Cơ chế
- Trong nghiên cứu này, syringaldazine (SGZ) được dùng àm cơ chất, cơ chế của phản ứng như sau: Laccaza xúc tác, oxi hóa, làm mất đi một điện tử của cơ chất, tạo thành sản phẩm là một gốc tự do. Tiếp sau đó sản phẩm tạo thành lại bị oxi hóa làm thêm 1 điện, kết quả là làm cho SGZ đã bị mất vòng thơm và tạo thành quinon có màu tím đậm, bắt màu ở bước sóng 525nm [169].
Hình 2.3 Phản ứng đặc hiệu của enzyme laccaza với syringaldizine là cơ chất [169].
Các bước tiến hành
Enzyme laccaza: Nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LBM theo phương pháp phần 2.1.3.2, sau 24-27 ngày, dùng ống nhựa vô trùng đường kính 0,5cm, tạo giếng trên bề mặt khuẩn lạc. Hoạt tính laccaza được nhận biết trên đĩa bằng cách nhỏ 0.1 ml dung dịch syringaldazin (SGZ) 0.01% vào giếng vừa tạo. Phản ứng âm tính: Không thay đổi màu phản ứng. Phản ứng dương tính: xuất hiện màu hồng.
Enzyme MnP và LiP: tương tự như sàng lọc laccaza, tuy nhiên có sự khác ở
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 SỰĐA DẠNG CỦA VI NẤM VỀ SỐ LƯỢNG CHỦNG NẤM
Từ 57 mẫu lá thu thập được từ 4 Rừng Quốc gia ở các vùng miền khác nhau (Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc), chúng tôi đã phân lập được 717 chủng nấm bằng phương pháp rửa bề mặt, trong đó 164 chủng đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo; 324 chủng vi nấm được quan sát bằng phương pháp phân lập bào tử đơn
độc, 79 chủng có khả năng nảy mầm được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo (Bảng 3.1). Như vậy, từ tổng số 57 mẫu lá rụng nêu trên, 1041 chủng nấm đã được quan sát và phân lập, nhưng chỉ có 243 chủng được lựa chọn là đại diện cho đa dạng sinh học của 4 khu vực nghiên cứu. Tiêu chí cho sự lựa chọn dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc. Danh sách những chủng nấm lựa chọn được trình bày trong phụ lục 1, 2, 3, 4. Những chủng nấm được lựa chọn này sẽđược nghiên cứu sâu hơn dựa trên sự quan sát hình thái (hình thái khuẩn lạc, hình thái cơ quan sinh bào tử và sự hình thành bào tử) cũng như phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2.
Bảng 3.1 Số lượng nấm phân lập từ các mẫu lá rụng thu thập từ 4 RQG của Việt Nam
Địa điểm phân lập Số lượng mẫu phân lập Số chủng được lựa chọn/ số chủng được phân lập Tổng số chủng phân lập Trung bình số chủng/ 1 mẫu Phương pháp rửa bề mặt Phương pháp tách bào tử đơn độc Vuờn Quốc gia Ba Bể 17 47/ 172 14/ 101 61/273 3,58 Vuờn Quốc gia Bạch Mã 15 44/ 60 25/ 49 69/109 4,60 Vuờn Quốc gia Mã Đà 11 46/ 315 12/ 53 58/368 5,27 Vuờn Quốc gia Phú Quốc 14 27/ 170 28/ 121 55/291 4,00 Tống số 57 164/ 717 79/ 324 243/1041 4,26
Kết quả phân loại sơ bộ khu hệ vi nấm ở 4 địa điểm nghiên cứu khác nhau cho thấy mức độđa dạng vi nấm ở mỗi địa điểm là khác nhau: RQG Cát Bà trung bình có 3,58 (61/17) chủng có hình thái tương đối khác nhau phân lập được trên 1 mẫu; RQG Bạch Mã có 4,6 (69/15); rừng Quốc gia Mã Đà có 5,27 (58/11) và RQG Phú Quốc có 4 (56/ 14) chủng vi nấm phân lập được trên một mẫu. Các con số này cho
thấy đa dạng vi nấm ở RQG Mã Đà cao nhất có 5,27 chủng nấm Hyphomycetes phân lập được/ mẫu.
3.2 KẾT QUẢ VỀ ĐA DẠNG VI NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP
ĐƯỢC Ở 4 VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU Ở VIỆT NAM
Từ 243 chủng nấm phân lập được từ 4 địa điểm là 4 rừng Quốc gia tại Việt Nam, chúng tôi đã phân loại dựa vào quan sát hình thái và phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2, sau đó dùng trình tự này dùng để tiến hành so sánh với các loài gần gũi trong ngân hàng genbank thế giới bằng chương trình Blast Search [49]. Các chủng này được phân loại đến chi và tiếp tục được kiểm tra các thứ bậc phân loại cao hơn: lớp, bộ, họ
trên dữ liệu của CABI và Mycobank (http://www.indexfungorum.org), 243 chủng nấm này được sắp xếp chúng vào 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi, 176 Loài (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Tổng kết về kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm ở Việt Nam
STT Địphân la điểậm p Số mẫu * Số lớp Số bộ Số họ Số chi Số loài
1 RQG Ba Bể 17 61/173 4 5 6 21 35
2 RQG Bạch Mã 15 69/109 5 8 13 34 53
3 RQG Mã Đà 11 58/368 5 9 16 36 55
4 RQG Phú Quốc 14 55/291 4 11 15 34 46
Tổng 57 243/1041 5 13 26 79 176
Ghi chú: *- Số chủng nấm nghiên cứu/ số chủng phân lập được
Ở mức độ phân loại đến Lớp, một Lớp Nấm được nghi ngờ là mới đã được phát hiện tại Phú Quốc, tuy nhiên để khẳng định chắc chắn cần có những nghiên cứu sâu hơn. Ở mức độ Bộ, đa dạng sinh học vi nấm phân lập được ở các vùng miền khác nhau đã thể hiện ở các mức độ khác nhau, đa dạng vi nấm tăng dần từ Ba Bể,
đến Bạch Mã, rồi đến Mã Đà và Phú Quốc với số lượng lần lượt là: 5,8, 9 và 11 bộ
(Bảng 3.2).
Nghiên cứu đa dạng vi nấm ở mức độ chi, loài của 243 chủng nấm được lựa chọn làm đại diện cho đa dạng sinh học nhóm vi nấm Hyphomycetes ở 4 khu vực nghiên cứu. Các chủng này được phân loại dựa vào quan sát hình thái khuẩn lạc và cơ quan sinh bào tử cũng như so sánh độ tương đồng về trình tự ADNr 28S đoạn
D1D2 của chúng với các loài gần gũi trong ngân hàng gen vi sinh vật NCBI. Kết quả, chúng được phân vào 79 chi và 176 loài. Trong đó 94 loài có trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 có độ tương đồng thấp (80-98%) so với loài gần gũi, các loài này sẽđược tập trung nghiên cứu khả năng là các taxon mới (phần 3.3).
3.2.1 Sựđa dạng vi nấm phân lập được ở Rừng Quốc gia Ba Bể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ 17 mẫu lá rụng thu thập được trong RQG Ba Bể, đã phân lập được 273 chủng nấm. Các chủng này được nuôi cấy trên môi trường nghèo các bon LCA, ở
25oC, trong 7 ngày, sau đó các chủng này được đem ra quan sát các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và các cơ quan sinh bào tử dưới kính hiển vi, tiến hành loại bỏ
những chủng có hình dạng trùng nhau trên một mẫu. Từđó chúng tôi đã chọn ra 62 chủng để phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2. Kết quả cho thấy, chúng được chia vào 4 Lớp, 5Bộ, 6Họ, 21 Chi và 35Loài (Bảng 3.3). Trong đó, Họ Nectriaceae là họ phân lập được nhiều chi nhất, gồm 7 chi (Cylindrocarpon, Cylindrocladiella,
Cylindrocladium, Fusarium, Gliocephalotrichum, Gliocladiopsis, Gliocladium).
Các họ khác chỉ phân lập được 1-2 chi.
Chi Trichoderma (thuộc lớpSordariomycetes, họ Hypocreaceae) có nhiều loài nhất, gồm 6 loài là T. atroviride, T. brevicompactum, T. harzianum, T. helicum T.
reesei và Trichoderma sp.; chi Aspergillus (lớp Eurotiomycetes, họ Trichocomaceae)
có 4 loài: A. japonicas, A. niger, A. oryzae, A. versicolor.
Trong số 35 loài phát hiện được ở RQG Ba Bể, có 13 loài có độ tương đồng về
trình tự ADNr đoạn 28S < 98%, đó là các loài: Articulospora sp.,Cylindrocarpon sp.,
Cylindrocladiella sp., Cylindrocladium sp., Gliocephalotrichum sp., Gliocladiopsis sp.,
Gliocladium sp., Humicola sp., Trichoderma sp., Triramulispora sp., Wiesneriomyces
sp., Isthmolongispora sp., Lateriramulosa sp., Speiropsis sp.Trong số 21 chi phân lập
được ở Ba Bể có 6 chi in đậm (màu đỏ) là những chi lần đầu tiên phân lập được tại Việt Nam, đa số các chi này được phân lập bằng phương pháp tách bào tửđơn độc (những loài đánh dấu * trong bảng 3.3). Đây là các đại diện mới lần đầu tiên được phát hiện ở
Bảng 3.3 Sựđa dạng của vi nấm Hyphomycetes phân lập ở Rừng Quốc gia Ba Bể
Tên lớp Tên bộ Tên họ Tên chi a) b) H' Cd Tên loài c)
Orbiliomycetes Orbiliales Orbiliaceae Arthrobotrys 1 1 0,067 0,0003 A. javanica 5,9
Eurotiomycetes Eurotiales Trichocoma-ceae Aspergillus 12 4 0,426 0,0062
A. japonicus 23,5
A. niger 11,8
A. oryzae 5,9
A. versicolor 5,9
Penicillium 1 1 0,067 0,0003 P. oxalicum 5,9 Dothideomycetes Pleosporales Pleosporaceae Curvularia 1 1 0,067 00003 C. lunatus 5,9
Chaetospha- eriales
Chaetos-
phaeriaceae Chloridium 1 1 0,067 0,0003 C. virescens 5,9
Sordariomycete Hypocreales Nectriaceae Cylindrocarpon 1 1 0,067 0,0003 Cylindrocarpon sp. 5,9 Cylindrocladiella 2 2 0,135 0,0006 Cylindrocladiella sp. 5,9 C. viticola 5,9 Cylindrocladium 1 1 0,067 0,0003 Cylindrocladium sp. 5,9 Fusarium 16 3 0,582 0,0306 F. equiseti 47,2 F. oxysporum 5.9 F. solani 41,3 Gliocephalo- trichum 1 1 0,067 0,0003 Gliocephalotrichum sp. 5,9 Gliocladiopsis 1 1 0,067 0,0003 Gliocladiopsis sp. 5,9 Gliocladium 1 1 0,067 0,0003 Gliocladium sp. 5,9 Hypocreaceae Trichodermas 7 6 0,449 0,0027 T. atroviride 5,9 T. brevicompactum 5,9 T. harzianum 11,8 T.helicum 5,9 T. reesei 5,9 Trichoderma sp. 5,9
Không xác định Không xác định Không xác định
Humicola 1 1 0,067 0,0003 Humicola sp. 5,9 Triramulispora 1 1 0,067 0,0003 Triramulispora sp.* 5,9 Wiesneriomyces 2 2 0,135 0,0006 Wiesneriomyces sp.1* 5,9 W. javanicus* 5,9
Isthmolongispora 4 2 0,216 0,0027 I. ampulliformis* Isthmolongispora 17,7 sp.* 5,9 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lateriramulosa 2 2 0,135 0,0005 L. ainflata * 5,9
Lateriramulosa sp.* 5,9
Radiatispora 4 1 0,205 0,0043 Radiatispora yunnaensis* 23,6
Speiropsis 1 1 0,067 0,0003 Speiropsis sp.* 5,9
Articulospora 1 1 0,067 0,0003 Articulosporasp.* 5,9
Tổng: 4 lớp 5 bộ 6 họ 21 chi 61 35 3,154 0,0521 35 loài
Ghi chú: dấu *- loài phân lập bằng phương pháp tách bào tử đơn độc; a) Số chủng; b) số loài; c) Tần suất xuất hiện; H': Chỉ số Shannon; Cd: Chỉ số Simpson.
Trong số 21 chi nấm phân lập có 14 chi là đơn loài, số còn lại là các chi đa loài. Các chi đơn loài có chỉ sốđa dạng sinh học, chỉ số mức độ chiếm ưu thế và % tần suất xuất hiện (TSXH) thấp (H'= 0,067; Cd= 0,0003 và TSXH = 5,9%).
Trong số 7 chi đa loài, Trichoderma có số lượng loài cao nhất- 6 loài nhưng các chỉ sốđa dạng sinh học (H'= 0,449; Cd= 0,0027 và TSXH= 41,2%) thấp hơn so với chi Fusarium- chicó 3 loài nhưng các chỉ số đa dạng sinh học cao nhất (H'= 0,582; Cd= 0,0310 và TSXH= 91%).
Aspergillus là chi có 4 loài/12 chủng có chỉ sốđa dạng sinh học H' thấp hơn 2 chi trên (H'= 0,426) nhưng chỉ số về mức độ chiếm ưu thế và TSXH cao hơn chi
Trichoderma (Cd=0,0062 và TSXH= 70,6).
Loài có tần xuất bắt gặp cao nhất trong số 35 loài phân lập được là loài
Fusarium solani (47,2%), Fusarium equiseti (41,3%), rồi đến các loài Aspergillus
oryzae (29,4%), Aspergillus japonicus và Radiatispora yunnaensis (23,5%) những
loài còn lại đều có tần suất bắt gặp £20%.
3.2.2 Sựđa dạng vi nấm phân lập được ở rừng Quốc gia Bạch Mã
Từ 15 mẫu lá cây rụng (Bảng 2.1), tổng số 109 chủng nấm đã được phân lập. Dựa vào quan sát hình thái khuẩn lạc, chúng tôi đã loại bỏ những chủng nấm có đặc
điểm hình thái trùng nhau trên một mẫu. Từ đó chúng tôi đã chọn được 69 chủng nấm để nghiên cứu. Các chủng nấm này được quan sát dưới kính hiển vi các cấu trúc sinh bào tử của chúng và phân tích, so sánh trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 của chủng với các loài đã công bố trên ngân hàng gen (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả
cho thấy: 69 chủng nấm này được xếp vào 5 Lớp, 8Bộ, 13 Họ, 34 Chi và 53 Loài (Bảng 3.4). Trong đó, Lớp Sordariomycetes có nhiều chi nhất- 12 chi (Arthrinium, Beltraniella, Chloridium, Clonostachys, Colletotrichum, Cylindrocladiella,
Fusarium, Myrothecium, Pestalotiopsis, Ramichloridium, Trichoderma,
Tricladiella).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã thu được 14 chi, loài nấm lần đầu tiên phân lập được ở Việt Nam (chi, loài được in chữđỏ đậm trên bảng 3.4). Các chi này hầu hết được phân lập bằng phương pháp tách bào tửđơn độc.
Bảng 3.4 Đa dạng sinh học vi nấm Hyphomycetes trong rừng Quốc gia Bạch Mã
Lớp(cetes) Bộ (ales) Tên họ (aceae) Tên chi a) b) H' Cd Tên loài c)
Dothideomycetes
Pleosporales Pleosporaceae Curvularia 3 2 0,164 0,0010
C. senegalensis 6,7
C. eragrostidis 13,3
Drechslera 1 1 0,061 0,0002 Drechslera sp. 6,7 Capnodiales Mycosphara-laceae Ramichloridium 1 1 0,061 0,0002 Ramichloridium sp. 6,7 Eurotiomycetes Eurotiales Trichocoma-ceae Penicillium 2 2 0,123 0,0004 P. minioluteum 6,7
P. herquei 6,7 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Leotiomycetes Helotiales Helotiaceae
Idriella 2 2 0,123 0,004 Idriella sp1. 6,7
Idriella sp2. 6,7
Varicosporium 3 1 0,136 0,0019 V. lamdasepta 20 Không xác định Dactylaria 2 1 0,103 0,0008 Dactylaria sp. 13,3 Orbiliomycetes Orbiliales Orbiliaceae Arthrobotrys 2 2 0,122 0,0004 Arthrobotrys sp1. 6,7
Arthrobotrys sp2. 6,7
Sordariomycetes
Chaetospha-
eriales Chaetosphae-riaceae Chloridium 4 3 0,206 0,0016
Chloridium spp. 13,3 C. virescens 13,3 Hypocreales Bionectriaceae Clonostachys 4 4 0,245 0,0008 C.rosea 6,7 Clonostachys sp1. 6,7 Clonostachys sp2. 6,7 Clonostachys sp3. 6,7 Nectriaceae Fusarium 2 2 0,122 0,0004 Fusarium sp1. 6,7 Fusarium sp2. 6,7 Cylindrocladiella 1 1 0,061 0,0002 Cylindrocladiella sp. 6,7 Hypocreaceae Trichoderma 5 4 0,287 0,0015 Trichoderma sp. 6,7 T. reesei 13,3 T. atroviride 6,7 T. koningiopsis 6,7 Tricladiella 1 1 0,061 0,0002 Tricladiella sp.* 6,7 Không xác định Myrothecium 1 1 0,061 0,0002 Myrothecium sp. 6,7 Xylariales
Hyponec-
triaceae Beltraniella 3 1 0,136 0,0019 Beltraniella spp. 20 Amphisphae-
riaceae Pestalotiopsis 1 1 0,061 0,0002 P. photiniae 6,7 Không xác
định
Apiosporaceae Arthrinium 2 1 0,103 0,0002 A. sacchari 13,3 Glomerellaceae Colletotrichum 2 2 0,122 0,0004 C. acutatum 6,7
C. gloeosporioides 6,7
Không xác định Không xác định
Arborispora 1 1 0,061 0,0002 Arborispora sp.* 6,7
Ceratosporella 3 1 0,136 0,0019 C. lamdasepta* 20
Chalara 2 1 0,103 0,0008 Chalara sp.* 13,3
Condylospora 1 1 0,061 0,0002 C. vietnamenensis nov.* sp. 6,7
Isthmolongispora 7 5 0,348 0,0017 I. ampulliformis* 6,7 I. intermedia* 6,7 Isthmolongispora sp1.* 6,7 Isthmolongispora sp2.* 13.3 Isthmolongispora 6,7
Lớp(cetes) Bộ (ales) Tên họ (aceae) Tên chi a) b) H' Cd Tên loài c)
Parasympodiella 1 1 0,061 0,0002 P. eucalypti* 6,7
Polylobatispora 5 2 0,226 0,0036 P. ambigua sp. nov.* 6,7
P. quinquecornata* 26,6 Scolecobasidium 1 1 0,061 0,0002 S. tricladiatum* 6,7 Geminoarcus 1 1 0,061 0,0002 Geminoarcus sp. 6,7 Articulospora 1 1 0,061 0,0002 Articulospora sp. 6,7 Ordus 1 1 0,061 0,0002 Ordus sp. 6,7 Tetraploa 1 1 0,061 0,0002 Tetraploa sp.* 6,7 Triglyphium 1 1 0,061 0,0002 T. alabamense* 6,7 Triramulispora 1 1 0,061 0,0002 Triramulispora sp.* 6,7 Tritirachium 1 1 0,061 0,0002 Tritirachium sp.* 6,7 Tổng : 5 lớp 8 bộ 13 họ 34 chi 69 53 3,842 0,0267 53 loài
Ghi chú: dấu *- loài phân lập bằng phương pháp tách bào tử đơn độc; a) Số chủng; b) số loài; c) Tần suất xuất hiện; H': Chỉ số Shannon; Cd: Chỉ số Simpson.
Trong số 34 chi nấm phân lập có 23 chi là đơn loài, số còn lại là các chi đa loài. Các chi đơn loài có chỉ sốđa dạng sinh học, chỉ số mức độ chiếm ưu thế cũng như TSXH thấp (H'= 0,061; Cd= 0,002 và TSXH = 6,7 %).
Trong số 11 chi đa loài, Isthmolongispora có số lượng loài và các chỉ số đa dạng sinh học cao nhất (5 loài; H'= 0,348; Cd= 0,0017 và TSXH= 46,7%).
Tiếp đến là chi Trichoderma- chicó 4 loài với các chỉ sốđa dạng sinh học (H'= 0,287; Cd= 0,0015 và TSXH= 33,3%).
Clonostachys cũng có 4 loài nhưng các chỉ số đa dạng sinh học thấp hơn (H'= 0,245; Cd= 0,0008 và TSXH= 26,7%). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chi Polylobatispora có TSXH cao (33,3%), nhưng là chi chỉ có 2 loài với chỉ
sốđa dạng sinh học H' và chỉ số chiếm ưu thế Cd tương ứng là 0,226 và 0,0035. Loài có tần xuất bắt gặp cao nhất trong số 53 loài phân lập được là loài
Polylobatispora quinquecornata (26,7%), những loài còn lại đều có tần xuất bắt gặp £20%.
Trong số 53 loài vi nấm phân lập được ở RQG Bạch Mã (Bảng 3.4), chúng tôi
đã phát hiện và phân loại 2 loài mới:Condylospora vietnamensis sp. nov và
Polylobatispora ambigua sp. nov. Kết quả nghiên cứu về loài mới này được trình
bày chi tiết và cụ thể trong mục 3.3.2.1 và 3.3.2.2 Đặc biệtLoài Condylospora
vietnamensis sp. nov đã được chúng tôi công công bố trên Mycoscience[số 53,
3.2.3 Sựđa dạng vi nấm phân lập được ở Mã Đà
Từ 11 mẫu lá cây rụng RQG Mã Đà (Bảng 2.2), tổng số 368 chủng nấm đã
được phân lập, dựa vào quan sát hình thái khuẩn lạc, chúng tôi đã loại bỏ những chủng nấm có đặc điểm hình thái trùng nhau trên 1 mẫu. Từ quá trình sàng lọc, 58 chủng nấm đã được lựa chọn và được quan sát dưới kính hiển vi các cấu trúc sinh bào tử của chúng và so sánh trình tự ADNr 28S đoạn D1D2, các chủng nấm này đã
được xếp vào 5 Lớp, 9 Bộ, 16 Họ, 36 Chi, 55 Loài (Bảng 3.5).
Trong số 5 lớp nấm phát hiện được ở Mã Đà, Lớp Sordariomycetes là lớp có sự đa dạng nhất: gồm 5 bộ, 9 họ và 16 chi (chiếm 1/2 sựđa dạng tổng thể của khu hệ nấm RQG Mã Đà). Trong khi đó, Lớp Leotiomycetes và Lớp Orbiliomycetes là 2 lớp có sựđa dạng về thành phần bộ, họ, chi loài nghèo nhất so với các lớp còn lại, chỉ gồm 1 bộ, 1 họ, 1-2 chi, loài.
Khác với đa dạng vi nấm phân lập được ở Bạch Mã, các loài nấm ở Mã Đà chủ yếu phân lập được bằng phương pháp rửa bề mặt, rất ít loài được phân lập bằng