Trong nghiên cứu đa dạng vi nấm phân lập từ lá rụng Rừng Quốc gia Phú Quốc, hai chủng nấm đã được phân lập bằng phương pháp tách bào tửđơn độc (như
mô tảở phần phương pháp). Chúng tôi đã thu được 2 chủng nấm kí hiệu là VN11- F0004 và VN11-F0025 có bào tử dạng kim thuôn dài, cong phần đỉnh, khi xác định trên cây chủng loại phát sinh dựa vào trình tự ADNr 18S và 28S đoạn D1D2, kết quả cho thấy 2 chủng này nằm trên 1 nhánh riêng biệt, tách hẳn với các lớp nấm đã biết, vì vậy chúng được nghi ngờ là lớp nấm mới. Tuy nhiên để khẳng định chúng có thuộc lớp nấm mới hay không thì cần có vài nghiên cứu về xác định hình thái cấu trúc vách tế bào của chúng, nên trong nghiên cứu này chúng được công bố như
là một chi mới.
v Nghiên cứu hình hạng bào tử và sự phát sinh bào tử
Sợi nấm có vách ngăn rõ ràng, kích thước sợi nấm nhỏ 0,5-1,5 μm. Tại một số điểm trên sợi nấm trưởng thành, hình thành cụm cuống sinh bào tử, đôi khi cuống sinh bào tử không khác biệt nhiều so với sợi nấm. Tế bào sinh bào tửđược sinh ra trên cuống sinh bào tử, nằm về 2 phía của cuống sinh bào tử, hình răng cưa. Trên một cuống sinh bào tử có rất nhiều tế bào sinh bào tử, bào tử gồm 2- 3 tế bào, có vách ngăn rõ rệt (Hình 3.4, 3.5).
Bào tử của 2 chủng này có nét tương đồng với một số chi như: Condylospora
sp., Angulospora sp.,.. vì Condylospora sp. cũng có bào tử hình trụ, có vách ngăn, và gấp khúc 1-3 lần, VN11-F0004 và VN11-F0025 cũng có hình trụ và gấp khúc một lần phần đỉnh. Angulospora sp. cũng có tế bào hình trụ, kéo dài có vách ngăn và cong phần đỉnh, tuy nhiên bào tử của Angulospora sp. có màu nâu nhạt, trong khi bào tử của VN11-F0004 và VN11-F0025 không màu.
Hình 3.5 Sự phát sinh bào tử của chủng VN11-F0025 quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét.
a. Tế bào đầu tiên hình thành, b. Tế bào thứ 2 bắt đầu hình thành,
v Phân tích trình tự ADNr 28S (đoạn D1D2)
Kết quả Blast search khi phân tích trình tự ADNr 28S (đoạn D1D2)cho thấy, một số loài gần gũi nhất đối với chúng làMicrobotryum bistortarum, Microbotryum
scabiosae, Microbotryum tenuisporum (loài nấm gây bệnh nấm than đen) và
Rhodotorula lamellibrachiae một loài nấm men, những loài này đều là giai đoạn vô
tính của ngành phụ nấm đảm Pucciniomycotina (Bảng 3.12).
Câu hỏi đặt ra là, 2 chủng (VN11-F0004 và VN11-F0025) thuộc nhóm nấm túi hay nấm đảm? Để trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành quan sát số lượng nhân nắm trong một tế bào của bào tử nấm. Nếu chủng nghiên cứu có 2 nhân trong một tế
bào thì chúng thuộc về ngành Basidiomycota, nếu chỉ có một nhân trong một tế bào thì chúng thuộc về ngành Ascomycota [156].
Bảng 3.12 Kết quả phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 của chủng VN11-F0004 dựa vào phần mềm Blastsearch
v Phát hiện số nhân trong một tế bào của bào tử chủng VN11-F0004 và VN11- F0025
Việc phát hiện số nhân trong một tế bào nấm được thực hiện như sau: Nấm
được nuôi cấy trên môi trường phân loại LCA, sau 2-3 tuần nuôi cấy, bào tử bắt đầu hình thành. Cắt một miếng thạch có chứa bào tử nấm, đặt vào dung dịch DAIP trong một phút, đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhân tế bào bắt màu với DAIP tạo ánh sáng phản quang khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 3.6).
Hình 3.6 cho thấy cả 2 chủng nấm đang nghiên cứu này đều có 2 nhân trên một tế bào, VN11-F0004 có 2 tế bào/ bào tử; VN11-F0025 có 3 tế bào/ bào tử, vì vậy chúng tôi khẳng định 2 chủng nấm này thuộc nấm đảm Basidiomycota.
vNghiên cứu so sánh hình thái VN11-F0004 và VN11-F0025 với các loài
gần gũi
Ngành phụ Pucciniomycotina gồm 8 lớp: Microbotryomycetes,
Cystobasidiomycetes, Agaricostilbomycetes, Myxomycetes, Pucciniomycetes, Atractiellomycetes, Classiculomycetes, Cryptomycocolacomycetes [101]; Trong số 9 lớp trên, 3 lớp (Pucciniomycetes, Atractiellomycetes, Classiculomycetes, Cryptomycocolacomycetes) không có giai đoạn sinh sản vô tính là nấm men, còn lại chúng đều có giai đoạn vô tính là nấm men. Lớp Cryptomycocolacomycetes và Atractiellomycetes sinh bào tửđảm trên thể quả (Hình 3.7 A,B) [128].
Hình 3.6 Quan sát số lượng nhân trong một tế bào của bào tử nấm
Lớp Classiculomycetes chỉ có duy nhất một họ (Classiculales) 2 loài được phát hiện là: Classicula fluitans (giai đoạn vô tính là Naiadella fluitans) [111]và
Jaculispora submerse (giai đoạn hữu tính chưa biết) [77]. Classicula fluitans được
phân lập từ lá rụng ngập nước, là những chủng tự kí sinh trên môi trường nuôi cấy,
điều này chứng tỏ đây là nhóm nấm kí sinh [29]. Trong khi đó, J. submerse là nấm kí sinh trên lá cây sồi [140].
Lớp Myxomycetescũng ch
osmundae, thường kí sinh trên phân. Chi
chúng chúng được xếp lớp n [95]. Sau đó, Kramer lại ti Mixiaceae (Protomycetales
Mixiales. Tuy nhiên, sau nghiên c
tích cây phát sinh chủng loạ
ngành nấm đảm Basidiomycota(Pucciniomycotina, Mixiomycetes, Mixiomyceae,
Mixuales, Mixiales osmundae
hình thức nảy chồi ngoại sinh và đ
Lớp Classiculomycetes có sinh bào tử trần, lớp này có 2 chi, đ
Classicula fluitans) (Hình 3.7 C), c
môi trường nước [29; 80].
Hình 3.7 Đại diện các l
ũng chỉ có một họ, một chi và một loài ng kí sinh trên phân. Chi Mixualesđược Kramer công b
p nấm túi (Protomycetaceae, Taphrinales, Ascomycetes) i tiếp tục công bố chuyển chi Mixiales sang m
Mixiaceae (Protomycetales) riêng biệt, họ này cũng chỉ có một chi duy nh Tuy nhiên, sau nghiên cứu của Nishida và cộng sự [1995] d
ại trình tự ADNr 18S, và Mixiales đã được chuy
m Basidiomycota(Pucciniomycotina, Mixiomycetes, Mixiomyceae,
Mixuales, Mixiales osmundae)[127]. Mixiales osmundae là nấm men, sinh s
i sinh và đồng thời từ các tế bào sinh bào tử(sporogenous p Classiculomycetes có giai đoạn sinh bào tử trần, bào tử sinh ra t
p này có 2 chi, đồng thời cũng là 2 loài (Jacullispora submersa,
(Hình 3.7 C), cả 2 loài này đếu được phân lập từ
n các lớp sinh bào tử trần trong ngành phụ Pucciniomycotina
t loài Mixiales
c Kramer công bố năm 1958, m túi (Protomycetaceae, Taphrinales, Ascomycetes) sang một họ mới- t chi duy nhất là [1995] dựa vào phân c chuyển sang m Basidiomycota(Pucciniomycotina, Mixiomycetes, Mixiomyceae,
m men, sinh sản theo sporogenous).
sinh ra từ cuống
Jacullispora submersa,
lá rụng trong
Về vị trí phân loại, cũng như về môi trường sống của 2 loài này dường như có sự gần gũi, tương thích với 2 chủng nấm đang nghiên cứu của chúng tôi. Nhưng về
hình dạng bào tử cũng như cách hình thành và sinh trưởng bào tử của chúng khác nhau hoàn toàn: Cuống sinh bào tử của 2 loài này có vách ngăn, phân nhánh và rất rõ ràng, trong khi cuống sinh bào tử của VN11-F0004 và VN11-F0025 không khác biệt so với sợi nấm. Bào tử của Classicula fluitans và Jaculispora submersa dạng staurospore (nhiều nhánh, nhiều cành) trong khi bào tử của VN11-F0004 và VN11- F0025 đơn giản, hình kim kéo dài, thon nhọn ởđỉnh.
Ngành phụ Pucciniomycotina ngoài 8 lớp được Kurtzman và cộng sự 2011 báo cáo như ở trên còn có một lớp mới - Tritirachiomycetes, lớp này có giai đoạn sinh sản vô tính là bào tử trần (chi Tritirachium) trước đây được cho là thuộc nấm Túi nay được Wiley và cộng sự chuyển sang nấm Đảm (2011) (Hình 3.7 D) [184]. Chi Tritirachium là chi thường hay gặp trong đất, sợi nấm có vách ngăn điển hình, có cuống sinh bào tử trần sinh ra từ sợi nấm và phân nhánh nhiều lần; tế bào sinh bào tử trần hình thành theo sự phát triển của cuống sinh bào tử, tạo thành những vết sẹo hình răng cưa ở phần đỉnh cuống sinh bào tử trần, tại các điểm tế bào sinh bào tử trần, bào tử trần được sinh ra, có một tế bào, dạng hình cầu, nhẵn [184]. Trước
đây có công bố chuyển Tritirachiomycetes sang ngành nấm Đảm của Wiley và cộng sự, người ta luôn cho rằng lớp chúng thuộc nhóm nấm Túi Ascomycetes, mặc dù nghiên cứu về lớp này được bắt đầu từ năm 1940 [103]. VN11-F0004 và VN11- F0025 cũng có một số nét tương đồng với Tritirachium ở chỗ: Sợi nấm có vách ngăn, bào tửđược sinh ra từ cuống sinh bào tử và tế bào sinh bào tử trần, tuy nhiên hình dạng, cấu trúc bào tử của VN11-F0004 và VN11-F0025 khác xa so với chi
Tritirachium.
vXây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự ADNr 18S của 2 chủng
nấm nghiên cứu
Pucciniomycotina gồm các chủng nấm hoại sinh giả định (pultative saprotroph), và kí sinh trên động, thực vật và nấm. Khoảng 90%Pucciniomycotina thuộc về nấm gây bệnh thực vật bắt buộc- họ Pucciniales (Uredinales), hay còn gọi là họ nấm gỉ.
Năm 2006 Aime và cộng sự đã tập hợp tất cả các số liệu đã nghiên cứu trình tự gen ADNr 18S và 28S của nhóm nấm gỉ này để tìm hiểu về mối quan hệ chủng loại phát sinh của dưới ngành nấm đảm này.
Hình 3.8 Vị trí phân loại của 2 chủng VN11-F0004 và VN11-F0025 dựa vào phân tích trình tự ADNr đoạn 18S
Tiếp đó năm 2011 Kurtzman và cộng sự cũng xây dựng cây phát sinh chủng loại của ngành này, kết quả cho thấy chúng có 8 lớp, thuộc 8 nhánh trong cây chủng loại riêng lẻ, đó là các lớp Agaricostilbomycetes, Atractiellomycetes, Classiculomycetes, Cryptomycocolacomycetes, Cystobasidiomycetes, Microbotryomycetes, Mixiomycetes và Pucciniomycetes [1;101]. Kế thừa các nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã lựa chọn các đại diện của 8 lớp trên để so sánh và dựng cây phân loại theo phương pháp
neighbor-joining tree của Kurtzman và cộng sự [2011]. Kết quả cho thấy VN11- Pucciniomycetes Atractiellomycetes Cystobasidiomycetes Classiculomycetes Mixiomycetes Microbotryomycetes Agaricostilbomycetes Tritirachiomycetes Bannoa|AB035894|JCM10333
BannoaErythrobasidium|DQ631899MP3490(DNA526)|D12803IAM12911
Erythrobasidium|DQ663697|AFTOL-ID 1771
LycogalaCystobasidium|AY187083||AY124479|DB1489
Tritirachium|JF779647|CBS164.67
TritirachiumTritirachium|JF779655|CBS183.42|JF797225|IHEM3714
Paratritirachium|JF797220|CBS 838.71
1000
1000 AgaricostilbumAgaricostilbum|AY665775CBS 7811|AY373391|
SterigmatomycesBensingtonia|DQ092916CBS4609|D38234|JCM7445
Kurtzmanomyces|D64122JCM6906
1000
BensingtoniaKondoa|D13776|IAM13523|DQ234543|CBS7331
986 1000 1000 Mixia|-|IAM14324|AFTOL-177 Mixia|D14163|IFO32408 VN11-F0004VN11-F0025 1000
1000 ClassiculaJaculispora|AY124478|DB1259|AY124477|DB1250
LeucosporidiumMastigobasidium|AY707092CBS614|D38235JCM5291
SporidiobolusSporobolomyces|AB021672JCM5296|DQ832235AFTOL-ID 1549
LeucosporidiumMicrobotryum|DQ789983CBS438.34|DQ785788|AFTOL-ID 1550
Microbotryum|U77062|PO31A1
SphacelothecaRhodotorula|AY657013|CBS6403|DQ832220|JAG55
Sporobolomyces|D66884|JCM5653
Rhodosporidium|AB073269JCM11251
SporidiobolusRhodosporidium|EU547494|CO-3|DQ832192PYCC4416
Rhodotorula|X83827|NCYC502 Rhodotorula|EU380239|YS6-2 667 999 986 1000 806 Phleogena|NG_013195MA220505 1000 602 1000 Ustilaginomycotina 0.02Knuc Pucciniomycotina
F0004 và VN11-F0025 nằm ở một nhánh riêng biệt, 2 nhánh gần gũi nhất thuộc lớp
Classiculomycetes và Mixiomycetes (Hình 3.8).
Như vậy, qua việc phân tích hình thái cũng như cấu trúc các cơ quan sinh sản, cũng như phân tích trình tự ADNr 18S của VN11-F0004 và VN11-F0025 và các loài gần gũi đều cho thấy 2 chủng này được nghi ngờ thuộc một lớp mới trong Ngành phụ Pucciniomycotina. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ công bốđây là 1 chi mới thuộc ngành phụ Pucciniomycotina.