv: mồi ngƣợc 2.1.3.Hóa chất 2.1.3.1 Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số Hoá chất tách chiết DNA bao gồm: Tris HCl, EDTA, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol - Đệm tách chiết DNA tổng số (đệm CTAB):  CTAB 1%  Tris-HCl 0,1M  EDTA 0,5M, pH 8,0  NaCl 5M - TE buffer pH = 8,0 17  Tris 1M, pH = 8,0  NaCl 5M  EDTA 0,5M, pH 8,0 2.1.3.2 Môi trƣờng trồng thủy canh Bảng 2.3 Thành phần các nguyên tố đa lƣợng trong môi trƣờng thủy canh[44,56] Lƣợng cần pha Nguyên Hóa chất tố trong 30ml dd thủy canh Lƣợng cần pha trong 1L dd thủy canh N NH4NO3 2,741g 1,25ml P NaH2PO4 1,217g 1,25ml K KNO3 2,486g 1,25ml Ca CaCl2.2H2O 3,5205g 1,25ml Mg MgSO4.7H2O 9,72g 1,25ml Muối NaCl 5,85g 11,7g Bảng 2.4. Thành phần các nguyên tố vi lƣợng trong môi trƣờng thủy canh[44,56] STT Nguyên tố Lƣợng hóa chất cần pha Hóa chất (g ) trong 30ml dung dịch thủy canh 1 Mn MnCl2 .4H2O 0.0450 2 Mo (NH4)6Mo7O24 .4H2O 0.00222 3 B H3BO3 0.0280 4 Zn ZnSO4 .7H2O 0.00105 5 Cu CuSO4 .5H2O 0.00093 6 Fe FeCl3 .6H2O 0.2310 7 C6H8O7 .H2O 0.3570 8 1 M H2SO4 1.5ml 18 2.1.3.3. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase, Taq buffer, dNTPs, mồi đặc hiệu. 2.1.3.4. Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc hiển thị bằng phƣơng pháp điện di, sử dụng các hóa chất : Agarose, Ethidium bromide; Tris base, EDTA, Maker 1kb và Dye 1X Các hóa chất và dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm đƣợc cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới nhƣ: Sigma, Invitrogen, Bioneer, Fermentas, Merk, Promega, Corning, Prolabo, ICN và Labscan. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kit tinh sạch Gene JET PCR Purification Kit #0701 của hãng Thermo scientific. 2.1.4. Thiết bị Các thiết bị máy móc phục vụ cho nghiên cứu nhƣ : máy PCR nhân gen PCR 9700 Applied Biosystems-Mỹ, máy PCR Kyratec-Úc, máy ly tâm Mikro 22R Hettich-Đức, máy nghiền mẫu Retsch-Đức, máy soi gel Doc XR Biorad Mỹ, bể ổn nhiệt, bể điện di…thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Phòng sinh học thụ thể và phát triển thuốc - thuộc Phòng thí nghiệm Trọng Điểm Công nghệ Enzyme- Protein, Phòng phân tích di truyền-Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh và thí nghiệm xử lý mặn 2.2.1.1 Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh Tiến hành chọn lọc hạt lúa, ủ hạt. Khi hạt lúa nảy mầm đƣợc đặt vào trong những ô trên tấm xốp có đan lƣới, đặt lọt khít vào trong khay nhựa chứa 1l môi trƣờng dinh dƣỡng. Mỗi tấm xốp gồm 13 ô, mỗi giống đƣợc gieo trên một ô, mỗi ô đƣợc gieo 3 hạt. Các giống lúa đƣợc trồng trong 6 khay đƣợc trình bày ở bảng 2.5. Sau khi lúa đƣợc trồng 14 ngày tiến hành bổ sung NaCl để đạt nồng độ 100mM ở các khay thuộc nhóm B bảng 2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc thay 4 ngày/lần và điều chỉnh pH ở độ pH =5. 19 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa NHÓM A: Đối chứng Khay 1 Nếp nõn tre Nƣớc mặn dạng 2 Nipponbare IR28 Nếp vải Ré nƣớc Chiêm cũ Hom râu Ngoi Dâu Ấn Độ Pokkali IR 29 Dâu Ấn Độ IR28 Hom râu Nƣớc mặn dạng 2 Chiêm cũ Ré nƣớc Nếp ốc Khay 2 Ngoi Khay 3 IR29 Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre Chiêm cũ IR29 Ngoi Ré nƣớc Nƣớc mặn dạng 2 Hom râu IR28 Dâu Ấn Độ NHÓM B: Xử lý mặn Khay 1 Nƣớc mặn dạng Nếp nõn tre Nipponbare IR28 Ré nƣớc Chiêm cũ Hom râu Ngoi Dâu Ấn Độ Pokkali IR 29 Dâu Ấn Độ IR28 Hom râu Nƣớc mặn dạng 2 Chiêm cũ Ré nƣớc IR29 2 Nếp vải Nếp ốc Khay 2 Ngoi Khay 3 Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre Chiêm cũ IR29 Ngoi Ré nƣớc Nƣớc mặn dạng 2 Hom râu IR28 Dâu Ấn Độ 2.2.1.2. Thí nghiệm xử lý mặn Khi cây lúa trồng đƣợc 14 ngày trong môi trƣờng thủy canh tiến hành bổ sung 11,7g muối/1l môi trƣờng thủy canh vào nhóm B nhƣ ở bảng 2.5, sau khi bổ sung NaCl đƣợc 3, 7, 14 ngày tiến hành đánh giá mức độ chịu mặn của cây lúa dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý của cây theo tiêu chuẩn đánh 20 giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.( bảng 2.6). Đồng thời đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý nhƣ: chiều dài thân(cm), chiều dài rễ(cm), khối lƣợng thân(g), khối lƣợng rễ(g). Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển Điểm 1 Quan sát Lá gần nhƣ bình thƣờng, khô nhẹ ở đầu lá 1/4 lá bị khô hoặc bị mất màu 3 5 1/4 - ít hơn 1/2 lá bị khô hoặc bị mất màu 7 1/2 - ít hơn 3/4 lá bị khô hoặc mất màu 9 Hầu nhƣ tất cả các cây đã chết 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số Để thu DNA tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB: là phƣơng pháp sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết DNA từ thực vật dựa trên nguyên lý chung sau: - Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: nghiền trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần trong tế bào. Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA. Sử dụng các loại hóa chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của các enzyme nuclease nội bào . - Bƣớc 2: Loại tạp. Các hóa chất nhƣ: chloroform, isoamyl alcohol, phenol… đƣợc sử dụng để biến tính protein. Protein bị biến tính sau khi ly tâm tủa thành 1 lớp nằm giữa pha nƣớc và pha hóa chất. Pha nƣớc chứa acid nucleic đƣợc thu nhận lại. 21 - Bƣớc 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dƣới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và có thể hòa tan chúng lại theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol nhƣng isopropanol phổ biến hơn. Acid nucleic sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu . Các bƣớc tiến hành: 1. Cho 50mg mẫu lá lúa đã nghiền vào ống eppendorf 2ml có chứa 500µl dung dịch đệm CTAB buffer 2X, vortex 2. Ủ ở 650C khoảng 15 phút 3. Lấy ra để nhiệt độ hạ xuống, bổ sung 500µl chloroform/ isoamylalcohol (24:1), vortex 15 giây 4. Ly tâm (10000rpm/10 min), 40C 5. Thu dịch pha trên (300µl) chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới có chứa 300µl isopropanol để tủa DNA để 10 phút trong đá lạnh. 6. Ly tâm (14000rpm/5min) , 40C 7. Rửa tủa bằng 500µl EtOH 700 , ly tâm 14000rpm/5min, để khô 8. Bổ sung 50µl TE buffer và bảo quản ở -200C Sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA tổng số đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút. DNA tổng số đƣợc so sánh với maker 1kb và có thể quan sát đƣợc dƣới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide 2.2.3.Phƣơng pháp PCR PCR đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống lúa. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo chu trình nhiệt và thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 2.7 và 2.8 22 Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose, dung dich đệm TAE, ở 90V trong 30 phút. Kích thƣớc tƣơng đối của sản phẩm đƣợc so sánh với maker 100bp và quan sát dƣới tia UV khi nhuộm ethidium bromide. Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản Nồng độ cuối cùng Thể tích (50µl) ADN tổng số 570ng/nl 1,5 dNTPs 2mM 5 Buffer (+Mg2+ ) 10X 5 Mồi Fw 10µM 1,5 Mồi Rv 10µM 1,5 Taq 5U 0.3 ứng H2O 35.2 Bảng 2.8.Chu trình nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ (0C) Thời gian 95 5’ 94 30s 55 30s 72 1’ 72 7’ 4 ∞ 23 Số chu kỳ 35Cycles I. 2.2.4.Tinh sạch Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch của hãng Thermo. Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.5.Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gene lúa cũng nhƣ đƣợc so sánh giữa các giống lúa với nhau ở các cặp mồi tƣơng ứng sử dụng công cụ tin sinh học: http://www.cellbiol.com/scripts/complement/dna_sequence_reverse_compleme nt.php http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa Khi cây lúa trồng đƣợc 14 ngày trong môi trƣờng dung dịch Yoshida tiến hành bổ sung 11,7g muối/1l dung dịch thủy canh vào nhóm B nhƣ ở hình 7, sau khi bổ sung NaCl đƣợc 3, 7, 14 ngày tiến hành đánh giá mức độ chịu mặn của cây lúa dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý của cây theo tiêu chuẩn đánh giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.(Hình 8,9,10). Hình 7. Lúa trồng trƣớc khi xử lý mặn Hình 8. Lúa sau 3 ngày xử lý mặn Hình 9. Lúa sau 7 ngày xử lý mặn Hình 10. Lúa sau 14 ngày xử lý mặn 25 Kết quả ban đầu cho thấy, lúa đƣợc trồng trong môi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM sau 3 ngày xử lý mặn có các giống chƣa bị ảnh hƣởng nhiều. Giống tốt nhất là giống Pokkali , giống kém nhất là IR29 (Hình 11.). Hình 11.Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 3 ngày Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải Sau 7 ngày xử lý mặn có 30,76% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 1-3 gồm các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu. Giống bị ảnh hƣởng cấp độ 46 có 30,76% bao gồm : Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi, Chiêm cũ. Có 15,4% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 8-9 gồm các giống: chuẩn nhiễm IR28, IR29(Hình 12). Hình 12.Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 7 ngày 26 Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải Sau 14 ngày xử lý mặn kết quả thu đƣợc : 46,15% các giống: Chiêm cũ, Nếp vải, Dâu Ấn độ, Nipponbare, IR28, IR29 ảnh hƣởng cấp độ 9. Các giống ảnh hƣởng cấp độ 4-6 gồm: Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu, Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi. Giống bị chịu ảnh hƣởng ít nhất là Pokkali chiếm 0,76%(Hình 13). Hình13 .Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 14 ngày Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải Kết quả cho thấy sau 14 ngày sự khác biệt tính kháng mặn của các giống là tốt nhất. Do đó sự phân biệt tính kháng giữa các giống đƣợc chọn sau 14 ngày. Sau khi đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái sinh lý của cây lúa, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa: Chiều dài thân, chiều dài rễ, khối lƣợng thân, khối lƣợng rễ. 27 3.2Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa 3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn Kết quả sau khi xử lý mặn 3 ngày cho thấy lúa đƣợc trồng trong môi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM, kết quả ghi nhận cho thấy có 71,42% giống lúa có chiều cao trong khoảng từ 6-8cm bao gồm 10 giống lúa sau: IR29, Nếp vải, Nipponbare, IR28,Mặn D2, Dấu Ấn độ, Chiêm cũ, Ré nƣớc, Ngoi. Có 4 giống (28,58%) có chiều cao từ 8,5- 9,5cm là các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (Hình 14.). Hình 14. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải Kết quả sau 7 ngày xử lý mặn cho thấy các giống có chiều cao thân so với 3 ngày xử lý mặn không có nhiều vƣợt trội, cụ thể nhƣ sau: Các giống đối chứng có 57,14% các giống có chiều cao từ 7-8cm, có 21,4% giống có chiều cao trên 8cm gồm các giống: Ngoi, Nếp ốc. Giống có chiều cao vƣợt trội nhất là giống chuẩn kháng Pokkali (9,7cm) đạt 7,14%. Các giống có chiều cao ngang với giống chuẩn kháng đạt 14,28% gồm hai giống: Hom râu, Nếp nõn tre. Các giống lúa khi đã xử lý mặn những giống chống chịu kém có chiều cao không thay đổi so với 3 ngày khi xử lý mặn. Có 78,57% các giống có chiều cao từ 6-8cm, còn lại 21,4% các giống có chiều cao từ 8,5-9,5cm(Hình 15.). 28 Qua kết quả đánh giá sau 7 ngày xử lý mặn giữa các giống đối chứng và bên lúa đƣợc cho thêm muối, ta thấy có 28,6% chiều dài thân của các giống có sự chênh lệch cao 2-2,5cm gồm các giống: IR29, Nếp vải, IR28, Nipponbare. Có 42,85% giống có chiều dài thân lớn hơn từ 1-1,5cm gồm các giống: Ré nƣớc, Ngoi, Mặn D2. Có 3 giống (21,4%) các giống có sự chênh lệch chiều dài thân 0,5cm đó là: Pokkaki, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (hình 15.). Hình 15. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải Sa 14 ngày xử lý mặn, chiều dài thân của các giống đã có sự chênh lệch rõ rệt giữa các giống đối chứng và các khay giống xử lý mặn. Chiều dài thân bên nhóm đối chứng cao hơn nhóm xử lý mặn khoảng 3-4cm giữa các giống chiếm 58,15% gồm các giống: IR29, IR28, Nếp vải, Nipponbare, Dấu Ấn độ, Mặn D2, Chiêm cũ. Các giống có sự khác nhau về chiều dài thân từ 0,5-1cm chiếm 42,85% là: Ngoi, Nếp ốc, Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu (Hình 16.). 29 Hình 16. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải 3.2.2 Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn Sau 3 ngày xử lý mặn, các giống lúa có chiều dài rễ từ 7-8,5cm chiếm 71,42%. Còn lại 28,58% là 3 giống có chiều dài rễ lớn hơn 8,5cm bao gồm các giống: Hom râu, Pokkali, Nếp nõn tre (Hình 17.). Sự chênh lệch chiều dài rễ sau 3 ngày xử lý mặn chƣa có sự thay đổi lớn. Hình 17. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải Nhƣng sau 7 ngày bổ sung muối vào môi trƣờng dung dịch dinh dƣỡng chiều dài rễ bên xử lý mặn có sự thay đổi rõ rệt so với bên đối chứng. Ta thấy 30 rằng chiều dài rễ bên đối chứng phát triển bình thƣờng các giống có chiều dài tƣơng đồng nhau với chiều cao trong khoảng từ 9,5cm-10,5cm. Khi so sánh chiều dài rễ giữa các giống với nhau, thấy rằng gần 43% các giống có khoảng cách chiều dài rễ giữa bên đối chứng và bên xử lý mặn là: 2,5- 4cm bao gồm 6 giống lúa sau: IR28, Nếp vải, Nipponbare, IR29, Ngoi, Ré nƣớc. Có 4 giống đạt 28,5% có khoảng cách chiều dài rễ từ 1,5-2cm bao gồm: Mặn D2, Chiêm cũ, Dấu Ấn độ. Còn lại 28% các giống có khoảng cách chiều dài rễ thấp từ 1-1,5cm (Hình 18.). Hình 18. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 7 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải Sau 14 ngày xử lý mặn, khoảng cách chiều dài rễ của giống đối chứng và giống xử lý mặn từ 4-5cm chiếm 43% gồm các giống: Ré nƣớc, Ngoi, IR29, Nipponbare, Nếp vải, IR28. Có 28,5% các giống có khoảng cách chiều dài rễ từ 2-3cm gồm có 4 giống: Mặn D2, Chiêm cũ, Dấu Ấn độ, Nếp ốc. Các giống còn lại: Nếp ốc, Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu có khoảng cách chiều dài rễ khoảng 1,5-2cm (Hình 19.). 31 Hình 19. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 14 ngày xử lý mặn Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải 3.2.3 Kết quả đánh giá khối lƣợng thân sau khi xử lý mặn Kết quả phân tích ghi nhận trọng lƣợng thân của 14 giống lúa nghiên cứu trong môi trƣờng dung dịch có muối nồng độ đạt 100mM nhƣ sau: Các giống có sự chênh lệch khối lƣợng thân từ 0,012-0,016g chiếm 50% gồm 7 giống: Chiêm cũ, Ré nƣớc, IR29, Dấu Ấn độ, Nipponbare, Nếp vải, IR28. Có 3 giống chiếm 21,42% có khối lƣợng thân chênh lệch từ 0,004-0,006g so với giống đối chứng: A69-1, Ngoi, Mặn D2. Còn lại 28,58% các giống có sự chênh lệch nhau về khối lƣợng thân trong khoảng từ 0,002-0,04g là: Nếp nõn tre, Hom râu, Pokkali, Nếp ốc(Hình 20.). Hình 20. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng thân Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị khối lượng thân (g) 32 Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải 3.2.4 Kết quả đánh giá khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn Đối với kết quả khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn ta nhận thấy 14 giống bên nhóm đối chứng trọng lƣợng rễ tƣơng đối đồng đều từ 0,03g-0,039g. Các giống lúa khi xử lý mặn có trọng lƣợng rễ cao chiếm 42,8% gồm các giống: Dấu Ấn độ, Nếp nõn tre, Pokkali, Hom râu, Nếp ốc. Trong đó, giống có trọng lƣợng rễ cao nhất là giống Nếp nõn tre. Các giống có trọng lƣợng rễ ở mức trung bình chiếm 14,28% gồm có 2 giống: Mặn D2, Chiêm cũ. Còn lại 42,85% các giống có khối lƣợng rễ thấp, trong đó giống chuẩn kháng IR28 là giống có khối lƣợng rễ thấp nhất(Hình 21.). Hình 21. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng rễ Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị khối lượng thân (g) Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải Sau khi tiến hành đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái sinh lý và đặc điểm sinh lý của cây lúa chúng tôi tiếp tục các bƣớc tiếp nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa Lá lúa được thu và nghiền sử dụng máy nghiền mẫu. DNA tổng số đ ược tách chiết từ các mẫu lá đã nghiền sử dụng phương pháp tách chiết 33 CTAB và được điện di kiểm tra. Kết quả điện di cho thấy các băng DNA sáng, chứng tỏ chất lƣợng DNA của các mẫu là khá tốt, . Kết quả điện di và đo OD 260/280 cũng cho thấy DNA có nồng độ tƣơng đối cao, chất lƣợng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.(Hình 22.) Hình 22. DNA tổng số tách từ lá lúa 1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb, Gel Agarose 1%. 3.4. Nhân bản gen OsHKT1 Gen OsHKT1đƣợc nhân bản bằng phƣơng pháp PCR sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu. Kết quả sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose. Kết quả sản phẩm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 1 đƣợc trình bày ở hình 23. 34 M 2 Hình 23. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 1 1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1% Kết quả điện di cho thấy các băng thu đƣợc sáng , khá gọn, đồng đều nhau, đúng kích thƣớc là 499bp và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, đoạn đầu của exon 1 gen OsHKT1 đã được nhân bản thành công. Đoạn tiếp theo của exon 1 được nhân bản sử dụng cặp mồi 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 24. Hình 24. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 2 1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1% 35 Kết quả điện di cho thấy các băng thu đƣợc sáng , khá gọn, đồng đều nhau, đúng kích thƣớc là 828bp và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, đoạn thứ hai của exon 1 gen OsHKT1 đã đƣợc nhân bản thành công. Đoạn còn lại của exon 1 và exon 2 được nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 25 60 3 bp Hình 25. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb;Gel Agarose 1%. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose thu đƣợc các băng đúng kích thƣớc là 603bp, cũng không xuất hiện băng phụ, các mẫu có băng sáng rõ. Nhƣ vậy đã nhân bản thành công cả 2 đoạn exon 1 và exon 2 gen OsHKT 1. Đoạn exon thứ 3 đƣợc nhân bản bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 26 668 bp 36 Hình 26. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4 1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu, 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1%. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose thu đƣợc các băng đúng kích thƣớc là 668bp, cũng không xuất hiện băng phụ, các mẫu có băng sáng rõ. Như vậy, gen OsHKT1 đã được nhân bản thành công. 3.5.Giải trình tự gen OsHKT1 ở 8 giống lúa. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch sử dụng Kit thôi gel Gene JET PCR Purification Kit #0701 của hãng Thermo scientific và đƣợc gửi đi giải trình tự. Một phần kết quả giải trình tự đối với giống Nếp nõn tre đƣợc trình bày ở hình sau: Hình 27. Hình ảnh cho thấy một phần kết quả giải trình tự đối với mẫu Nếp nõn tre sử dụng cặp mồi 3 3.6. Phân tích trình tự gen ở 8 giống lúa. Sau khi thu đƣợc kết quả giải trình tự ở 8 giống lúa, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các exon và các intron sử dụng phần mềm trên trang: http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Các trình tự nucleotide của exon 3 ở 8 giống có sự sai khác nhiều so với trình tự nucleotide của exon 1 và exon 2 Exon 1 có kích thƣớc là 1167 bp, có 12 vị trí có sự sai khác trong trình tự nucleotide. Ở vị trí 50, kết quả giải trình tự của giống Hom râu cho thấy giống Hom râu đã có sự thay thế nucleotide G bằng nucleotide T so với các giống lúa còn lại và so với dữ liệu ngân hàng gen lúa. Tƣơng tự, đối với vị trí 360 và 645 có sự thay thế nucleotide A bằng nucleotide G của giống 37 Nếp nõn tre, Chiêm cũ, Nếp ốc, Dâu Ấn Độ. Tuy nhiên, tới vị trí 708 giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự sai khác thay thế G bằng nucletid A. Đến vị trí 744 của giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự thay thế nucleotide A=G. Ở vị trí 1209 của giống Hom râu có sự thay thế nucleotide T=A. Exon 2 có kích thƣớc là 219bp chỉ có 3 vị trí sai khác là vị trí 1390 có sự thay thế nucleotide T thành G của giống Nếp vải. Ở vị trí 1440 có hai vị trí sai khác, sự thay thế nucleotide G thành A của giốn Nếp vải, Nếp nõn tre, còn lại các giống lúa khác cũng nhƣ dữ liệu gen lúa không thay đổi. Điều này cho thấy trình tự vùng mã hóa exon 2 ở các giống có độ tƣơng đồng khá cao. Exon thứ 3 có các vị trí sai khác: vị trí 1524 có sự thay thế của nucleotid C = G , vị trí 1527 và vị trí 1550 thì sự thay thế nucleotide T thay bằng A của giống Dâu Ấn độ các giống lúa khác cũng nhƣ dữ liệu gen lúa không thay đổi(Hình 28.). 38 Hình 28. So sánh trình tự vùng mã hóa của gen giữa các giống lúa 39 Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hóa của gen giữa các giống lúa Trình tự nucleotide của intron ở 8 giống đƣợc so sánh với trình tự dữ liệu gen lúa thấy có độ tƣơng đồng cao, sự sai khác giữa các nucleotide ít hơn sự sai khác giữa các nucleotide của exon: Có 9 vị trí sai khác đó là các vị trí 160, 220, 250, 276, 290, 330, 360, 370 có sự thay thế nucleotide C bằng T, hoặc A=C. Có 1 vị trí trong vùng trình tự là vị trí 338: trình tự là chƣa nhận đƣợc hoàn toàn giữa các giống (Hình 29.). 40 3.7. Phân tích trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa bởi gen OsHKT1 từ 8 giống lúa Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc giữa các giống lúa Từ sự sai khác nhiều ở exon thứ 3 của 8 giống lúa so với dữ liệu gen lúa thu đƣợc sự sai khác nhiều giữa các acid amin suy diễn trên đoạn exon 3. Đối với đoạn exon 1: do có sự thay thế nucleotide G thành nucleotide V ở vị trí 17 nên có sự thay thế acid amin trên trình tự prot ein từ Glysine(G) thành Valine( V) ở Hom râu. Ở vị trí thứ 463 acid amin đƣợc thay thế là: S thành Arginine (R) ở Nếp vải. Ở vị trí thứ 509 thì acid amin đƣợc thay thế là F thành L, Vị trí 516 thì thay thế L thành F. Các sự thay thế xảy ra không ảnh hƣởng tới trình tự acid amin của protein trong đoạn exon 1 và 2 này. 41 Bảng 3.1. Vị trí sai khác acid amin Vị trí nucleotid 50 Vị trí acid amin G17V 360 645 708 744 1209 1389 1440 1524 S463R 1527 1547 F509L L516H Tên giống - - - A G - - - - - - Ngoi - - - A G - G A - - - Nếp vải - G - - - - - - G A A Dấu Ấn độ - - - A G - - - - - - Ré nƣớc - G - - - - - A - - - Nếp nõn tre T - - - - A - - - - - Hom râu - G G - - - - - - - - Chiêm cũ - G - - - - - - - - - Nếp ốc Vị trí acid amin nằm ở trong màng bao gồm: từ acid amin thứ 44-64, 70-93, 103-128, 187-214, 263-283, 306-324, 358-374, 405-421, 434-449, 490-495. Ngoài những vị trí nêu trên còn lại các acid amin đều nằm bên ngoài màng. Ba vị trí đa hình 20, 24, 35. 42 Tiếp theo dùng công cụ tin sinh để phỏng đoán cấu trúc protein và vị trí acid amin sai khác trên cấu trúc của protein, kết quả cho thấy trong số các acid amin bị thay đổi có một acid amin nằm ở vùng xuyên màng 1(S1), 1 nằm ở ngoài giữa (S9) và (S10), 1 nằm ngoài vùng (S10)(Bảng 3.1), (Hình 31.). N-Terminal C-Terminal Outside 44 93 70 S1 S2 103 128 S3 214 187 S4 263 285 S5 324 358 306 374 S6 S7 421 405 S8 434 449 S9 495 490 S10 inside Các vị trí đa hình là 17, 463, 509, 516. Các vị trí đa hình từ 518 đến 530. ( giữa 2 sao đỏ đều là đa hình) Hình 31.Cấu trúc protein xuyên màng 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.Đánh giá đƣợc tính chịu mặn ở 13 giống lúa. Giống chịu mặn tốt gồm: Pokkali, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu, Ré nƣớc, giống chịu mặn trung bình gồm: Mặn, Ngoi, Chiêm cũ, các giống chịu mặn kém: Nếp vải, Dâu Ấn độ, Nipponbare, IR28, IR29. 2.Đã tách chiết thành công DNA tổng số 9 giống lúa và nhân bản gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở 8 giống lúa thành công. 3.Đã xác định đƣợc trình tự gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở 8 giống lúa và phát hiện đƣợc sự sai khác giữa trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn giữa 8 giống lúa nghiên cứu: Hom râu, Chiêm cũ, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Dâu Ấn độ, Ré nƣớc, Nếp vải, Ngoi với nhau. Đối với giống Hom râu trong trình tự có sự thay thế của acid amin Glysine (G) thành Valine (V), ở Nếp vải có sự thay thế của S thành R. Ở Dấu Ấn độ có sự thay thế của F thành L và L thành H ở hai vị trí acid amin khác nhau. Kiến nghị Từ các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu, chúng tôi có kiến nghị nhƣ sau: -Phân tích mối liên hệ giữa sự sai khác nucleotide, acid amin với mức độ chịu mặn. -Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen ở điều kiện mặn. -Đánh giá sự tƣơng quan của đa hình gen OsHKT1 với khả năng chịu mặn ở các giống lúa nghiên cứu 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1.Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003. “Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 2.Đỗ Hữu Ất, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Quang Xu, 2004 “Ứng dụng kỹ thuật kỹ thuật hạt nhân để tạo giống lúa chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 2/ 2004: Tr. 1204-1205 3.Lê Văn Căn, 1978. Giáo trình Nông hóa. Nhà xuất bản Vụ đào tạo, Bộ đại học và trung học chuyên nghiệp. 4. Nguyễn Thị Quỳnh (1998), “ Đánh giá sự đa dạng di truyền tài nguyên lúa của vùng Tây Bắc Việt Nam”, Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. 5.Nguyễn Văn Bo, 2010. “Ảnh hưởng của Calcium lên sinh trưởng và dinh dưỡng của cây lúa trên đất nhiễm mặn”. Luận án thạc sĩ trồng trọt. Trƣờng Đại học Cần Thơ 6.Trần Danh Sửu (2008), “ Đánh giá đa dạng di truyền tài nguyên lúa Tám đặc sản miền Bắc Việt Nam”. Luận án Tiến sỹ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 7.Trần Danh Sửu, Lƣu Ngọc Trình (2001), “Sử dụng chỉ thị ADN để nghiên cứu quan hệ di truyền tiến hoá của lúa địa phƣơng các vùng Tây Bắc và Tây Nam nƣớc ta”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng,số1/2001. Tr. 25-29, Viện Di truyền nông nghiệp. 8.Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa và cộng sự (2010). “Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phƣơng ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ bằng chỉ thị SSR”. Kết quả nghiên cứu Khoa học và Công nghệ 2006 – 2010. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 45 Tài liệu Tiếng Anh 9.Apse, M.P., Aharon, G.S., Snedden, W.A. & Blumwald, E. 1999. “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiport in Arabidopsis”. Venice 285, 1256-1258. 10.Amtmann, A. & Sanders, D. 1999. “ Mechanisms of Na+ uptake by plant cells”. Advance botanical research 29, 75-112. 11.Babourina, O., Shabala, S. & Newman, I. 2000. “Verapamil-induced kinetics of ion flux in oat seedlings”. Australian journal of plant physiology 27, 1031–1040. 12.Berthomieu, P., Conejero, G., Nublat, A., Brackenbury, W.J., Lambert, C., Savio, C., Uozumi, N., Oiki, S., Yamada, K., Cellier, F., Gosti, F., Simonneau, T., Essah, P.A., Tester, M., Very, A.A., Sentenac, H., & Casse, F. 2003. “Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance”. EMBO journal 22, 2004-2014. 13.Berthomieu, P. et al. (2003) “Functional analysis of OsHKT1 in Arabidopsisshows that Na+ recirculation by the phloem is crucialfor salt tolerance”. EMBO J.22, 2004–2014 14.Bhandal, I.S. & Malik, C.P. 1988. “Potassium estimation, uptake, and its role in the physiology and metabolism of flowering plants”. International review of cytology 110, 205-254. 15.Bittisnich, D., Robinson, D. & Whitecross, M. 1989. “Membraneassociated and intracellular free calcium levels in root cells under NaCl stress. In Plant membrane transport: The current position”. Proceedings of the eighth international workshop on plant membrane transport, Venice, Italy, 25-30 16.June 1989 (eds J Dainty, MI de Michelis, E Marre and F Rasi-Caldogno). “Elesevier Science Publishing Company”, Inc., New York. 681-682 pp.Blatt, M.R. & Grabov, A. 1997. “ Signal redundancy gates and 46 integration in the control of ion channels for stomatal movement”. Journal of experimental botany 48, 529-537. 17.Blumwald, E. 2000. “ Sodium transport and salt tolerance in plants”.Current opinion in cell biology 12, 431-434. 18.Bush, D.R. 1993. “ Proton-coupled sugar and amino-acid transporters in plants”. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 44, 513–542. 19. Calliste Jérémie Diédhiou. 2006. “ Adaptive response mechanism salt stress in plants”. Plant physiology 131, 676-683. 20.Chauhan, S., Forsthoefel, N., Ran, Y., Quigley, F.,Nelson, D.E. & Bohnert, H.J. 2000. “ Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in Mesembryanthemum crystallium”. The plant journal 24, 511-522. 21.Colmer, T.D., Flowers, T.J. & Munns, R. 2006. “Use of wild relatives to improve salt tolerance in wheat”.Journal of experimental botany 57, 10591078. 22.Cramer, G.R. & Jones, R.L. 1996. “ Osmotic stress and abscisic acid reduce cytosolic calcium activities in roots of Arabidopsis thaliana”. Plant, cell and environment 19, 1291-1298. 23.Davenport, R.J. & Tester, M. 2000. “ A weakly voltage-dependent, nonselective cation channel mediates toxic sodium influx in wheat”. Plant physiology 122, 823-834. 24.Demidchik, V., Davenport, R.J. & Tester, M. 2002. “ Nonselective cation channels in plants”. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 53, 67-107. 25.Demidchik, V. & Tester, M. 2002. “ Sodium fluxes through nonselective cation channels in the plasma membrane of protoplasts from Arabidopsis roots”. Plant physiology 128, 379-387. 26.Epimashko, S., Meckel, T., Fischer-Schliebs, E., Lüttge, U. & Thiel, G. 2004. “Two functionally different vacuoles for static and dynamic purposes in one plant mesophyll leaf cell”. The plant journal 37, 294-300. 47 27.Felle, H.H. 2001. “ pH: signal and messenger in plant cells”. Plants biology 3, 577-591. 28.Flowers, T.J. & Läuchli, A. 1983. “ Sodium versus potassium: substitution and compartmentation”. In: Läuchli, A., Bieleski, R.L. eds. Inorganic plant nutrition, Vol. 15B. Berlin: Springer-Verlag. 651– 681 pp. 29.Flowers, T.J. & Yeo, A.R. 1995. “ Breeding for salinity resistance in crop plants: where next?” Australian journal of plant physiology 22, 875884. 30.Fukuda, A., Nakamura, A., Tagiri, A., Tanaka, H., Miyao, A., Hirochika, H. & Tanaka, Y. 2004. “ Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice”. Plant and cell physiology 45, 146-159. 31.Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S. & Tanaka, Y. 1998. “Na+/H+antiporter in tonoplast vesicles from rice roots”. Plant and cell physiology 39, 196-201. 32.Gao, D., Knight, M.R., Trewavas, A.J., Sattelmacher, B. & Plieth, C. 2004. “Selfreporting Arabidopsis expressing pH and [Ca2+] indicators unveil ion dynamics in the cytoplasm and in the apoplast under abiotic stress”. Plant physiology 134, 898-908. 33.Gárbarino, J. & Dupon, F.M. 1988. “NaCl Induces a Na+/H+Antiport in Tonoplast Vesicles from Barley Roots”. Plant physiology 86, 231-236. 34.Garciadeblás, B., Senn, M.E., Banuelos, M.A. & Rodriguez-Navarro, A. 2003. “ Sodium transport and HKT transporters: the rice model”. The plant journal 34, 788–801. 35.Gelli, A. & Blumwald, E. 1993. “ Calcium retrieval from vacuolar pools (characterisation of a vacuolar physiology 102, 1139–1146. 48 calcium channel)”. Plant 36.Gelli, A., Higgins, V.J. & Blumwald, E. 1997. “ Activation of plant plasma membrane Ca2+ permeable channels by race-specific fungal elicitors”. Plant physiology 113, 269–279. 37.Gillaspy, G.E., Keddie, J.S., Oda, K. & Gruissem, W. 1995. “ Plant inositol monophospatase is a lithium-sensitive enzyme encoded by a multigene family”. The plant cell 7, 2175–2185. 38.Gilroy, S. & Trewavas, A. 1994. “A decade of plant signals”. BioEssays 16, 677-682. 39.Glenn, E.P., Brown, J.J. & Khan, M.J. 1997. “ Mechanisms of salt tolerance in higher plants”. In: Mechanisms of Environmental Stress Resistance in Plants. 40.Edn. Basra, A.S. & Basra, R.K. Harwood academic publishers, the Netherlands. 83-110 pp. Golldack, D. & Dietz, K.J. 2001. “Saltinduced expression of the vacuolar H+-ATPase in the common ice plant is developmentally controlled and tissue specific”. Plant physiology 125, 1643–1654. 41.Golldack, D., Quigley, F., Michalowski, C.B., Kamasani, U.R. & Bohnert, H.J. 2003. “ Salinity stress-tolerant and -sensitive rice (Oryza sativa L.) regulate AKT1-type potassium channel transcripts differently”. Plant molecular biology 51, 71-81. 42.Golldack, D., Su, H., Quigley, F., Kamasani, U.R., Munoz-Garay, C., Balderas, E., Popova, O.V., Bennett, J., Bohnert, H.J. & Pantoja, O. 2002. “Characterization of a HKT-type transporter in rice as a general alkali cation transporter”. The plant journal 31, 529-542. 43.Greenway, H. & Munns, R. 1980. “Mechanisms of salt tolerance in non halophytes”.Annual review of plant physiology 31, 149–190. 44.Greenway, H. & Osmond, C.B. 1972. “ Salt responses of enzymes from species differing in salt tolerance”. Plant physiology 49, 256–259. 49 45.Gruwel, M.L.H., Rauw, V.L., Loewen, M. & Abrams, S.R. 2001. “Effects of sodium chloride on plant cells; a 31P and 23Na NMR system to study salt tolerance”. Plant science 160, 785-794. 46.Halfter, U., Ishitani, M. & Zhu, J.K. 2000. “The ArabidopsisSOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calciumbinding protein 36SOS3”. Proceedings of the national academy of sciences, USA 97, 3730–3734. 47.Halperin, S.J., Gilroy, S. & Lynch, J.P. 2003. “Sodium chloride reduces growth and cytosolic calcium, but does not affect cytosolic pH, in root hairs of Arabidopsis thaliana L”. Journal of experimental botany 54, 1269-1280. 48.Hamada, A., Shono, M., Xia, T., Ohta, M., Hayashi, Y., Tanaka, A. & Hayakawa, T. 2001. “Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini”. Plant molecular biology 46, 35-42. 49.Hamilton, C.A., Taylor, G.J. & Good, A.G. 2002. “Vacuolar H+ATPase, but not mitochondrial F1F0-ATPase, is required for NaCl tolerance in Saccharomyces cerevisiae”. FEMS microbiology letters 208, 227-232. 50.Hamilton, D.W.A., Hills, A., Kohler, B. & Blatt, M.R. 2000. “Ca2+channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid”. Proceedings of the national academy of sciences, USA 97, 4967–4972. 51.Hasegawa, P.M., Bressan, R.A., Zhu, J.K. & Bohnert,H.J. 2000. “Plant cellular and molecular responses to high salinity”.Annual review of plant physiology and plant molecular biology 51, 463-499. 52.Henriksson, E. & Henriksson, K.N. 2005. “ Salt-stress signalling and the role of calcium in the regulation of the ArabidopsisATHB7 gene”. Plant, cell and environment 28, 202-210. 50 53.Hillel, D. 2000. “Salinity Management for Sustainable Irrigation”.The World Bank. Washington, D. C. 54.Horie, T., Yoshida, K., Nakayama, H., Yamada, K., Oiki, S. & Shinmyo, A. 2001. “ Two types of HKT transporters with different properties of Na+ and K+ transport in Oryza sativa”. The plant journal 27, 129-138. 54.Knight, H., Trewavas, A.J. & Knight, M.R. 1997. “Calcium signalling in Arabidopsis thalianaresponding to drought and salinity”. The plant journal 12, 1067–1078. 55..Mäser, P., Gierth, M. & Schroeder, J.I. 2002. “Molecular mechanisms of potassium and sodium uptake in plants”. Plant and soil 247, 43–54. 56.Plant physiology 134, 1514-1526. Pardo, J.M., Cubero, B., Leidi, E.O. & Quintero, F.J. 2006. “Alkali cation exchangers: roles in cellular homeostasis and stress tolerance”. Journal of experimental botany 57, 1181-1199. 57.Peterson, C.A. & Enstone, D.E. 1996. “Functions of passage cells in the endodermis and exodermis of roots”. Physiologia plantarum 97, 592-598. 58.Pilot, G., Gaymard, F., Mouline, K., Cherel, I. & Sentenac, H. 2003. “Regulated expression of Arabidopsis shaker K+ channel genes involved in K+ uptake and distribution in the plant”. Plant molecular biology 51, 773–787. 59.Ren, Z.H., Gao, J.P., Li, L.G., Cai, X.L., Huang, W., Chao, D.Y., Zhu, M.Z., Wang, Z.Y., Luan, S. & Lin, H.X. 2005. “A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter”. Nature genetics 37, 1141-1146. 60.Vaughan,D.A 1994. “Wild Relatives of Rice : Genetic Resources Handbook”. International Rice Research Insitute, Manila, The Philippines,137p. 61.Yeo, A.R., Flowers, S.A., Rao, G., Welfare, K., Senanayake, N. & Flowers, T.J. 1999. “ Silicon reduces sodium uptake in rice (Oryza sativa L.) in 51 saline conditions and this is accounted for by a reduction in the transpirational bypass flow”. Plant, cell and environment 22, 559-565. 62. http://www.nature.com/ng/journal/v37/n10/fig_tab/ng1005-1029_F1.html 52 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kết quả giải trình tự của gen OsHKT1 ở 9 giống lúa Hình 32 Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp nõn tre Hình 33. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp nõn tre Hình 34. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Chiêm cũ 53 Hình 35. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Chiêm cũ Hình 36. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp vải Hình 37. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp vải 54 Hình 38. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Ré nƣớc Hình 39. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Ré nƣớc Hình 40. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Hom râu 55 Hình 41. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Hom râu Hình 42. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp ốc Hình 43. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Nếp ốc 56 Hình 44. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Ngoi Hình 45. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Ngoi Hình 46. Đoạn đầu gen OsHKT1 ở giống lúa Dâu Ấn Độ 57 Hình 47. Đoạn sau gen OsHKT1 ở giống lúa Dâu Ấn Độ 58 [...]...bào ở cây lúa Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của gen OsHKT1 giúp làm sáng tỏ cơ chế chịu mặn của cây lúa Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu Nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở cây lúa nhằm nghiên cứu tính đa hình của gen OsHKT1 ở lúa 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét sơ lƣợc về cây lúa Cây lúa (Oryza sativa... chức năng mã hóa các protein có vai trò vận chuyển riêng biệt thể hiện trong các mô / hoặc cơ quan khác nhau [54 ]cho rằng OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển Na+ và OsHKT2 mã hóa cho protein đồng vận chuyển Na+ / K+ [34] cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận chuyển Na+ và OsHKT4 có ái lực thấp với vận chuyển Na+ OsHKT8 gần đây đã đƣợc biết đến là một gen mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển. .. giống lúa có khả năng kháng mặn khác nhau 1.7.2 Nội dung nghiên cứu  Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa  Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa  Nhân bản gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống lúa  Xác định trình tự gen OsHKT1 một số giống lúa  So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT1 và trình tự acid amin suy diễn ở một số giống lúa nhằm phát hiện đa hình của gen. .. chịu mặn của cây lúa Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trƣởng khác nhau đối với cây lúa Cơ chế chống chịu mặn của cây đƣợc biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [55] Mặn ảnh hƣởng đến hoạt động sinh trƣởng của cây lúa dƣới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau[56,57] Nhiều nghiên cứu. .. 1) giúp cho cây sống đƣợc ở môi trƣờng nhiễm mặn 1.3 Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật Đến nay, một loạt các hệ thống vận chuyển đã đƣợc báo cáo là có khả năng giúp thực vật cải thiện khả năng chịu mặn bằng cách ức chế sự hấp thụ Na+, hoặc vận chuyển Na+ vào không bào của tế bào (Hình 3) Mô hình đơn giản cho cơ chế hấp thụ K+ / Na+ , sự tuần hoàn và loại bỏ Na+ bởi các lớp... của gen mã hóa cho protein vận chuyển ion Na+ ở lúa Biểu hiện của OsHKT1, OsHKT2 và OsVHA đã đƣợc nghiên cứu nhờ kỹ thuật RT-PCR và insitu PCR Gần đây, một gen OsHKT từ giống lúa chịu mặn Nona Bokra đã đƣợc cô lập Gen này có vùng 5' tƣơng ứng với gen OsHKT2, nhƣng vùng 3' tƣơng ứng với các OsHKT1 Gen mới này đƣợc gọi là OsHKT1- 2 và nó là kết quả của đột biến mất đoạn 15 kb trên nhiễm sắc thể số 6 của. .. kiện mặn. (Hình 4) 10 Hình 4 Chức năng vận chuyển Na+ của protein HKT [42,62] Nhƣ chúng ta đã biết ion Na+ là một ion có hại đối với tế bào, Na+ ở nồng độ cao sẽ ức chế sự tăng trƣởng của cây Vì vậy protein HKT có 2 chức năng quan trọng là:  Chức năng vận chuyển ion qua màng tế bào: Protein HKT đƣợc mã hóa bởi họ gen HKT có vai trò quan trọng trong việc hấp thu Na+ từ ngoài môi trƣờng vào tế bào ở cả cây. .. loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể thực vật với nhau 13 Dựa vào những kết quả đã đƣợc công bố, nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao, thời gian đƣợc rút gắn Với lý do đó các kỹ thuật nghiên cứu đa hình gen đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu 1.6 Tình hình nghiên cứu liên quan đến gen OsHKT1 Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về... minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện tích điện áp (I- V) Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT1không tiếp tục vận chuyển K+ nữa Một đặc tính đặc trƣng của OsHKT1 là có ái lực cao với K+ Các tính chất chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT1 ở lúa đƣợc so sánh với biến thể OsHKT1 biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận thấy không có sự khác biệt về tính thấm Na+ và K+ cũng nhƣ cho. .. với OsHKT1, biểu hiện của OsHKT1- 2 giảm xuống trong điều kiện mặn nhƣng chức năng không bị mất đi Hơn nữa, mức giảm biểu hiện này trong OsHKT1- 2 là ít nghiêm trọng hơn so với việc giảm biểu hiện của gen OsHKT1 và OsHKT2 Điều này cho thấy OsHKT1- 2 đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển ion K+ khi cây gặp điều kiện mặn [54] Một nghiên cứu tiếp theo trên đối tƣợng gen OsHKT1 là nghiên cứu ... đa hình gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn lúa nhằm nghiên cứu tính đa hình gen OsHKT1 lúa CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét sơ lƣợc lúa Cây lúa (Oryza...  Nguyễn Thị Nha Trang NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA GEN OsHKT1 MÃ HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN... OsHKT1 mã hóa cho protein có vai trò vận chuyển Na+ vào tế bào lúa Nghiên cứu cấu trúc, chức gen OsHKT1 giúp làm sáng tỏ chế chịu mặn lúa Do đó, tiến hành đề tài nghiên cứu Nghiên cứu tính đa hình