Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở một số rừng Quốc gia Việt Nam

Để trả lời được các câu hỏi trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục litter fungi ở các rừng Quốc gia Việt N

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lê Thị Hoàng Yến

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NHÓM NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP TỪ

LÁ CÂY MỤC (LITTER FUNGI) Ở MỘT SỐ

RỪNG QUỐC GIA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-LÊ THỊ HOÀNG YẾN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NHÓM NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY MỤC (LITTER FUNGI) Ở MỘT SỐ RỪNG QUỐC GIA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Dương Văn Hợp

GS.TS Katsuhiko Ando

Hà Nội - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng nghiệp khác

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần nội dung còn lại chưa được công ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Lê Thị Hoàng Yến

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Dương Văn Hợp, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- người Thầy đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và giúp tôi tháo gỡ những khó khăn trong suốt quá trình làm luận án

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Katsuhiko Ando- Viện NITE Nhật Bản- người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền lại cho tôi phương pháp mới về nghiên cứu sự đa vi nấm ở Việt Nam cũng như niềm say mê nghiên cứu về Khoa học Nấm

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình về chuyên môn của các nhà Khoa học Nấm và các chuyên gia về enzyme vi sinh vật đang công tác tại Viện Công nghệ và Thẩm Định Quốc gia và Đại học Kyushu- Nhật Bản Bên cạnh đó, tôi cũng nhận được sự động viên, góp ý khoa học của các bạn đồng nghiệp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội Bằng những tình cảm trân trọng nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy Cô giáo tại Bộ môn

Vi sinh vật và Khoa Sinh học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đào tạo, giảng dạy cho tôi những kiến thức cơ bản về Sinh học và vi sinh vật học Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đặc biệt đến GS.TS Nguyễn Lân Dũng, người Thầy đã đặt nền móng cho sự nghiệp nghiên cứu nấm học của tôi Tôi cũng xin chân thành cảm ơn GS TS Phạm Văn Ty về sự nhiệt tình đóng góp ý kiến khoa học cho luận án của tôi được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện và tập thể cán bộ Viện Vi sinh vật

Và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội và Ban Giám đốc Viện Công nghệ Thẩm Định NITE- Nhật Bản; Phòng Sau Đại học; Ban Giám hiệu- trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi học tập và tham gia nghiên cứu để hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời cám ơn từ trái tim mình tới gia đình, những người thân và bạn bè

đã luôn bên cạnh, yêu thương, khích lệ và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Lê Thị Hoàng Yến

MỤC LỤC

Lời cam đoan 1

Lời cảm ơn 2

Mục lục 3

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt 7

Danh mục các bảng 8

Danh mục các hình vẽ 9

MỞ ĐẦU 11

Chương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 Đại cương về nấm 14

1.1.1 Nấm và các đặc điểm chung của nấm 14

1.1.2 Các nghiên cứu về tiến hóa về nấm 15

1.1.3 Hệ thống phân loại nấm 16

1.1.4 Phân loại học của nấm bất toàn (Mitosporic fungi hay microsporidia fungi) 17

1.1.5 Nhóm nấm Hyphomycetes 18

1.2 Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng đặc điểm hình thái 19

1.2.1 Các đặc điểm khuẩn lạc 19

1.2.2 Các đặc điểm của sợi nấm và vách ngăn của sợi nấm 20

1.2.3 Hình thái các cơ quan sinh bào tử của vi nấm Hyphomycetes 21

1.2.4 Các kiểu phát sinh bào tử trần của nấm 22

1.2.4.1 Phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng gốc (Basipeptal): 22

1.2.4.2 Nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Acropetal) 23

1.2.4.3 Phát sinh bào tử dạng tản (Thallic) 24

1.2.5 Các phương thức bào tử rời khỏi cuống: 24

1.3 Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng phân tích trình tự gen ADN riboxom 25

1.3.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm và vai trò của chúng trong phân loại sinh học phân tử 25

1.3.1.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm 25

1.3.1.2 Vai trò của các đoạn ADNr trong phân loại nấm sợi 26

1.3.2 Vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm(ADN barcoding fungi) 27

1.3.3 Phân tích sự phát sinh chủng loại 28

1.3.4 Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử 29

1.3.5 Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh 30

1.3.6 Nghiên cứu phân loại nhóm nấm Hyphomycetes dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh 32

1.4 Các bước tiến hành trong phân loại vi nấm 34

1.4.1 Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom 34

1.4.2 Phân loại một bậc phân loại nấm mới 34

1.4.3 Các nguyên lý cơ bản trong xác định danh pháp nấm (nomenclature) 35

1.5 Nấm tồn tại trên xác thực vật và các phương pháp phân lập chúng 36

1.5.1 Các dạng sinh thái của nấm 36

1.5.2 Nấm tồn tại trên xác thực vật 37

1.5.3 Các phương pháp phân lập nấm tồn tại trên xác thực vật 38

1.5.4 Một số kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm tồn tại trên xác thực vật ở một số nước trên thế giới 39

1.5.4.1 Ở Trung Quốc 39

1.5.4.2 Ở Ấn Độ 40

1.5.4.3 Ở Thái Lan 40

1.5.4.4 Ở Nhật Bản 41

1.5.4.5 Ở một số Quốc gia khác 41

1.5.5 Nghiên cứu đa dạng nấm ở Việt Nam 43

1.6 Một số loài nấm hyphomycetes có khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật 43

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.1 Nguyên liệu 46

2.1.1 Mẫu phân lập 46

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 49

2.1.2.1 Hóa chất 49

2.1.2.2 Thiết bị 50

2.1.3 Môi trường 51

2.1.3.1 Môi trường phân lập, phân loại và giữ giống 51

2.1.3.2 Môi trường dùng cho nuôi cấy và thử hoạt tính enzyme của nấm 51

2.2 Phương pháp 51

2.2.1 Phương pháp phân lập nấm 51

2.2.1.1 Phân lập bằng phương pháp rửa bề mặt 51

1.2.1.2 Phân lập bằng phương pháp tách bào tử đơn độc 53

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy bảo quản nấm sợi 56

2.2.3 Phân loại nấm sợi bằng quan sát hình thái 56

2.2.3.1 Quan sát khuẩn lạc và cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi thường 56

2.2.3.2 Quan sát hình thái cơ quan sinh bào tử của nấm dưới kính hiển vi điện tử quét 57

2.2.3.3 Quan sát số lượng nhân trong 1 tế bào của bào tử nấm dưới kính hiển vi huỳnh quang 58

2.2.4 Phân tích trình tự ADNr 18S hoặc 28S đoạn D1D2 của nấm 58

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học vi nấm 61

2.2.5.1 Tần suất xuất hiện (Frequency) 61

2.2.5.2 Chỉ số đa dạng sinh học loài H' (Shannon and Weiner's Index) 61

2.2.5.3 Chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson (Concentration of Dominance- Cd) 62

2.2.5.4 Chỉ số tương đồng (Index of similarity hay Sorensen’s Index- SI) 62

2.2.6 Sàng lọc enzyme phân giải CMC và xylan 62

2.2.7 Sàng lọc enzyme phân hủy lignin 63

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

3.1 Sự đa dạng của vi nấm về số lượng chủng nấm 64

3.2 Kết quả về đa dạng vi nấm hyphomycetes phân lập được ở 4 vùng sinh thái khác nhau ở việt nam 65

3.2.1 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Rừng Quốc gia Ba Bể 66

3.2.2 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở rừng Quốc gia Bạch Mã 68

3.2.3 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Mã Đà 71

3.2.4 Sự đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập được rừng Quốc gia Phú Quốc 73

3.2.5 Thảo luận 75

3.2.5.1 Sự đa dạng vi nấm dựa vào chỉ số về mẫu và số lượng mẫu 75

3.2.5.2 Phát hiện sự đa dạng của vi nấm dựa vào phương pháp phân lập 76

3.2.5.3 Sự đa dạng thành phần loài vi nấm Hyphomycetes dựa vào các chỉ số sinh học 77

3.2.5.4 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Lớp, Bộ, Họ 79

3.2.5.5 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Chi, Loài 81

3.2.5.6 Sự đa dạng về mức độ tương đồng giữa các khu vực nghiên cứu 83

3.2.6 Mô tả hình thái của một số loài nấm mới ở Việt Nam 84

3.2.6.1 Polybatispora quinquecornuta Matsush (1996) 84

3.2.6.2 Isthmolongispora genculata Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85

3.2.7.3 Isthmolongispora ampulisformis Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85

3.2.6.4 Isthmolongispora minima Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85

3.2.6.5 Ceratosporella ponapensis Matsush (1981) 86

3.2.6.6 Radiatispora yunaensis Matsush (1996) 86

3.2.6.7 Lateriramulispora ainflata Matsush (1975) 86

3.2.6.8 Scolecobasidium tricladiatum Matsush (1971) 87

3.2.6.9 Triglyphium alabamense Matsush (1981) 87

3.2.6.10 Varicosporium elodeae W Kegel (1906) 87

3.2.6.11 Triramulispora obclavata Matsush (1975) 88

3.2.6.12 Tripospermum myrti (Lind) S Hughes 1951) 88

3.2.6.13 Tricladiella pulvialis K Ando & Tubaki (1984) 89

3.3 Phát hiện một số chi, loài nấm mới 89

3.3.1 Hai chi nấm mới 90

3.3.1.1 Acerosispora L.T.H Yen et K Ando gen et sp nov 90

3.3.1.2 Hamatispora L.T.H Yen et K Ando gen nov 97

3.3.2 Năm loài nấm mới 100

3.3.2.1 Condylospora vietnamensis L.T.H Yen et K Ando sp nov (VN05- F0030) 100

3.3.2.2 Trisulcosporium phuquocense sp nov (VN11-F0028) và Trisulcosporium exiguum sp nov (VN11-F0029) 103

3.3.2.3 Polylobatispora ambigua sp nov 106

3.3.2.4 Isthmolongispora phuquocensis sp nov (VN11-F0048) 109

3.4 Nghiên cứu đa dạng các chủng nấm sinh enzyme phân hủy lignocellulose 113

KẾT LUẬN 116

KIẾN NGHỊ 117

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

PHỤ LỤC 138

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

nuc SSU rDNA (nuclear small

subunit ribosomal DNA)

ADN ribosome tiểu đơn vị nhỏ

nucLSU rDNA (nuclear large

subunit ribosomal DNA)

ADN ribosome tiểu đơn vị lớn

PCR (Polymerase Chain Reaction) Chuỗi phản ứng trùng hợp

DANHMỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại nấm 17

Bảng 1.2 Một số enzyme do nấm sinh ra 44

Bảng 2.1 Đặc điểm địa lý các vị trí lấy mẫu 47

Bảng 2.2 Danh sách các mẫu lá rụng thu thập từ 4 rừng Quốc gia: Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc- Việt Nam 48

Bảng 2.2 (tiếp) Danh sách các mẫu lá rụng thu thập từ 4 rừng Quốc gia: Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc- Việt Nam 49

Bảng 3.1 Số lượng nấm phân lập từ các mẫu lá rụng thu thập từ 4 RQG của Việt Nam 64

Bảng 3.2 Tổng kết về kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm ở Việt Nam 65

Bảng 3.3 Sự đa dạng của vi nấm Hyphomycetes phân lập ở Rừng Quốc gia Ba Bể 67

Bảng 3.4 Đa dạng sinh học vi nấm Hyphomycetes trong rừng Quốc gia Bạch Mã 69 Bảng 3.5 Sự đa dạng sinh học của vi nấm trong rừng Quốc gia Mã Đà 72

Bảng 3.6 Sự đa dạng sinh học của vi nấm trong rừng Quốc gia Phú Quốc 73

Bảng 3.7 Các chi nấm chiếm ưu thế tại 4 RQG nghiên cứu 78

Bảng 3.8 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Lớp, Bộ, Họ 80

Bảng 3.9 Số lượng và tỉ lệ phần trăm các chi, loài nấm phân lập được ở 4 RQG Việt Nam 81

Bảng 3.10 Mối tương quan giữa các khu vực nghiên cứu 83

Bảng 3.11 Danh sách những chủng nấm là chi, loài mới 90

Bảng 3.12 Kết quả phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 của chủng VN11-F0004 dựa vào phần mềm Blastsearch 92

Bảng 3.13 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Condylospora 101

Bảng 3.14 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Trisulcosporium sp 104

Bảng 3.15 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Isthmolongispora sp 110 Bảng 3.16 Khả năng sinh enzyme phân hủy lignocellulose của các chủng nấm nghiên cứu 114

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại của sinh vật nhân thật dựa vào trình tự ADNr

18S 15

Hình 1.2 Khuẩn lạc của Hyphomycetes trên gỗvà côn trùng 18

Hình 1.3 Cơ quan sinh bào tử trần của nấm Hyphomycetes 18

Hình 1.4 Cấu trúc vách ngăn ngang của sợi nấm 20

Hình 1.5 Các kiểu cuống sinh bào tử trần 21

Hình 1.6 Các loại bào tử khác nhau dùng trong phân loại nấm Hyphomycetes 22

Hình 1.7 Sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng gốc 23

Hình 1.8 Sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng ngọn 24

Hình 1.9 Phát sinh bào tử dạng tản 24

Hình 1.10 Các phương thức bào tử rời khỏi cuống 25

Hình 1.11 Cấu trúc một đơn vị ADN riboxom của nấm 26

Hình 1.12 Ví dụ về một cây chủng loại phát sinh 29

Hình 1.14 Cây phát sinh chủng loại của nhóm nấm Hyphomycetes dựa vào trình tự đa gen 33

Hình 1.15 Sơ đồ các bước tiến hành phân loại 1 chủng vi nấm 34

Hình 2.1 Bản đồ các địa điểm lấy mẫu 46

Hình 2.2 Các bộ phận của bộ vi thao tác Skarmen 54

Hình 2.3 Phản ứng đặc hiệu của enzyme laccaza với syringaldizine là cơ chất 63

Hình 3.1 Hình thái bào tử của một số loài nấm lần đầu tiên phân lập ở Việt Nam 84

Hình 3.2 Một số loài nấm lần đầu tiên được phân lập tại Việt Nam (tiếp) 88

Hình 3.3 Một số loài mới lần đầu tiên được phân lập ở Việt Nam (tiếp) 89

Hình 3.4 Hình thái các cơ quan sinh sản của chủng VN11- F0004 90

Hình 3.5 Sự phát sinh bào tử của chủng VN11-F0025 quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét 91

Hình 3.6 Quan sát số lượng nhân trong một tế bào của bào tử nấm 93

Hình 3.7 Đại diện các lớp sinh bào tử trần trong ngành phụ Pucciniomycotina 94

Hình 3.8 Vị trí phân loại của 2 chủng VN11-F0004 và VN11-F0025 dựa vào phân tích trình tự ADNr đoạn 18S 96Hình 3.9 So sánh hình thái của VN11-F0045 với chủng không thể công bố của Matsushima

1975 98

Hình 3.10 Các giai đoạn hình thành và phát triển bào tử của Hamatispora phuquocensis 98

Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại giữa VN11-F0045 và các loài có mối quan hệ

họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 99

Hình 3.12 Hình dạng bào tử của Condylospora vietnamensis VN05-F0030 dưới

kính hiển vi điện tử 102

Hình 3.13 Hình dạng bào tử của Condylospora vietnamensis VN05-F0030 dưới kính hiển vi

thường 103

Hình 3.14 Hình thái bào tử giữa các loài trong chi Trisulcosporium, Bars 10 μm 104

Hình 3.15 Cây chủng loại phát sinh của VN11-F0028 và VN11-F0029 với các loài

có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 105

Hình 3.16 Hình dạng cơ quan sinh bào tử của các loài trong chi Polylobatispora 107

Hình 3.17 Cây phát sinh chủng loại của VN05-F0031 với các loài có mối quan hệ

họ hàng gần, cây được xây dựa vào trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 108

Hình 3.18 Hình thái giữa các loài trong chi Isthmolongispora 111 Hình 3.19Cây phát sinh chủng loại của các loài trong chi Isthmolongispora, cây

được xây dựa vào trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 112Hình 3.20 Đa dạng thành phần các chi nấm có khả năng phân hủy CMC và xylan cao 115Hình 3.21 Đa dạng các chi nấm có khả năng sinh enzyme phân hủy lignin 115

MỞ ĐẦU

Vi nấm Hyphomycetes là nhóm nấm mang các cấu trúc sinh bào tử trần (cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử và bào tử) trên môi trường nuôi cấy, mà không sinh thể quả Chúng có thể tồn tại trong mọi hệ sinh thái: đất, nước, khí, phân, trong các vật chất hữu cơ và các loại mô thực vật, Vi nấm tồn tại trong lớp

lá rụng trong rừng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy sinh khối thực vật, nhờ vào khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào của chúng [49,71,113] Vì vậy, các loài nấm này có khả năng ứng dụng cao trong các ngành chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, trong xử lý nước thải, rác thải nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học, sản xuất giấy và trong chất tẩy rửa vì chúng có thể sinh ra một số lượng lớn các enzyme như amylase, celullase, xylanse, protease, phytase, lipase Các enzyme này phần lớn được sản xuất bởi các chủng

nấm sợi như: Aspergillus,Trichoderma, Penicilium, [42, 49, 63, 150,166] Một số

loài vi nấm còn được sử dụng trong sản xuất thuốc kháng sinh [46], sản xuất dược phẩm, chẳng hạn sản xuất statins- chất có khả năng làm giảm cholesterol từ nấm sợi [107] và trong kiểm soát sinh học (sản xuất độc tố mycotoxin Beauvericin từ nấm

vinấmcòncóvaitròthamgiavàovòngtuầnhoànvậtchấtnhư C,N, P vàkiểmsoát ô

thấyvaitròvàứngdụngnhiềumặtcủanấmđốivớiđờisống,

cácnhàkhoahọcngàycàngquantâmđếnnghiêncứuđadạngnấmvớimụctiêutìmkiếmpháthiệncáchoạtchấtmớicógiátrịtừcác taxon mới

Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1.000.000- 1.500.000 loài nấm [38; 68], nhưng đến năm 2008 mới định tên được khoảng 10.000 chi và 100.000 loài, trong đóAscomycota có khoảng 6.500 loài; Basidiomycota có khoảng 31.500 loài; Blastocladiomycota: 180 loài; Chytridiomycota: 710 loài; Glomeromycota:

170 loài; Microsporidia: trên 1.300 loài; Neocallimastigomycota: 20 loài [90] Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài [168] Ở Nhật Bản đã tìm được 12.000 loài [88] Nghiên cứu về đa dạng nấm ở Việt Nam chưa được coi trọng, đến nay

theo ước tính có khoảng 2.900 loài nấm ở Việt Nam đã được lập danh lục [8; 11], trong đó vi nấm có khoảng 400 chi, 450 loài được công bố [8; 9; 11; 12], con số này cũng còn khá khiêm tốn so với sự đa dạng vi nấm ở Việt Nam

Việt Nam là một nước có khí hậu nóng ẩm, vị trí địa lý kéo dài từ Bắc vào Nam, với sự đa dạng lớn về các vùng sinh thái đặc hữu, có nhiều rừng núi, nằm rải rác từ Bắc tới Nam ( từ 8°27′ - 23°23′ vĩ tuyến bắc) với các kiểu rừng khác nhau do

sự khác nhau về địa lý và thành phần thực vật Rừng Quốc gia Ba Bể (22o22’ vĩ bắc

và 105o36’ kinh đông), BạchMã (16o05’ vĩ bắc và 107o50’ kinh đông) và Mã Đà (11o13’ vĩ bắc và 107o5’ kinh đông) là 3 khu hệ sinh thái đặc trưng cho 3 vùng miền của đất nước Rừng Quốc gia Phú Quốc (10o12’- 10o27’vĩ bắc và 103o50’-

104o04’kinh đông) nằm trên đảo Phú Quốc, cách xa khỏi đất liền, nằm cách thị trấn Rạch Giá 120 Km và thị xã Hà Tiên 45 Km về phía Tây Nam, nhưng chỉ cách Campuchia có 3km Các nghiên cứu về động, thực vật, côn trùng, cho thấy cả 4 rừng này đều cóđặc điểm chung là đa dạng sinh học cao, nhiều loài động, thực vật sinh sống, có nhiều loài đặc hữu, quí hiếm và được ghi vào Sách Đỏ Việt Nam Tuy nhiên cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành mang tính hệ thống

về đa dạng vi nấm tồn tại trong các khu hệ sinh thái rừng Việt Nam Sự khác nhau

về đa dạng sinh học các loài vi nấm nằm trong lớp lá rụng giữa các vùng miền có gì

khác nhau? Để trả lời được các câu hỏi trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở các rừng Quốc gia Việt Nam " với các mục tiêu sau:

- Có được các dữ liệu về tính đa dạng sinh học của khu hệ nấm

Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục ở 4 rừng Quốc gia Việt Nam Phát hiện các chi, loài mới lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam và phát hiện các chi, loài mới cho khoa học

- Bảo tồn nguồn gen của khu hệ nấm Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục thu thập ở các Rừng Quốc gia Việt Nam

- Đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose của các chủng lựa chọn bảo quản

Đóng góp mới của luận án:

- Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây rụng ở 4 vườn Quốc gia Việt Nam(Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc), sử dụng hai kỹ thuật phân lập mới (phân lập nấm bằng phương pháp rửa

bề mặt và phân lập nấm bằng phương pháp tách bào tử đơn độc) trong nghiên cứu

đa dạng vi nấm tại Việt Nam

- Nghiên cứu đã đưa ra một bức tranh đa dạng về nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, gồm 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi, 176 Loài vi nấm

- Đã phát hiện được một số taxon mới trong hệ thống phân loại nấm học: 2 chi mới và 8 loài mới

- Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi: Aspergillus, Fusarium, Penicilliumvà Trichoderma vừa có tần suất xuất hiện cao lại vừa có khả năng sinh enzyme thủy

phân thành phần lignocelluloza cao

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

- Kết quả nghiên cứu của luận án đã làm giàu thêm đa dạng nguồn gen vi nấm cho Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật- Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học với

243 chủng vi nấm thuộc 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi, 176 Loài , trong đó có 02 chi mới, 08 loài mới cho khoa học

- Việc phân loại của 243 chủng vi nấm sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng định hướng cho các nghiên cứu khai thác nguồn gen vi nấm liên quan đến các chủng này

- Các chủng vi nấm thuộc taxa mới sẽ được cung cấp cho các cơ sở nghiên cứu khoa học (trong và ngoài nước) làm chủng chuẩn, chủng tham chiếu cho các nghiên cứu liên quan

- Các kết quả nghiên cứu enzym phân giải lignocelluloza có ý nghĩa định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính enzyme và khả năng ứng dụng các chủng này

Chương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM

1.1.1 Nấm và các đặc điểm chung của nấm

Nấm là nhóm vi sinh vật nhân thật, dị dưỡng, có khả năng hấp phụ chất dinh dưỡng, vách tế bào có chứa chitin và ß-glucan (trong quá trình tiến hóa một số nấm mất chitin, thậm chí là vách trong) Nấm thường là vi sinh vật hiếu khí, nhờ các ty thể Nấm thiếu các lạp thể, tế bào nấm có nhiều dạng, từ dạng tế bào đơn lẻ, chỉ gồm một tế bào đến cấu tạo dạng sợi, phát triển kéo dài sợi, tạo khuẩn lạc [52] Với

sự đa dạng về hình dạng như vậy đã khiến cho số lượng các loài nấm ước lượng khoảng 1,5 tới 15 triệu loài, trong khi đó chỉ có khoảng 100.000 loài đã được mô tả [38; 68]

Nấm được xếp vào một giới riêng, với những đặc điểm riêng như vách tế bào chứa chitin và glucan; chúng sinh sản theo kiểu nảy chồi hoặc hình thành dạng sợi; chúng không có hệ thống cần thiết để vận chuyển nước và chất dinh dưỡng (xylem, pholem) như đối với thực vật Tuy nấm được xếp vào một giới riêng như vậy, nhưng chúng cũng có một số điểm chung so với các giới khác:

- So với sinh vật nhân thật: tế bào nấm cũng có màng bao quanh lấy nhân, với các chromosome chứa đựng các ADN với các vùng không mã hóa gọi là các intron

và các vùng mã hóa gọi là các exon Riboxom của nấm là loại 80S [51]

- So với thực vật: Nấm không chứa lục lạp và là sinh vật dị dưỡng, đòi hỏi phải có các hợp chất hữu cơ là nguồn năng lượng [51]

- Giống như thực vật, nấm có vách tế bào, tuy nhiên thành phần vách tế bào của nấm chủ yếu là chitin, không phải cellulose như tế bào thực vật Thêm vào đó, một số loài nấm tiêu biểu có nhân đơn bội haploid, giống như tảo [51]

- So với vi khuẩn, nấm bậc cao và một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh axit amin L-lysine trong quá trình sinh tổng hợp đặc hiệu, gọi là con đường aminoadipate [51]

1.1.2 Các nghiên cứu về tiến hóa về nấm

Có rất ít thông tin về

nhưng lại có hình thái đơn gi

[33] Nghiên cứu tiến hóa n

vách tế bào [28], thử nghi

chuyển hóa tế bào [102] và các m

cho thấy giới nấm là một ph

Dựa vào cơ sở này và

như sự xuất hiện của các mấ

về nguồn gốc của nhóm n

Zygomycota, Ascomycota và Basidiomycota đư

ứu về tiến hóa về nấm

sự tiến hóa của nấm do nấm có sự đa dạng phong phú, đơn giản và thiếu các dữ liệu hóa thạch cần thiế

n hóa nấm dựa vào quan sát các đặc điểm hình thái, thành phghiệm tế bào học [167], nghiên cứu siêu c

và các mẫu hóa thạch [67] Nhiều phân tích phát sinh loài

t phần của bức xạ đầu cuối của nhóm sinh v

ng loại của sinh vật nhân thật dựa vào trình tự ADNr 18S [167]

[1994]đã sử dụng thời gian địa lý để tính toán s

i khác nhau trong một cây tiến hóa và đưa ra giả

ớp đến họ đã liên tục xuất hiện giữa kỷ Cambrinucleotit bị thay thế, biến đổi tỉ lệ thuận với thời gian, vì v

ng nucleotit thay đổi theo thời gian có thể ước lượng thời gian ti

này và việc sử dụng thêm các điểm tham chiếu khác, ch

ấu lồi của sợi nấm của nấm hóa thạch, thời gian tuy

a nhóm nấm đã được ước tính [33] Ba ngành nZygomycota, Ascomycota và Basidiomycota được cho là đã tách ra t

ng phong phú,

ết để phân tích

m hình thái, thành phần

u siêu cấu trúc [70], hân tích phát sinh loài

a nhóm sinh vật nhân thật

ADNr 18S [167]

tính toán sự xuất hiện

ả thuyết về tất Cambri tới kỷ

i gian, vì vậy dựa

i gian tiến hóa

khác, chẳng hạn

i gian tuyệt đối Ba ngành nấm chính,

ã tách ra từ

Chytridiomycota khoảng 550 triệu năm trước Sự phân chia Basidiomycota xảy ra khoảng 400 triệu năm trước, sau khi thực vật xâm chiếm đất Nhiều Ascomycetes đã tiến hóa cùng thời đại xuất hiện thực vật hạt kín khoảng 200 triệu năm về trước[34].

Ascomycota-1.1.3 Hệ thống phân loại nấm

Có 2 nhóm nấm chính: nấm giả và nấm thật Nhóm nấm giả (Chromista) bao gồm: nấm nước (Water moulds), nấm gây bệnh nấm lá thuộc ngành Oomycota Nấm giả khác với giới nấm thật ở nhiều đặc điểm: chúng có roi để bơi trong nước, vách tế bào chứa cellulose, thể dinh dưỡng đa bội, ty thể có màng gấp nếp phía trong, có khả năng tổng hợp lysine,… [52]

Nhóm nấm thật (Eumycota) hay còn gọi là giới nấm được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà phân loại nấm học, chúng được phân chia theo nhiều thuyết khác nhau, và không thống nhất với nhau Nhưng có sự thống nhất về thuật ngữ Latinh tên các taxon trong phân loại nấm: Ngành- mycota; Ngành phụ- mycotina; Lớp- mycetes; Lớp phụ- mycetidae; Bộ- ales; Bộ phụ- ineae; Họ- aceae; Họ phụ- oideae [52; 90] Chúng được chia thành 5 Ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, lomeromycota, Ascomycota, Basidiomycota và Microsporidia (Bảng 1.1) [52]

- Ngành Chytridiomycota (Ngành Nấm Thích ty): Môi trường sống ở dưới nước, có khả năng di động, cơ thể thường gồm một tế bào (thỉnh thoảng có cấu trúc dạng sợi), tuy nhiên không có vách ngăn, cơ quan sinh sản là bọc bào tử nhỏ

- Ngành Zygomycota (Ngành Nấm Tiếp hợp): Sống trên cạn, tế bào dạng sợi, không có vách ngăn, cơ quan sinh sản là bào tử tiếp hợp

- Ngành Glomeromycota là ngành nấm bậc thấp, sợi nấm chưa có vách ngăn, bào tử có kích thước lớn (80-500 μm)

- Ngành Ascomycota (Ngành Nấm Túi): Môi trường sống trên cạn, tế bào dạng sợi hoặc dạng đơn lẻ (nấm men), có vách ngăn Cơ quan sinh sản là thể quả (một số loại nấm ăn) hoặc bào tử vô tính

- Ngành Basidiomycota(Ngành Nấm Đảm): Phần lớn sống trên cạn, tế bào dạng sợi hoặc đơn lẻ, có vách ngăn thường có cùng với các mấu liên kết

- Ngoài ra còn có nhóm nấm Microsporidia: Các loài nấm chưa tìm thấy dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn– Fungi imperfecti

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại nấm Giới nấm thật (Mycota hay

Eumycota)

Nấm noãn (Oomycotila)

Nấm nhầy (Mycomycotila)

Nấm thích ti (Chytridiomycota) Oomycota Myxomycota

Nấm tiếp hợp (Zygomycota) Hyphochytridiomycota Plasmodiophoromycota Glomeromycota Labyrinthylomycota Dictyosteliomycota Nấm túi (Ascomycota) Acrasiomycota

1.1.4 Phân loại học của nấm bất toàn (Mitosporic fungi hay microsporidia fungi)

Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm, thường được gọi là nấm sợi Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes [1953] Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm lớn, không nhóm nào trong 3 nhóm này là đơn gen (homogeneous), chúng thường là đa gen (polyphyletic) [79], đó là các nhóm:

- Blastomycetes (bào tử nảy chồi): Nhóm nấm men sinh sản vô tính, bao gồm

cả một số nấm túi, chẳng hạn Saccharomycetales, và một số nấm đảm, chẳng hạn như Spoidiales, Ustilaginomycetes, Agaricomycetes,

- Coelomycetes: Nấm hình thành bào tử trên đĩa giá hay thể đệm, phần lớn

chúng thuộc nấm túi, một số thuộc nấm đảm

- Hyphomycetes: Nhóm nấm sinh bào tử trần từ cuống sinh bào tử và tế bào

sinh bào tử mà không sinh ra trên đĩa giá hay thể đệm, phần lớn chúng thuộc nấm túi, một số ít thuộc nấm đảm

1.1.5 Nhóm nấm Hyphomycetes

Sự khác biệt về hình thái gi

lại không rõ ràng, chẳng hạn như

Hormonema spp thường đư

phân, côn trùng (Hình 1.2) và trên n

vậy nên hyphomycetes có th

vải, và thường xuyên có m

phát triển của bào tử và các cơ quan sinh bào t

Hình 1.3 Cơ quan sinh bào t

A

ấm Hyphomycetes

hình thái giữa Hyphomycetes và 2 nhóm sinh sả

n như ở các chi Geotrichum spp., Aureobasidium

ng được xếp vào nhóm Hyphomycetes, nhưng đ

p vào nhóm Blastomycetes [156]

ng có giai đoạn vô tính là Hyphomycetes, nấm đảm thì ch

nhóm khác xuất hiện cả 2 loại vô tính Hyphomycetes và

ể tồn tại ở nhiều loại cơ chất: mô thực vật, g2) và trên nấm khác Do chúng có nơi sống phong phú như

y nên hyphomycetes có thể làm hỏng thực phẩm, làm nhiễm các vật li

ng xuyên có mặt trong môi trường sống của con người, có nhi

Khuẩn lạc của Hyphomycetes trên gỗvà côn trùng

Beauveria basiana trên ve sầu B Trichoderma sp

i ta phân loại nấm Hyphomycetes dựa vào hệ thố

và sử dụng các thuật ngữ này trong phân loại Ph

ng những thuật ngữ để mô tả toàn bộ trình tự hình thành và

và các cơ quan sinh bào tử trần của chúng (Hình 1.3)

Cơ quan sinh bào tử trần của nấm Hyphomycetes

t, gỗ, vỏ cây,

ng phong phú như

t liệu gỗ, giấy, , có nhiều loài

ống phân loại

i Phần lớn các hình thành và (Hình 1.3)

1.2 CÁC TIÊU CHÍ SỬ DỤNG TRONG PHÂN LOẠI HYPHOMYCETES BẰNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

Vi nấm có thể phân loại dựa vào quan sát các đặc điểm hình thái các cấu trúc

cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử và bào tử) của chúng dưới kính hiển vi phản pha quang học Normarnski, kính hiển vi huỳnh quang, hay phương pháp nhuộm cấu trúc đỉnh của tế bào áo Trong phân loại nấm những loài không sinh bào tử, đặc biệt là nấm gây bệnh thực vật gặp phải khó khăn, vì chúng thường không sinh bào tử trong mô thực vật và thậm chí nhiều loài còn không sinh bào tử trên môi trường nuôi cấy Trong các trường hợp này phải dùng đến phương pháp kháng thể đặc hiệu, hay sử dụng phương pháp quan sát sắc tố, hình dạng và sự xuất hiện vách ngăn ngang của sợi nấm Mặc dù đã có một số kít chuẩn đoán ra đời, nhưng những phương pháp này không sẵn có trên thị trường vì chúng khó có thể thực hiện được hàng ngày Vì vậy, các nhà nấm học vẫn phải sử dụng các loại môi trường khác nhau để kích thích sự nảy mầm bào tử, dựa vào đó để phân loại chúng Các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình thái cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử và bào tử), cũng như các phương thức phát sinh và phát triển bào tử (conidium ontogeny) và cách mà bào tử rời khỏi tế bào sinh bào tử là những đặc điểm cần thiết trong phân loại hình thái vi nấm

1.2.1 Các đặc điểm khuẩn lạc

Trên môi trường nuôi cấy, từ một bào tử nảy mầm hình thành nên sợi nấm Sợi nấm không ngừng phân nhánh, phát triển thành một hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc Quan sát hình dạng khuẩn lạc nấm sợi có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm Một số các đặc điểm hình thái khuẩn lạc cần quan sát trong phân loại vi nấm: dạng mặt khuẩn lạc; mép khuẩn

lạc; màu sắc, kích thước khuẩn lạc; sự tạo thành sắc tố hoặc giọt tiết, bó sợi, bó giá

(Synnematous or sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm (Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv cũng là các đặc điểm cần quan sát trong phân loại bằng hình thái học nấm sợi [156]

1.2.2 Các đặc điểm của sợi nấm và vách ngăn của sợi nấm

Vách ngăn ngang của sợi nấm được hình thành từ thành tế bào Lúc đầu hình thành một gờ nhỏ hình khuyên, sau đó tiến dần vào trong và lấp kín lại Tuy nhiên vách ngăn thường có 1 hay nhiều lỗ Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có 1 lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh Nấm bậc thấp không có vách ngăn, ngược lại các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn

Ở nấm túi và một số vi nấm vách ngăn của sợi nấm có một lỗ ở chính giữa,

đường kính khoảng 0,05-0,5µm cho phép sự truyền tế bào chất từ tế bào này sang tế bào khác Bên cạnh đó, tại mỗi vách ngăn còn tồn tại những cơ quan có hình cầu, bám vào màng gọi là thể Woronin, gồm các protein cuộn chặt, hình cầu và thường

có kích thước lớn hơn lỗ của vách ngăn, thể Woronin này có nhiệm vụ đóng lỗ vách ngăn không cho trao đổi tế bào chất xảy ra khi cần thiết [109](Hình 1.4.a)

Cấu trúc điển hình nhất của vách ngăn ngang của sợi nấm được thể hiện ở

nấm đảm (Basidiomycota), gọi là vách ngăn ngang Dolipore (vách ngăn ngang cũng

có một lỗ thủng ở giữa, 2 bên lỗ có 2 cấu trúc hình bán cầu (swelling), vùng trung tâm vách ngăn được gọi là vùng Parenthesome có chức năng ngăn cản sự di chuyển của các cơ quan quan trọng, nhưng vẫn cho tế bào chất đi qua Ngoài vách ngăn ngang, nấm đảm còn xuất hiện mầu lồi (Hình 1.4 b)

Hình 1.4 Cấu trúc vách ngăn ngang của sợi nấm

a vách ngăn ngang của nấm túi và một số vi nấm; b vách ngăn ngang của nấm đảm

[109]

1.2.3 Hình thái các cơ quan sinh bào t

a) Cuống sinh bào tử tr

nhiều các tế bào sinh bào tử

Hình 1.5 a.Cuống sinh bào tử trần không có t

trần hoặc không rõ, c Cuống s

phân nhánh, d Cuống sinh bào t

vách ngăn, phát triển đơn độ

một nhóm các cuống sinh bào t

b) Tế bào sinh bào tử

của sự phát sinh bào tử trần c

c) Hình dạng bào tử trầ

số các vách ngăn của bào tử

Dựa vào số lượng các vách ngăn c

10 loại khác nhau (Hình 1.6)

ơ quan sinh bào tử của vi nấm Hyphomycetes

trần: là sự biệt hóa của sợi nấm sinh sản, mang m

ử trần, có 6 loại (Hình 1.5):

Hình 1.5 Các kiểu cuống sinh bào tử trần [156]

n không có tế bào sinh bào tử trần, b Không có cuống sinh bào t

ng sinh bào tử trần có hoặc không có vách ngăn, đơn gi

ng sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần,

ộc hoặc phân nhánh, f Bó cuống bào tử trần (Synemata) g

nh bào tử trần bó chặt hoặc lỏng mang các bào tử trần

cả đỉnh lẫn bên cạnh cuống

ử trần: Tế bào sinh bào tử trần được mô tả theo thu

n của nấm (Phần 1.2.4)

ần: Trong phân loại hình thái, quan sát hình d

ử để quyết định sự giống hoặc khác nhau giữ

ng các vách ngăn của một bào tử, người ta chia chúng ra thành

Hình 1.6 Các loại bào tử khác nhau dùng trong phân lo

A.Bào tử dạng đơn giản một t

thận, B Bào tử 2 tế bào (Didymoconidia): bào t

vách ngăn, C Bào tử nhiều hơn 2 t

ngăn với nhau bằng các vách ngăn,

(Dictyoconidia), E Bào tử nhi

quả chùy Clathrate, G Bào tử

có khía dọc (Cheiroid conidia),

Ngoài ra, các đặc điểm

hoặc có màu nâu, nâu đen…; b

lồi,…); kích thước bào tử tr

quan trọng trong phân loại hình thái

1.2.4 Các kiểu phát sinh bào t

1.2.4.1 Phát sinh bào tử dạng

Một số loài nấm phát sinh bào t

ra từ gốc của chuỗi và thườ

của chuỗi đính trên phần đ

non nhất của chuỗi bào tử luôn n

Nếu một bào tử được hình thành t

(monoblastic) (Hình 1.7B) N

gọi là nảy chồi ở nhiều vị trí

khác nhau dùng trong phân loại nấm Hyphomycetes

t tế bào (Ameroconidia), có hình cầu, gần cầu, elip, hình qubào (Didymoconidia): bào tử có 2 tế bào, được ngăn vớ

u hơn 2 tế bào (Phragmoconidia) bào tử có từ 3 t

ng các vách ngăn, D Bào tử gồm nhiều tế bào ngang, d nhiều tế bào, hình hoa (Bulbils), F Bào tử nhiều t

ử hình xoắn ốc, H Bào tử dạng sao (stauroconidia),

c (Cheiroid conidia), J Bào tử nhiều tế bào, dài và cong (Scolecoconidia).

m khác của bào tử trần như: màu bào tử trầđen…; bề mặt bào tử trần (có hay không có gai, htrần (đa dạng từ 1 µm-hàng 100 µm) cũng là nh

i hình thái [156]

ào tử trần của nấm

ng nảy chồi hướng gốc (Basipeptal):

m phát sinh bào tử theo chuỗihướng gốc: bào tử m

ờng vẫn đính với tế bào sinh bào tử, và bào t

n đỉnh chuỗi, điều này có nghĩa là các bào tửluôn nằm ở gốc(Hình 1.7 A-E)

c hình thành từ một tế bào mẹ gọi là nảy ch

) Nếu nhiều vị trí sinh bào tử trên một tế bào sinh bào t

trí (Polyblastic hay polyphialidic), thông thư

m Hyphomycetes[156]

u, elip, hình quả

ới nhau bằng 1

3 tế bào, được bào ngang, dọc

u tế bào, hình

ng sao (stauroconidia), I Bào tử

bào, dài và cong (Scolecoconidia)

ần, trong suốt (có hay không có gai, hạt, mấu

sinh bào tử của polybastic xảy ra độc lập Nhưng một số loài, sự phát sinh bào tử

xảy ra tại cùng một thời điểm, tại cùng một vị trí gọi là synchronous polyblastic

(Hình 1.7C)

Trong phương thức nảy chồi ngoại sinh (holoblastic) vách tế bào bên ngoài của tế bào sinh bào tử được nối với vách của bào tử Trong sinh sản chuỗi hướng gốc (basipetal), có 3 phương thức cần được phân biệt: nếu vị trí các tế bào sinh bào

tử được giữ nguyên không đổi- được gọi là phát sinh bào tử dạng thể bình (phialidic) (Hình 1.7C); Nếu vị trí này được mở rộng về phía trước được gọi là

perrcurrent hay annellidic (Hình 1.7D) Nếu vị trí này bị ngắn đi được gọi là

retrogressive, nghĩa là sự phát sinh bào tử bị suy giảm (Hình 1.7E) [156]

Hình 1.7 Sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng gốc [156]

A.Nảy chồi hướng gốc, B.nảy chồi đơn độc C Nảy chồi dạng thể bình, tại cùng một thời

điểm, tại cùng một vị trí, D Nảy chồi mở rộng về phía trước, E Nảy chồi suy giảm

1.2.4.2 Nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Acropetal)

Trong khi đó một số loài bào tử lại phát sinh theo kiểu nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Hình 1.8 A), bào tử mới sinh ra tại đỉnh chuỗi hay đính với đỉnh của một bào

tử già hơn, vì thế bào tử già nhất luôn nằm ở gốc của chuỗi, điều đó có nghĩa là bào

tử non nhất và nhỏ nhất luôn nằm ở đỉnh của chuỗi Một số loài chuỗi bào tử có dạng phân nhánh, bào tử ở gốc thường lớn hơn và có nhiều vách ngăn hơn bào tử nằm phía trên Tại điểm phát sinh nhánh, bào tử thường có một vết sẹo ở phần gốc

và 1-2 vết sẹo ở phần đỉnh, được gọi là bào tử phân nhánh (ramoconidia) (Hình 1.8 B) [156]

Schizolytic (Hình 1.10 A-C) là phương th

thành 1 vách phân chia (vách ngăn ngang) h

tử, tạo thành sẹo ở đỉnh cuố

tử- đây là một trong những đ

Rhexolytic (Hình 1.10 D

2 vách ngăn ngang giữa tế

phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng ngọn

ọn không phân nhánh, B Nảy chồi hướng ngọn phân nhánh

ng tản (Thallic)

ó 2 loại phát sinh: Tản theo chuỗi, dạng này s

u điểm khác nhau và tạo thành chuỗi, chẳng h) Một số loài nấm chỉ tạo thành vách ngăn tạ

ng này hiếm gặp) (Hình 1.9 B) [156]

Hình 1.9 Phát sinh bào tử dạng tản

c (Oidiodendron) B Tản theo chuỗi (Geotrichum

ào tử rời khỏi cuống:

c bào tử rời khỏi cuống: Schizolytic và Rhexolytic C) là phương thức thông dụng nhất, và kết qu

thành 1 vách phân chia (vách ngăn ngang) hình thành giữa bào tử và tế

ống sinh bào tử và gốc bào tử, còn gọi là rốn (hilum) bào

ng đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm

Rhexolytic (Hình 1.10 D- F) là hình thức rời khỏi cuống của bào t

ế bào sinh bào tử và bào tử, khoảng không gi

ngăn ngang không có nhân (không gọi là 1 tế bào), khi vách ngăn này bị vỡ, bào tử rời khỏi tế bào sinh bào tử [156]

Hình 1.10 Các phương thức bào tử rời khỏi cuống [156]

A-C Schizolytic và D-F Rhexolytic

1.3 CÁC TIÊU CHÍ SỬ DỤNG TRONG PHÂN LOẠI HYPHOMYCETES BẰNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ADN RIBOXOM

1.3.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm và vai trò của chúng trong phân loại sinh học phân tử

1.3.1.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm

Một trong những nhóm gen thường được sử dụng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại của nấm là những gen mã hóa cho ARNr Tính phổ biến và hiệu quả của việc so sánh trình tự ARNr/ADNr xuất phát từ các đặc tính quan trọng sau: (i) Các riboxom có mặt ở tất cả các sinh vật có cấu tạo tế bào và xuất hiện cùng nguồn gốc tiến hóa, do vậy tất cả các sinh vật đều có bằng chứng lịch sử phân tử; (ii) ARNr

là một gen có nhiều bản sao, không mã hóa protein, các bản sao được sao chép liên tục song song và đồng nhất trong quá trình phát triển và do đó có độ bảo thủ cao [174; 175]; (iii) ARNr/ ADNr được bảo tồn đầy đủ ở các sinh vật, bên cạnh đó các vùng gen bảo tồn này lại xen kẽ với các vùng dễ biến đổi [66] Một đơn vị ADNr mã hóa cho ARNr được chia thành các vùng: (i) Vùng mã hóa, gồm các gen được sắp xếp theo trật tự 18S; 5,8S và 28S Các gen này tập hợp thành một đơn vị phiên mã ARNr (rRNA transcription unit); (ii) Vùng không mã hóa gồm các đoạn trình tự IGS

(Inter- Genic Spacer) được chia làm 2 vùng: vùng không phiên mã NTS (nontranscribed) và vùng sao chép ngoài ETS (Externally Transcripbed Spacer) nằm nối tiếp giữa 28S và 18S kế tiếp Vùng không mã hóa khác gồm ITS1 (nằm giữa 2 gen 18S và 5,8S) và ITS2 (nằm giữa 5,8S và 28S) Các vùng không mã hóa cũng được phiên mã là ITS và ETS, còn vùng không mã hóa cũng không được sao chép là vùng NTS (Hình 1.11) Tổng chiều dài của một ADN lặp lại là giữa 7.7- 24 kb [73]

Hình 1.11 Cấu trúc một đơn vị ADN riboxom của nấm [73]

1.3.1.2 Vai trò của các đoạn ADNr trong phân loại nấm sợi

Trong phân loại nấm sợi, do có sự lựa chọn khác nhau về vùng gen dùng trong phân loại mà việc phân tích mối tương quan giữa các loài được đánh giá ở các mức

độ khác nhau ARNr 18S (small-subunit (SSU)- ARNr tiểu đơn vị nhỏ) là vùng đủ

lớn và chứa các vùng rất bảo thủ cũng như các vùng biến đổi Việc xác định trình tự rARN 18S được dùng để phân tích mối quan hệ gần gũi của các nhóm nấm có mối quan hệ họ hàng gần ở bậc phân loại cao từ cấp ngành đến cấp loài [33; 164;185]

ARNr 28S đoạn D1D2 có vùng biến đổi, chứa nhiều thông tin và cho phép phân

loại từ mức độ các bậc phân loại cao đến bậc phân loại loài, vì vậy chỉ cần phân tích một đoạn ngắn vùng gen biến đổi (vùng D1D2- khoảng 600 bp) cũng đã có thể so sánh, đánh giá mối quan hệ họ hàng gần giữa các loài nghiên cứu[65] Đoạn gen này được sử dụng rộng rãi trong phân loại đến mức độ chi, loài cho nấm men [100;

101], nấm Đảm [32] và nấm Túi [64; 112] Trình tự gen vùng ITS là vùng có nhiều

biến đổi hơn nên có thể dùng trình tự gen này để phân loại mức độ loài ở nấm men

[65] và hầu hết các nấm sợi phổ biến như Trichoderma [158], Penicillium [74],

Aspergillus [176],…

Tuy nhiên với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay để phân loại đến loài đối với mỗi chi nấm người ta sử dụng những đoạn trình tự gen khác nhau Chẳng

hạn để phân loại đến loài chi Penicillium phải dùng tới 4 đoạn gen: Dưới đơn vị

cytochrome C có khả năng oxi hóa 1 (cox1), β-tubulin (benA), nhân tố kéo dài dịch

mã 1-α (tef1-α), và calmodulin (cmd) [187] Để phân loại các loài thuộc chi Aspergillus, 5 đoạn gen: beta tubulin (BT2), calmodulin (CF), ITS và LUS ADNr

(ID) và RNA polymerase II (RPB2) đã được sử dụng [136] Để phân loại đến loài chi thuộc nhóm Mucorales người ta phải dùng đến trình tự đa gen: 28S ADNr vùng

D1/D2, ADNr vùng ITS, actin, và nhân tố kéo dài dịch mã (EF-1α).

1.3.2 Vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm(ADN barcoding fungi)

Trong phân loại vi nấm, các nhà khoa học nấm vẫn lựa chọn phân loại dựa trên quan sát và phân tích hình thái, phương pháp này thường phải cần các chuyên gia

có kinh nghiệm và chỉ phân loại được trên những tiêu bản nấm có đủ cấu trúc sinh sản Tuy nhiên với tiến bộ của khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự ADN là một phương pháp có nhiều ưu việt, nó có thể cho phép một cán bộ trẻ chưa có nhiều kinh nghiệm về phân loại nấm cũng có thể phân loại chúng từ những vật liệu sống của nấm, thậm chí là từ tiêu bản khô Vùng gen di truyền dùng để phân loại một chủng nấm bất kỳ, từ những mẫu bất kỳ, thậm chí là những mẫu đã bị phá hủy hay các mẫu ngoài môi trường được gọi là vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm (ADN barcoding fungi) Thuật ngữ này được đưa ra bởi Hebert và cộng sự (2003), hiện nay có rất nhiều tài liệu nói về vấn đề này, chẳng hạn:

www.barcoding.si.edu, Việc dùng một ADN barcoding fungi lý tưởng có thể biểu hiện được mối liên kết về những thay đổi trong cùng một loài (intraspecific) hay giữa

các loài chị em (sibling) [71] Gen CO1- tiểu đơn vị 1 cytochrome C oxidase (the

cytochrom C oxidase subunit 1) - vùng ty thể đã được biết đến là vùng ADNr mã hóa dùng trong phân loại nấm chuẩn cho mọi vi sinh vật, tuy nhiên nghiên cứu phân loại học của nấm, có rất ít dữ liệu về CO1 [126; 155] Hiện nay, các nhà nấm học vẫn sử

dụng đoạn ITS, 28S để phân loại nấm đến loài, trong đó nhiều ý kiến cho rằng nên sử dụng đoạn ITS là locus chuẩn dùng cho phân loại nấm Không dừng lại ở đó, các nhà khoa học đang lỗ lực tìm ra những locus có nhiều thông tin hơn trong phân loại nấm

Và việc quan trọng hơn cả là cần phải công bố những kết quả về phân tích trình tự các chủng nấm có trong các Bảo tàng Giống chuẩn trên thế giới [49] Những hồ sơ dữ liệu về trình tự của nấm cũng cần được phổ biến trong một trang web chung để người

sử dụng có thể nhận được số liệu thô của mình, so sánh và diễn giải kết quả của mình

có chất lượng Dữ liệu trong ngân hàng genbank có thể đáp ứng được những nhu cầu

đó, vì vậy nó được gọi là "barcoding flag" Trang dữ liệu về ADN barcoding thông dụng nhất hiện nay là: barcoodinglife.org/views/login/phb; www.cbs.know.nl hay the

Trichoderma&Hypocrea database www.isth.infor [49]

1.3.3 Phân tích sự phát sinh chủng loại

Mục đích của phân tích sự phát sinh chủng loại bằng việc xây dựng cây phát sinh chủng loại là sắp xếp, so sánh một loài với các loài khác càng gần gũi càng tốt.Cây phả hệ và cây phát sinh chủng loại phải phản ánh được quá trình tiến hóa giữa các loài trong cây [137; 182; 183] Trong cây phát sinh chủng loại, một chủng

có thể đại diện cho một loài, nhưng cũng có thể nhiều chủng được đại diện cho một loài Xây dựng cây phân tích phát sinh chủng loại được tiến hành qua các bước sau: trước hết thành lập các ma trận đặc điểm, sau đó phân tích các ma trận và cuối cùng

là biểu hiện cây và diễn giải các thông tin trên cây bằng việc sử dụng các thuật toán

Thông thường cây được thể hiện dưới dạng Phylogram, trên đó chiều dài nhánh (branch lengh) được biểu hiện, chúng được sắp xếp tại phần gốc của cây và

thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa chủng nghiên cứu và các chủng gần gũi khác Giá

trị Bootrap thể hiện tại phần gốc của nhánh, thông thường giá trị này >50% mới

được thể hiện, nhưng một số tác giả lại lấy giá trị >65% (Hình 1.12) [49]

Hình 1.12 Ví dụ về một cây chủng loại phát sinh

1.3.4 Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử

Trong phân loại dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử, một số tác dùng phương pháp điện di để so sánh, phân loại độ tương đồng giữa các loài.Tuy nhiên tính chính xác của phương pháp này có nhiều hạn chế, do nhiều loài khác nhau nhưng có kích thước các đoạn gen dùng trong phân loại không khác nhau Vì vậy đa phần các tác giả đã xác định trình tự của các loài gần gũi và phân tích mối quan hệ họ hàng giữa chúng

Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi ở các chi Penicillium [104],Fusarium [137]

vàTrichoderma [96],…

Trong số các phương pháp điện di ADN, phương pháp RPLP (restriction fragment length polymorphism) là đặc biệt quan trọng đối với phân loại Kỹ thuật này liên quan đến việc cắt các mẫu ADN bằng các enzyme giới hạn tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từ đó lập thành bản đồ gen và so sánh sự khác nhau giữa các loài [172] Kỹ thuật này đã được phát triển từ những năm 1980, tuy nhiên chúng không được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu đa dạng chi, loài nấm mà chủ yếu dùng trong nghiên cứu đa dạng các thứ, các dòng nấm cụ thể hoặc dùng để phân tích mối quan hệ giữa loài vô tính và hữu tính (anamorph – teleomorph)

1.3.5 Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh

Năm 2004 Luitzoni và cộng sự đã tổng hợp các số liệu từ 560 công trình nghiên cứu về xây dựng cây phân loại nấm từ những năm 1990 trở lại đây và cho rằng nấm chủ yếu được phân loại dựa vào trình tự 5 loại gen phổ biến: ADNr đoạn 18S và 28S, ADN riboxom tiểu đơn vị nhỏ mitochondrial (mitSSU ADNr) và tiểu

đơn vị lớn thứ 2 của ARN polymerase II (RPB2) và gen ITS Trong đó có tới 489

(82,2%) số cây dựa vào trình tự đơn gen, 77 cây dựa vào trình tự 2 gen, 19 cây dựa vào trình tự 3 gen, 10 cây dựa vào trình tự 4 gen [105]

Dựa vào các kết quả nghiên cứu trước đó, Lutzoni và cộng sự đã xây dựng lại cây phân loại nấm dựa vào trình tự gen ADNr đoạn 18S và 28S, theo đó giới nấm được chia làm 5 ngành: Chitridiomycota, nằm ở nhánh cuối cùng, tiếp đến là: Zygomycota, Glomeromycota- đây là những ngành nấm bậc thấp không có sợi hoặc sợi nấm không có vách ngăn Ngành nấm đảm Basidiomycota sợi nấm đã có vách ngăn và có mấu lồi, trên cùng là ngành nấm túi Ascomycotina -sợi nấm có vách ngăn rõ ràng (Hình 1.13) [105]

Hình 1.13Cây phát sinh chủng loại giới nấm dựa vào trình tự gen rADN đoạn 18S

và đoạn 28S [105]

1.3.6 Nghiên cứu phân loại nhóm nấm Hyphomycetes dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh

Bằng việc phân tích trình tự đa gen SSU ADNr (18S), ADNr vùng ITS, nucLSU

ADNr (28S), mitSSU ADNr) và RPB2,Schoch và cộng sự năm 2009 đã xây dựng cây phân loại nhóm nấm Hyphomycetes, chúng được phân chia ra làm 8 lớp: Peizomycetes, Orbiliomycetes, Arthoriomycetes, Dothiodeomycetes, Eurotiomycetes, Lecaneromycetes, Leotiomycetes, Sordariomycetes [152] (Hình 1.14)

Lớp Sodariomycetes gồm 14 bộ (Hypocreales, Coronophorales, Melanosporales, Glomerellales, Microascales, Lulworthiales, Diaportales, Calosphaeriales, Ophiostomatales, Magnaporthales, Sordariales, Chaetosphaeriales, Coniochaetales, Xilariales), 31 họ (Clavicipitaceae, Ophiordicipitaceae, Stachybotrys clade, Cordycipitaceae, Hypocreaceae, Niessliaceae, Nectriaceae, Bionectriaceae, Melanosporaceae, Glomerellaceae, Microascaceae, Halosphariaceae, Lulworthiaceae, Gnomoniaceae, Menlaconiaceae, Cryphonectriaceae, Valsaceae, Diaporthaceae, Calosphaeriaceae, Ophiostomataceae, Annulastascaceae, Magnaporthaceae, Sordariaceae, Lasiosphaeriaceae, Chaetosphaeriaceae, Boliniaceae, Coniochaetaceae, Xylariaceae) (Hình 1.14 B) Lớp Eurotiomycetes gồm 3 bộ (Chaetothiriales, Onygenales, Eurotiales), 4 họ (Herpotrichiellaceae, Chaetothyriaceae, Onygenaceae, Trichocomaceae) chính (Hình 1.14 C) Lớp Dothiodeomycetes gồm 3 bộ, họ 39 họ, trong có 8 họ thường gặp nhất là: Pleosporaceae, Tetraplosphaeriaceae, Tubeufiaceae, Mycosphaerellaceae, Teratosphaeriaceae, Capnodiaceae, Dividiellaceae và Dothideaceae (Hình 1.14 D) [152]

Hình 1.14 Cây phát sinh chủng loại của nhóm nấm Hyphomycetes dựa vào trình tự đa gen

[152]

1.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TRONG PHÂN LOẠI VI NẤM

1.4.1 Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom

Hiện nay trong phân loại nấm sợi, phương pháp phân loại chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái cũng có thể công bố loài mới và trong các nghiên cứu đa dạng vi nấm Tuy nhiên để nghiên cứu có giá trị cao hơn thì việc phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự ADNr cần được tiến hành, trong đó, kết quả phân tích hình thái vẫn được coi trọng Kết quả của việc phân tích trình tự ADNr chỉ là làm sáng tỏ, rõ nét thêm cho việc phân tích hình thái Sau đây là sơ đồ các bước trong phân loại và khẳng định đến loài của một chủng vi nấm (hình 1.15):

Hình 1.15 Sơ đồ các bước tiến hành phân loại 1 chủng vi nấm

1.4.2 Phân loại một bậc phân loại nấm mới

Từ các bước phân loại 1 chủng nấm như đã trình bày ở trên, có một số trường hợp xảy ra:

i) Kết quả phân loại hình thái trùng với kết quả phân tích trình tự gen, khi đó

có thể kết luận đến loài

Chủng phân lập

Nuôi cấy trên môi trường dùng để phân loại

Quan sát các đặc điểm hình thái điển hình:

- Đặc điểm quan sát bằng mắt thường

- Đặc điểm quan sát dưới kính hiển vi:

Cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử; bào tử,

- Các phương thức hình thành bào tử

- Thời gian: 7-14 ngày hoặc 1-3 tháng

(đối với loài phát triển chậm)

Phân tích cây chủng loại phát sinh

Định tên đến loài

Độ tương đồng lớn hơn 98%

Độ tương đồng nhỏ hơn 98%

Kết luận

ii) Kết quả phân loại hình thái không trùng với kết quả phân tích trình tự gen, khi đó kết quả phân loại dựa vào kết quả phân tích hình thái

iii) Phân tích hình thái không có loài (chi) tương tự, thêm vào đó kết quả phân tích trình tự gen ADNr có độ tương đồng nhỏ hơn 98% Khi đó chủng nghiên cứu được nghi ngờ là một bậc phân loại mới, có thể ở mức độ lớp, bộ, họ, chi hoặc loài

Một loài được khẳng định là mới nếu chúng có hình thái khác biệt với tất cả các loài đã công bố trong chi Cũng có thể khẳng định một loài là mới khi dựa vào trình tự ADNr đoạn 18S, 28S và vùng ITS của chủng nghiên cứu, chúng có độ tương đồng thấp hơn 98% và vị trí trên cây phân loại nằm trên một nhánh khác biệt so với

các loài gần gũi [49]

Một chủng nấm được khẳng định là chi nấm mới nếu chúng có hình thái và cách phát sinh bào tử khác biệt hoàn toàn so với các chi gần gũi Chủng nghiên cứu được khẳng định là chi mới dựa vào phân tích trình tự ADNr, đặc biệt là ADNr đoạn 18S [49]

Một số trường hợp chủng nghiên cứu còn được khẳng định là lớp mới mà chỉ dựa vào quan sát hình thái: Hình thái vách tế bào sợi nấm, các cơ quan sinh bào tử, kiểu phát sinh bào tử của chủng nghiên cứu và phân tích trình tự ADNr đơn gen 18S [29] hoặc đa gen 18S, 28S, ITS, nhân tố kéo dài dịch mã 1a (EF1a) và RNA polymerase II dưới đơn vị 1 và 2 (RPB1, RPB2) [184]

1.4.3 Các nguyên lý cơ bản trong xác định danh pháp nấm (nomenclature)

Một loài (chi, lớp, bộ, họ) nấm được cho là mới phải được công bố và được chính thức công nhận bởi các nhà phân loại học, chúng thường được mô tả bằng tiếng La tinh Tuy nhiên nhiều tạp chí uy tín về nghiên cứu nấm, chẳng hạn Mycocience (Nhật), Mycology (Mĩ) đã cho phép các tác giả bỏ bước phân loại nấm bằng tiếng La tinh khi công bố một đơn vị phân loại mới từ năm 2011 Việc định danh nấm (kể cả nấm men) đều tuân theo quy tắc của Mã Quốc tế về Danh mục các Loài Thực vật (ICBN), mã này được thông qua trong từng cuộc Hội thảo Quốc tế về Thực vật Nguyên lý cơ bản đặt tên cho nấm là phải đặt tên theo tiếng La tinh và

phải chuẩn và được ưu tiên Từ năm 1753 Linnaeus đã đặt tên nấm gồm 2 phần, gồm tên chi/loài, tên tác giả chính/ đồng tác giả (tên tác giả thường viết tắt), ví dụ:

Suililus tuteus (L.) Greg [49]

Mỗi bậc phân loại phải được chuẩn hóa (typified) nhờ một loạt các bậc phân loại thấp hơn, ví dụ: một họ được chuẩn hóa bằng 1 chi, một chi được chuẩn hóa bằng 1 loài, một loài chuẩn được lưu giữ bằng một tiêu bản trong một Bảo tàng giống chuẩn Herbarium, nhưng từng bậc phân loại sẽ trở lại 1 tiêu bản chuẩn Từ

1958 đã có quy định với mỗi báo cáo một loài mới phải kèm theo thông tin về tiêu bản chuẩn được lưu giữ Có một số khó khăn khi công bố loài mới hiện nay là một

số loài chuẩn đã được công bố quá lâu thường không được lưu giữ tại một bảo tàng giống chuẩn nào [49]

Bên cạnh việc đặt tên, loài nấm mới đó phải được kí gửi vào ngân hàng nấm học Mycobank Đây là một hệ thống lưu trữ điện tử cho một taxon mới, gồm 3 yếu

tố chính: i) lưu trữ (deposit) một tên mới; ii) Mô tả đầy đủ và khoa học về đơn vị phân loại đó; iii) thêm các thông tin khoa học về đơn vị phân loại đó (nếu cần) [49]

1.5NẤM TỒN TẠI TRÊN XÁC THỰC VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CHÚNG

1.5.1 Các dạng sinh thái của nấm

Dựa vào các hệ sinh thái của nấm mà nấm được chia ra làm các nhóm:

- Nấm nội sinh (endophyte): Nấm sống trong mô thực vật mà không gây bệnh

cho thực vật, một số loài nấm sống và tạo khuẩn lạc bên ngoài mô thực vật gọi là nấm ngoại sinh (epiphyte) [138]

- Nấm gây bệnh thực vật: Nấm sống trên và trong mô thực vật và gây bệnh

cho thực vật [110]

- Nấm tồn tại trong đất: thường chiếm phần lớn tỉ trọng sinh khối vi sinh vật

trong đất, nhưng số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa phân lập bằng phương pháp pha loãng thấp hơn so với vi khuẩn Đây là nhóm vi sinh vật phân hủy chính trong đất, đặc biệt là trong hệ sinh thái rừng, nhiệm vụ chính là thủy phân các thành phần xenlulo, ki tin và lignin ở lớp đất trên cùng [49]

- Nấm sinh ra từ đất và cộng sinh trong rễ: Nấm cộng sinh trong rễ là các loài

nấm đất tấn công vào vùng rễ thực vật[49]

- Nấm nước: Nấm sống trong nước hoàn toàn hoặc cần có nước ở một số giai

đoạn của chu trình sống, chúng thường có bào tử hoặc giao tử có khả năng bơi lội Một nhóm nấm sinh bào tử trần cũng được gọi là nấm hyphomycetes ưa nước, chúng cũng có thể được tìm thấy ở trên cạn, chứ không phải hoàn toàn sống dưới nước, chúng còn được gọi là nấm Ingoldian vì Ingol là tác giả đầu tiên phát hiện ra loại nấm này [82]

- Nấm tồn tại trên phân (coprophilous fungi): là đại diện cho tất cả các loài

nấm tồn tại trên phân động vật [49]

- Nấm tồn tại trên một loài nấm khác: Nấm tồn tại trên nấm tồn tại trên một

loài nấm khác như một vật kí sinh, cộng sinh hoặc hoại sinh Phân lập các loài nấm này bằng quan sát dưới kính hiển vi soi mẫu nổi và dùng kim nhọn để phân lập [49]

- Nấm diệt côn trùng: Rất nhiều loài nấm kí sinh trên côn trùng và giết chết

có trong lá cây để làm nguồn dinh dưỡng Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy lá rụng và chúng đóng góp tới 90% quá trình hô hấp của các vi sinh vật đất [91] và có thể thủy phân các hợp chất liglocellulose trong lá rụng mà các sinh vật khác khó có thể phân hủy được [47] Sợi nấm có kích thước 2-10μ, nhỏ hơn rất nhiều so với các sinh vật khác, nên trong 1g sinh khối khô nấm có thể chiếm hơn 10,000 Với số lượng lớn các sợi nấm như vậy nên các hoạt động của nấm có ảnh hưởng lớn đến thảm thực vật của hệ sinh thái rừng, chẳng hạn như sự đồng hóa và tái sử dụng các chất dinh dưỡng đất, sự chuyển hóa CO2 và tăng chất dinh dưỡng trong đất [165]

1.5.3 Các phương pháp phân lập nấm tồn tại trên xác thực vật

Người ta thường sử dụng 2 phương pháp để nghiên cứu đa dạng vi nấm tồn tại trên xác thực vật: phương pháp trực tiếp và phương pháp gián tiếp Phương pháp gián tiếp là phương pháp chỉ quan sát và phân loại các chủng nấm hình thành trên môi trường nuôi cấy khi đặt các miếng lá mục đã rửa sạch lên môi trường nuôi cấy

mà không phân lập từng khuẩn lạc riêng lẻ [37] Phương pháp trực tiếp là phân lập nấm bằng các phương pháp khác nhau:

i) Kỹ thuật pha loãng các mảnh xác thực vật: Các mảnh xác thực vật được nghiền nhỏ và pha loãng bằng nước cất vô trùng ở các nồng độ khác nhau Sau đó được trải lên bề mặt đĩa thạch môi trường, quan sát sự hình thành khuẩn lạc và tinh sạch từng khuẩn lạc riêng rẽ để phân loại [178] Phương pháp này vẫn có hạn chế là lẫn một số chủng nấm tồn tại trong hệ sinh thái đất

ii) Kỹ thuật rửa bề mặt: Các mảnh xác thực vật sau khi được thu thập về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng và một số chất tẩy rửa (Aerosol

OT (di-iso-octyl sodium sulfosuccinate), cồn 70o, Sau đó để khô xác thực vật một cách tự nhiên, rồi đặt lên đĩa thạch môi trường, để ở nhiệt độ thích hợp, quan sát và phân lập nấm sau 5-10 ngày nuôi cấy [69]

iii) Kỹ thuật tách bào tử đơn độc: Dùng kim nhọn để tách bào tử riêng rẽ khi quan sát dưới kính hiển vi Phương pháp này sẽ phân lập được những bào tử có kích thước lớn, hình dạng đặc biệt Tuy nhiên đòi hỏi người phân lập phải có kỹ thuật tốt

và đủ kinh nghiệm để thực hiện [82]

iv) Kỹ thuật dùng buồng ẩm để kích thích bào tử nảy mầm: Xác thực vật được cắt nhỏ, kích thước 5 x 1,5cm và để vào các đĩa Peptri có đựng nước và giấy vô trùng

đủ ẩm Khuẩn lạc nấm sẽ được hình thành sau 5-10 ngày, tách riêng từng khuẩn lạc

và phân loại chúng Phương pháp này sẽ phân lập được nấm tồn tại trên xác thực vật, tuy nhiên người phân lập cũng cần phải có kinh nghiệm và kỹ thuật tốt