+ Tách ADN cho phản ứng PCR [130]
Dung dịch đệm phá tế bào (100mL): Tris 0.1M, pH 7.5-10 ml; 1% CTAB-1 g; NaCl 0.7M-14 ml; EDTA 10mM- 2 ml (of 0.5M stock); 1% ß-mercaptanol- 1 ml (trong trường hợp cần thiết), nước MQ 73mL.
Cách làm
Cho 100 µl đệm phá tế bào và 100 µg hạt thủy tinh (đường kính 0,2mm) vào
ống eppendoff 1,5 ml, sau đó cho khoảng 100mg sinh khối nấm vào ống, dùng dụng cụ chuyên dụng nghiền nát sợi nấm, vortex dung dịch thành dạng huyền phù. Thêm 1/10 thể tích proteinase K 20mg/mL, đảo nhẹ nhàng, ủ 60oC trong vòng 60 phút. Làm lạnh trên đá, sau đó cho thêm 1:1 thể tích hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ nhàng, ly tâm lạnh 15000 vòng/phút trong 15 phút. Hút phần dịch trong, cho sang ống Eppendoff mới. Cho thêm 1:1 thể tích EtOH 100% và 1/10 thể tích natri acetate 3M, để -20oC trong 20 phút. Ly tâm lạnh 15000 vòng/phút trong 10 phút, thu kết tủa. Rửa sạch kết tủa bằng cách cho EtOH 70% vào, ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút trong 5 phút, bỏ dịch, thu kết tủa (lặp lại 3 lần). Làm khô ADN bằng cô quay chân không trong 3-5 phút hoặc để khô tự nhiên. Hòa tan tủa trong nước MQ, để -20oC trước khi sử dụng.
+ Phản ứng PCR - Hỗn hợp phản ứng: 10X Buffer 10µl dNTP mixture 16µl Mồi xuôi 2µl Mồi ngược 2µl TaqTm 1.2 µl Mẫu ADN (50 ng) 1 µl Nước cất đến 100µl
- Mồi dùng cho nhân đoạn ADNr 18S [180]:
Mồi xuôi EF4: 5'- GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'
- Mồi cho nhân đoạn ADNr 28S đoạn D1D2 [130]:
Mồi xuôi NL1: 5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3’
Mồi ngược NL4: 5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3’
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Trước hết ADN bị biến tính thành sợi
đơn ở 95oC trong 3 phút; Sau đó ADN được nhân đoạn ở 30 vòng, chu trình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 95oC trong 30 giây, (2) giai
đoạn bắt cặp- các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích: 55oC trong 30 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên mở rộng 72oC trong 1 phút- nhiệt độ thích hợp cho ezyme Taq polymerase hoạt động); kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên 72o trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt
độ này.
- Kiểm tra các sản phẩm PCR trên gel agarose
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của QIAgen (Invitrogen, Đức).
- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả
kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD280 > 1,7 -1,8
+ Phản ứng khuếch đại genADNr cho giải trình tự ADN
Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) và 2 đoạn mồi NL1 và NL4 trên máy GeneAmo PCR System 9700 (Applied Biosystems), với chu trình nhiệt như
sau: Đầu tiên ADN bị biến tính thành sợi đơn ở 96oC trong 2 phút; Sau đó ADN
được nhân đoạn ở 25 vòng, chu trình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 96oC trong 10 giây, (2) giai đoạn bắt cặp- các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích: 50oC trong 5 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên mở rộng 60oC trong 1 phút- nhiệt độ thích hợp cho ezyme Taq polymerase hoạt động); kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên 72o trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này. Khác với nhân đoạn sản phẩm ADNr ở trên, sản phẩm nhân đoạn ADNr cho sequencing lúc này được sản phẩm là các đoạn ADN đơn được duỗi ra.
+ Tinh sạch sản phẩm sau PCR
Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5µl EDTA 1,25 M, thêm 60µl ethanol 100%. Trộn nhẹ nhàng. Giữở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 10 µl ethanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Làm khô mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.
+ Đọc trình tự ADN
Trình tự của đoạn D1/D2 ADNr 28S của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy
đọc trình tự tựđộng 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự
của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen. Xây dựng cây phân loại sử dụng phần mềm Cluxstal phiên bản 1.83 và NJ tree.
Ý nghĩa của phương pháp
Đây là phương pháp quan trọng trong phân loại nấm. Tuy dữ liệu về các đoạn trình tự gen cấu trúc dùng để phân loại nấm trong ngân hàng gen còn chưa được đầy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đủ, nhưng việc phân tích trình tự ADNr đoạn 28S và 18S của các chủng nấm cần phân loại cũng đưa ra được thông số cần thiết để phân loại đến chi, loài. Thông thường nếu độ
tương đồng giữa chủng nấm nghiên cứu với chủng nấm gần gũi nhất trên ngân hàng gen bank < 98% thì đã có thể có gợi ý rằng đó là một chi hoặc loài mới [156]. Trong nghiên cứu này, những chủng có độ tương đồng < 98% mà chưa được nghiên cứu sâu để khẳng định chúng có là 1 taxon mới hay không thì chúng được viết dưới dạng sp.