Thông thường có 2 phương pháp để nghiên cứu đa dạng vi nấm từ lớp lá rụng trong rừng, đó là: phương pháp trực tiếp và phương pháp gián tiếp [37]. Phương pháp trực tiếp là phân lập nấm, tinh sạch từng khuẩn lạc đơn và phân loại chúng. Phương pháp nghiên cứu gián tiếp: chỉ quan sát và phân loại các chủng nấm hình thành trên môi trường nuôi cấy khi đặt các miếng lá mục đã rửa sạch lên môi trường nuôi cấy mà không phân lập từng khuẩn lạc riêng lẻ [37]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu trực tiếp với 2 kỹ thuật phân lập: rửa bề
mặt và tách bào tử đơn độc. Kỹ thuật tách bào tử đơn độc cần phải có bộ thiết bị
Skarmen (Hình 2.2) và kinh nghiệm để tách được từng bào tử riêng rẽ từ mẫu để
chuyển vào môi trường mới thích hợp. Kỹ thuật rửa bề mặt cần phải có kính lúp để
quan sát và tách riêng từng khuẩn lạc đơn từ mẫu chuyển sang môi trường mới thích hợp. Cả 2 kỹ thuật này lần đầu tiên được ứng dụng tại Việt Nam.
Kỹ thuật rửa bề mặtcó thể phân lập nấm tồn tại trong lớp lá mục (nấm phân hủy xác thực vật) và cả lá tươi (nấm nội sinh thực vật) ở các nước khác trên thế giới [131-133; 143; 161-162]. Việc sử dụng hóa chất Aerosol OT 0,005% đã loại bỏ được hầu hết các vi sinh vật trên bề mặt lá, chỉ tồn tại các loài nấm bám sâu vào mô lá. Các loài nấm này khi gặp điều kiện thuận lợi (môi trường LCA, nhiệt độ 25- 28oC) sẽ dễ dàng này mầm và nhanh chóng phát triển thành khuẩn lạc. Vì vậy với lỹ
thuật này có thể phân lập những chủng nấm có khả năng phát triển nhanh trên môi trường nuôi cấy và có khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật cao:
Aspergillus, Trichoderma, Penicillium,... Các chi này đã được gặp ở một số các công bố khác ở Việt Nam [9, 16, 12, 188, 199]. Tuy nhiên bằng kỹ thuật này, chúng
tôi cũng đã phân lập được một số chi mới ghi nhận cho khu hệ vi nấm ở Việt Nam:
Chaetopsina, Fusicladium, Parasympodiella, Septonema, Veronaea,....
Kỹ thuật tách bào tử đơn độc: Trong 2 kỹ thuật phân lập nấm lần đầu tiên
được sử dụng ở Việt Nam thì kỹ thuật tách bào tử đơn độc là phương pháp mới chưa được công bố trong các nghiên cứu trước đây, kể cả các công bố quốc tế trong nghiên cứu đa dạng vi nấm trên môi trường cạn. Chúng thường được công bố trpng các nghiên cứu đa dạng vi nấm từ xác thực vật trong môi trường nước. Kỹ thuật này lần đầu tiên được công bố ở Anh vào năm 1942 [82], sau đó đã được ứng dụng trong rất nhiều nghiên cứu khác tại Nhật Bản [23-25; 114-119], Ấn độ [139], ... Đây là lần đầu tiên kỹ thuật này được ứng dụng ở Việt Nam, và đặc biệt là việc dùng cho các mẫu trên môi trường cạn.
Thực tế sử dụng kỹ thuật này cho thấy đây là các phương pháp phân lập rất hiệu quả để phát hiện các taxon mới. Phương pháp này đòi hỏi cao về kỹ thuật và kinh nghiệm của cán bộ nghiên cứu nhằm tách được bào tử đơn độc khỏi mẫu để
chuyển sang môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của chúng. Mặt khác, với kinh nghiệm của người nghiên cứu việc tìm và chọn các đối tượng nghiên cứu
được dựa vào hình thái, đặc điểm đặc trưng của bào tử, không có sự trùng lặp so với các phương pháp phân lập thông thường khác. Chính vì lý do đó mà khả năng phát hiện các đại diện mới của các mẫu phân tích theo phương pháp này là khá cao. Mặt khác thông qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy tính đa dạng vi nấm không chỉ
phụ thuộc vào sựđa dạng, khác biệt các điều kiện sinh thái của các khu vực nghiên cứu mà kỹ thuật này cũng đóng vai trò rất lớn để đưa ra bức tranh đa dạng vi nấm. Sự đa dạng của phương pháp, kỹ thuật phân lập trên từng mẫu sẽ làm tăng độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.
3.2.5.3 Sự đa dạng thành phần loài vi nấm Hyphomycetes dựa vào các chỉ số sinh
học
Kết quả nghiên cứu về đa dạng thành phần chi loài vi nấm Hyphomycetes ở 4 RQG trên là khá đa dạng và là mới cho khu hệ vi nấm ở Việt Nam. Chúng tôi đã phân lập được 79 chi nấm, chiếm 14,5% trên tổng số 546 chi nấm Hyphomycetes đã
được tìm thấy trên thế giới [156] và 176 loài đã được tìm thấy tương đương với 13,5% tống số 1300 loài hiện biết [90]. Trong số 79 chi có được thì 34 (43,0 %) chi lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam (Phụ lục 6).
v Xét về bình quân số lượng loài vi nấm phân lập được trên một mẫu lá tại từng khu vực nghiên cứu:
Mã Đà là nơi có tính đa dạng sinh học cao nhất 5 loài/mẫu (55 loài/11 mẫu). Sau
đó là đến Bạch Mã 3,53 loài/ mẫu (53 loài/ 15 mẫu), rồi đến Phú Quốc với 3,2 loài/ mẫu (45 loài/17 mẫu) và cuối cùng là Ba Bể với 2,06 loài/ mẫu (35 loài/ 17 mẫu).
v Xét về chỉ sốđa dạng thành phần loài H’:
Mã Đà là nơi có chỉ số đa dạng sinh học cao nhất (H’=4,055), sau đó là đến Bạch Mã (H’=3,842), rồi đến Ba Bể và Phú Quốc ( chỉ sốđa dạng H’ lần lượt là 3,154 và 3,14).
v Xét về mức độ chiếm ưu thế dựa vào chỉ số mức độ chiếm ưu thế (Cd): RQG Ba Bểlà nơi có chỉ số chiếm ưu thế cao nhất Cd= 0,0521; tiếp đó là RQG Bạch Mã Cd=0,0267; rồi đến RQG Mã Đà Cd=0,0201 và cuối cùng là RQG Phú QuốcCd=0,0164.
v Xét về tần suất xuất hiện của từng chi:
RQG Ba Bể là nơi có số chi ưu thế và chi thường gặp (TSXH ≥40%) [98] cao nhất: 3 chi, sau đó là RQG Bạch Mã và Mã Đà:2 chi, trong khi Phú Quốc không có chi nào (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. Các chi nấm chiếm ưu thế tại 4 RQG nghiên cứu
Địa điểm phân lập STT Chi chiếm ưu thế Tần suất bắt gặp (%) Ba Bể 1 Fusarium 94,1 2 Aspergillus 70,6 3 Trichoderma 41,3 Bạch Mã 1 Isthmolongispora 46,9 2 Trichoderma 40 Mã Đà 1 Penicillium 45 2 Trichoderma 45 Phú Quốc 0
Như vậy nhìn chung Bạch Mã và Mã Đà là 2 khu vực nghiên cứu có độ đa dạng sinh học cao, điều này phải chăng là do Mã Đà là khu vực sinh thái đặc biệt,
nơi đây có sự thay thế, đổi mới các hệ sinh thái trước và sau chiến tranh chống Mĩ do
ảnh hưởng một lượng lớn chất độc màu da cam do Mĩ rải vào Mã Đà- Chiến khu D [4]. Sau đó chính quyền và nhân dân Đồng Nai đã khắc phục hậu quả chiến tranh bằng việc trồng rừng vào những năm 1984-1985, biến nơi đây thành khu dự trữ sinh quyển thứ 580 của thế giới và là khu dự trữ sinh quyển thứ 08 tại Việt Nam. Mã Đà trở thành một RQG có tài nguyên đa dạng sinh học phong phú và đa dạng, đại diện
cho rừng miền Đông Nam bộ (rừng mưa nhiệt đới)
(http://dongnaireserve.org.vn/khudutrusinhquyen).Còn RQG Bạch Mã nằm trên vùng ranh giới địa lý sinh vật giữa Bắc và Nam Việt Nam, và giữa dãy núi Trường Sơn và vùng đồng bằng ven biển, được ghi nhận là nơi có tính đa dạng sinh học cao. Bạch Mã là một trong các "Trung tâm đa dạng Thực vật" và được coi là một trong bảy vùng có tầm quan trọng toàn cầu của Việt Nam [14].
RQG Phú Quốc là nơi không nổi trội về số lượng thành phần loài cũng như
các chỉ số sinh học, nhưng đây lại là nơi phát hiện được một số lượng lớn các taxon mới cho khoa học. Trong số 8 taxon mới được nghiên cứu thì có 6 taxon thuộc khu hệ vi nấm ở Phú Quốc (Bảng 3.11) và cũng có tới 17/34 chi nấm mới ghi nhận được
ở Việt Nam (Phụ lục 6). Phải chăng các yếu tố địa lý, khí hậu riêng biệt của Phú Quốc đã làm nên sự khác biệt về đa dạng sinh học của các loài vi nấm tồn tại nơi
đây so với 3 khu vực nghiên cứu còn lại. Trong khi Ba Bể lại là khu vực nghiên cứu có ưu thế về số lượng chi chiếm ưu thế.