Nguyên lý
Bào tử vi nấm tồn tại trong đất bám vào xác thực vật (lá, cành hoặc thân cây mục). Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử nảy mầm, sinh ra các sợi bám, sợi hút xuyên qua xác thực vật, một số chủng sinh ra các loại enzyme phân hủy xác thực vật như: cellullaza, hemicellulaza và ligninolytic enzyme để phá hủy các cấu trúc
thực vật, giải phóng ra các hợp chất thứ cấp (đường, saccharide, polysaccharide,…) tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển các loài vi sinh vật khác [69].
Để nghiên cứu đa dạng vi nấm tồn tại trong lớp lá cây rụng, người ta đã sử
dụng phương pháp rửa bề mặt mẫu bằng dung dịch tẩy rửa có nồng độ thấp, loại bỏ
vi sinh vật tạp nhiễm từ đất, chỉ còn lại các chủng tồn tại trong xác thực vật. Các chủng này sẽ hình thành khuẩn lạc khi chúng gặp điều kiện thuận lợi, việc phân lập các chủng nấm này dựa vào sự quan sát sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy.
Chuẩn bị hóa chất
Aerosol OT (di-iso-octyl sodium sulfosuccinate), môi trường thạch đĩa LCA, nước cất vô trùng
Chuẩn bị dụng cụ
Ống Falcon 50ml, kéo, kẹp thí nghiệm, đĩa Peptri thủy tinh, giấy thấm (tất cả
các dụng cụ này đều được vô trùng), máy vortex.
Các bước tiến hành
1) Cắt mẫu lá rụng ra thành các miếng nhỏ kích thước 5 x 5 cm, sau đó cho vào ống Falcon 50ml.
2) Cho 25ml dung dịch Aerosol OT (di-iso-octyl sodium sulfosuccinate) 0,005% vào ống Falcon đã chứa mẫu, lắc đảo rửa mẫu bằng cách sử dụng máy vortex trong 3 phút, sau đó gạn sạch dung dịch tẩy rửa này.
3) Cho 25ml nước vô trùng vào mỗi ống thí nghiệm, lắc đảo rửa mẫu bằng máy vortex như bước trên 3 phút, sau đó cũng gạn sạch nước. Lặp đi lặp lại bước rửa bằng nước cất này 3 lần.
4) Làm khô mẫu bằng cách dùng kẹp vô trùng gắp từng mẫu lá đặt lên đĩa Peptri có chứa giấy thấm vô trùng, đặt đĩa này trong tủ vô trùng, để mẫu qua đêm cho chúng khô tự nhiên.
5) Dùng kẹp vô trùng chuyển từng miếng mẫu nhỏ, đặt lên đĩa thạch chứa môi trường LCA, cho vào tủấm độ 25oC.
6) Quan sát sự hình thành khuẩn lạc của nấm sợi trong thời gian 3-7 ngày, chọn những khuẩn lạc đơn, rồi tách riêng từng khuẩn lạc sang một đĩa môi trường LCA mới (cố gắng chọn được các khuẩn lạc khác nhau).
Ý nghĩa của phương pháp
Phân lập được hầu hết các chủng nấm tồn tại trong xác thực vật và có khả
năng phát triển nhanh.