Trong khi đó một số loài bào tử lại phát sinh theo kiểu nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Hình 1.8 A), bào tử mới sinh ra tại đỉnh chuỗi hay đính với đỉnh của một bào tử già hơn, vì thế bào tử già nhất luôn nằm ở gốc của chuỗi, điều đó có nghĩa là bào tử non nhất và nhỏ nhất luôn nằm ở đỉnh của chuỗi. Một số loài chuỗi bào tử có dạng phân nhánh, bào tử ở gốc thường lớn hơn và có nhiều vách ngăn hơn bào tử
nằm phía trên. Tại điểm phát sinh nhánh, bào tử thường có một vết sẹo ở phần gốc và 1-2 vết sẹo ở phần đỉnh, được gọi là bào tử phân nhánh (ramoconidia) (Hình 1.8 B) [156].
Hình 1.8 Sự phát sinh bào t A.Nảy chồi hướng ngọ 1.2.4.3 Phát sinh bào tử dạng t Dạng thản (thallic), có 2 lo thành vách ngăn tại nhiều đi Geotrichum (Hình 1.9 A). M nấm tạo tản đơn độc (dạng này hi Hình 1.9 A. Tản đơn độc ( 1.2.5 Các phương thức bào t Có 2 phương thức bào t
Schizolytic (Hình 1.10 A-C) là phương th thành 1 vách phân chia (vách ngăn ngang) h tử, tạo thành sẹo ở đỉnh cuố
tử- đây là một trong những đ
Rhexolytic (Hình 1.10 D 2 vách ngăn ngang giữa tế
phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng ngọn
ọn không phân nhánh, B. Nảy chồi hướng ngọn phân nhánh
ng tản (Thallic)
ó 2 loại phát sinh: Tản theo chuỗi, dạng này s u điểm khác nhau và tạo thành chuỗi, chẳng h ). Một số loài nấm chỉ tạo thành vách ngăn tạ
ng này hiếm gặp) (Hình 1.9 B) [156].
Hình 1.9 Phát sinh bào tử dạng tản
c (Oidiodendron). B. Tản theo chuỗi (Geotrichum
ào tử rời khỏi cuống:
c bào tử rời khỏi cuống: Schizolytic và Rhexolytic. C) là phương thức thông dụng nhất, và kết qu
thành 1 vách phân chia (vách ngăn ngang) hình thành giữa bào tử và tế
ống sinh bào tử và gốc bào tử, còn gọi là rốn (hilum) bào ng đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm.
Rhexolytic (Hình 1.10 D- F) là hình thức rời khỏi cuống của bào t
ế bào sinh bào tử và bào tử, khoảng không gi
n phân nhánh ng này sợi nấm hình ng hạn như chi i đỉnh của sợi Geotrichum sp.) ng: Schizolytic và Rhexolytic. t quả là sự tạo
ế bào sinh bào n (hilum) bào a bào tử tạo thành ng không giữa 2 vách
ngăn ngang không có nhân (không gọi là 1 tế bào), khi vách ngăn này bị vỡ, bào tử
rời khỏi tế bào sinh bào tử [156].
Hình 1.10 Các phương thức bào tử rời khỏi cuống [156].
A-C. Schizolytic và D-F. Rhexolytic
1.3 CÁC TIÊU CHÍ SỬ DỤNG TRONG PHÂN LOẠI HYPHOMYCETES
BẰNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ADN RIBOXOM
1.3.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm và vai trò của chúng trong phân loại sinh học phân tử học phân tử
1.3.1.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm
Một trong những nhóm gen thường được sử dụng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại của nấm là những gen mã hóa cho ARNr. Tính phổ biến và hiệu quả
của việc so sánh trình tự ARNr/ADNr xuất phát từ các đặc tính quan trọng sau: (i) Các riboxom có mặt ở tất cả các sinh vật có cấu tạo tế bào và xuất hiện cùng nguồn gốc tiến hóa, do vậy tất cả các sinh vật đều có bằng chứng lịch sử phân tử; (ii) ARNr là một gen có nhiều bản sao, không mã hóa protein, các bản sao được sao chép liên tục song song và đồng nhất trong quá trình phát triển và do đó có độ bảo thủ cao [174; 175]; (iii) ARNr/ ADNr được bảo tồn đầy đủ ở các sinh vật, bên cạnh đó các vùng gen bảo tồn này lại xen kẽ với các vùng dễ biến đổi [66]. Một đơn vị ADNr mã hóa cho ARNr được chia thành các vùng: (i) Vùng mã hóa, gồm các gen được sắp xếp theo trật tự 18S; 5,8S và 28S. Các gen này tập hợp thành một đơn vị phiên mã ARNr (rRNA transcription unit); (ii) Vùng không mã hóa gồm các đoạn trình tự IGS
(Inter- Genic Spacer) được chia làm 2 vùng: vùng không phiên mã NTS (nontranscribed) và vùng sao chép ngoài ETS (Externally Transcripbed Spacer) nằm nối tiếp giữa 28S và 18S kế tiếp. Vùng không mã hóa khác gồm ITS1 (nằm giữa 2 gen 18S và 5,8S) và ITS2 (nằm giữa 5,8S và 28S). Các vùng không mã hóa cũng
được phiên mã là ITS và ETS, còn vùng không mã hóa cũng không được sao chép là vùng NTS (Hình 1.11). Tổng chiều dài của một ADN lặp lại là giữa 7.7- 24 kb [73].
Hình 1.11 Cấu trúc một đơn vị ADN riboxom của nấm [73].
1.3.1.2 Vai trò của các đoạn ADNr trong phân loại nấm sợi
Trong phân loại nấm sợi, do có sự lựa chọn khác nhau về vùng gen dùng trong phân loại mà việc phân tích mối tương quan giữa các loài được đánh giá ở các mức
độ khác nhau. ARNr 18S (small-subunit (SSU)- ARNr tiểu đơn vị nhỏ) là vùng đủ
lớn và chứa các vùng rất bảo thủ cũng như các vùng biến đổi. Việc xác định trình tự
rARN 18S được dùng để phân tích mối quan hệ gần gũi của các nhóm nấm có mối quan hệ họ hàng gần ở bậc phân loại cao từ cấp ngành đến cấp loài [33; 164;185].
ARNr 28S đoạn D1D2 có vùng biến đổi, chứa nhiều thông tin và cho phép phân loại từ mức độ các bậc phân loại cao đến bậc phân loại loài, vì vậy chỉ cần phân tích một đoạn ngắn vùng gen biến đổi (vùng D1D2- khoảng 600 bp) cũng đã có thể so sánh, đánh giá mối quan hệ họ hàng gần giữa các loài nghiên cứu[65]. Đoạn gen này được sử dụng rộng rãi trong phân loại đến mức độ chi, loài cho nấm men [100; 101], nấm Đảm [32] và nấm Túi [64; 112]. Trình tự gen vùng ITS là vùng có nhiều biến đổi hơn nên có thể dùng trình tự gen này để phân loại mức độ loài ở nấm men
[65] và hầu hết các nấm sợi phổ biến như Trichoderma [158], Penicillium [74],
Aspergillus [176],…
Tuy nhiên với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay để phân loại đến loài đối với mỗi chi nấm người ta sử dụng những đoạn trình tự gen khác nhau. Chẳng hạn để phân loại đến loài chi Penicillium phải dùng tới 4 đoạn gen: Dưới đơn vị
cytochrome C có khả năng oxi hóa 1 (cox1), β-tubulin (benA), nhân tố kéo dài dịch mã 1-α (tef1-α), và calmodulin (cmd) [187]. Để phân loại các loài thuộc chi
Aspergillus, 5 đoạn gen:beta tubulin (BT2), calmodulin (CF), ITS và LUS ADNr
(ID) và RNA polymerase II (RPB2) đã được sử dụng [136]. Để phân loại đến loài chi thuộc nhóm Mucorales người ta phải dùng đến trình tự đa gen: 28S ADNr vùng D1/D2, ADNr vùng ITS, actin, và nhân tố kéo dài dịch mã (EF-1α).
1.3.2 Vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm(ADN barcoding fungi)
Trong phân loại vi nấm, các nhà khoa học nấm vẫn lựa chọn phân loại dựa trên quan sát và phân tích hình thái, phương pháp này thường phải cần các chuyên gia có kinh nghiệm và chỉ phân loại được trên những tiêu bản nấm có đủ cấu trúc sinh sản. Tuy nhiên với tiến bộ của khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự ADN là một phương pháp có nhiều ưu việt, nó có thể cho phép một cán bộ trẻ chưa có nhiều kinh nghiệm về phân loại nấm cũng có thể phân loại chúng từ những vật liệu sống của nấm, thậm chí là từ tiêu bản khô. Vùng gen di truyền dùng để phân loại một chủng nấm bất kỳ, từ những mẫu bất kỳ, thậm chí là những mẫu đã bị phá hủy hay các mẫu ngoài môi trường được gọi là vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm (ADN barcoding fungi). Thuật ngữ này được đưa ra bởi Hebert và cộng sự (2003), hiện nay có rất nhiều tài liệu nói về vấn đề này, chẳng hạn:
www.barcoding.si.edu,.... Việc dùng một ADN barcoding fungi lý tưởng có thể biểu hiện được mối liên kết về những thay đổi trong cùng một loài (intraspecific) hay giữa các loài chị em (sibling) [71]. Gen CO1- tiểu đơn vị 1 cytochrome C oxidase (the cytochrom C oxidase subunit 1) - vùng ty thểđã được biết đến là vùng ADNr mã hóa dùng trong phân loại nấm chuẩn cho mọi vi sinh vật, tuy nhiên nghiên cứu phân loại học của nấm, có rất ít dữ liệu về CO1 [126; 155]. Hiện nay, các nhà nấm học vẫn sử
dụng đoạn ITS, 28S để phân loại nấm đến loài, trong đó nhiều ý kiến cho rằng nên sử
dụng đoạn ITS là locus chuẩn dùng cho phân loại nấm. Không dừng lại ở đó, các nhà khoa học đang lỗ lực tìm ra những locus có nhiều thông tin hơn trong phân loại nấm. Và việc quan trọng hơn cả là cần phải công bố những kết quả về phân tích trình tự
các chủng nấm có trong các Bảo tàng Giống chuẩn trên thế giới [49]. Những hồ sơ dữ
liệu về trình tự của nấm cũng cần được phổ biến trong một trang web chung để người sử dụng có thể nhận được số liệu thô của mình, so sánh và diễn giải kết quả của mình có chất lượng. Dữ liệu trong ngân hàng genbank có thểđáp ứng được những nhu cầu
đó, vì vậy nó được gọi là "barcoding flag". Trang dữ liệu về ADN barcoding thông dụng nhất hiện nay là: barcoodinglife.org/views/login/phb; www.cbs.know.nl hay the
Trichoderma&Hypocrea database www.isth.infor [49].
1.3.3 Phân tích sự phát sinh chủng loại
Mục đích của phân tích sự phát sinh chủng loại bằng việc xây dựng cây phát sinh chủng loại là sắp xếp, so sánh một loài với các loài khác càng gần gũi càng tốt.Cây phả hệ và cây phát sinh chủng loại phải phản ánh được quá trình tiến hóa giữa các loài trong cây [137; 182; 183]. Trong cây phát sinh chủng loại, một chủng có thểđại diện cho một loài, nhưng cũng có thể nhiều chủng được đại diện cho một loài. Xây dựng cây phân tích phát sinh chủng loại được tiến hành qua các bước sau: trước hết thành lập các ma trận đặc điểm, sau đó phân tích các ma trận và cuối cùng là biểu hiện cây và diễn giải các thông tin trên cây bằng việc sử dụng các thuật toán. Thông thường cây được thể hiện dưới dạng Phylogram, trên đó chiều dài nhánh (branch lengh) được biểu hiện, chúng được sắp xếp tại phần gốc của cây và thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa chủng nghiên cứu và các chủng gần gũi khác. Giá trị Bootrap thể hiện tại phần gốc của nhánh, thông thường giá trị này >50% mới
Hình 1.12 Ví dụ về một cây chủng loại phát sinh
1.3.4 Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử học phân tử
Trong phân loại dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử, một số tác dùng phương pháp
điện di để so sánh, phân loại độ tương đồng giữa các loài.Tuy nhiên tính chính xác của phương pháp này có nhiều hạn chế, do nhiều loài khác nhau nhưng có kích thước các
đoạn gen dùng trong phân loại không khác nhau. Vì vậy đa phần các tác giả đã xác
định trình tự của các loài gần gũi và phân tích mối quan hệ họ hàng giữa chúng. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi ở các chi Penicillium [104],Fusarium [137]
Trong số các phương pháp điện di ADN, phương pháp RPLP (restriction fragment length polymorphism) là đặc biệt quan trọng đối với phân loại. Kỹ thuật này liên quan đến việc cắt các mẫu ADN bằng các enzyme giới hạn tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từđó lập thành bản đồ gen và so sánh sự
khác nhau giữa các loài [172]. Kỹ thuật này đã được phát triển từ những năm 1980, tuy nhiên chúng không được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu đa dạng chi, loài nấm mà chủ yếu dùng trong nghiên cứu đa dạng các thứ, các dòng nấm cụ thể hoặc dùng để phân tích mối quan hệ giữa loài vô tính và hữu tính (anamorph – teleomorph).
1.3.5 Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh
Năm 2004 Luitzoni và cộng sự đã tổng hợp các số liệu từ 560 công trình nghiên cứu về xây dựng cây phân loại nấm từ những năm 1990 trở lại đây và cho rằng nấm chủ yếu được phân loại dựa vào trình tự 5 loại gen phổ biến: ADNr đoạn 18S và 28S, ADN riboxom tiểu đơn vị nhỏ mitochondrial (mitSSU ADNr) và tiểu
đơn vị lớn thứ 2 của ARN polymerase II (RPB2) và gen ITS. Trong đó có tới 489 (82,2%) số cây dựa vào trình tựđơn gen, 77 cây dựa vào trình tự 2 gen, 19 cây dựa vào trình tự 3 gen, 10 cây dựa vào trình tự 4 gen [105].
Dựa vào các kết quả nghiên cứu trước đó, Lutzoni và cộng sựđã xây dựng lại cây phân loại nấm dựa vào trình tự gen ADNr đoạn 18S và 28S, theo đó giới nấm
được chia làm 5 ngành: Chitridiomycota, nằm ở nhánh cuối cùng, tiếp đến là: Zygomycota, Glomeromycota- đây là những ngành nấm bậc thấp không có sợi hoặc sợi nấm không có vách ngăn. Ngành nấm đảm Basidiomycota sợi nấm đã có vách ngăn và có mấu lồi, trên cùng là ngành nấm túi Ascomycotina -sợi nấm có vách ngăn rõ ràng (Hình 1.13) [105].
1.3.6 Nghiên cứu phân loại nhóm nấm Hyphomycetes dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh chủng loại phát sinh
Bằng việc phân tích trình tự đa gen SSU ADNr (18S), ADNr vùng ITS, nucLSU ADNr (28S), mitSSU ADNr) và RPB2,Schoch và cộng sự năm 2009 đã xây dựng cây phân loại nhóm nấm Hyphomycetes, chúng được phân chia ra làm 8 lớp: Peizomycetes, Orbiliomycetes, Arthoriomycetes, Dothiodeomycetes, Eurotiomycetes, Lecaneromycetes,
Leotiomycetes, Sordariomycetes [152] (Hình 1.14).
Lớp Sodariomycetes gồm 14 bộ (Hypocreales, Coronophorales, Melanosporales, Glomerellales, Microascales, Lulworthiales, Diaportales, Calosphaeriales, Ophiostomatales, Magnaporthales, Sordariales, Chaetosphaeriales, Coniochaetales, Xilariales), 31 họ (Clavicipitaceae, Ophiordicipitaceae, Stachybotrys clade, Cordycipitaceae, Hypocreaceae, Niessliaceae, Nectriaceae, Bionectriaceae, Melanosporaceae, Glomerellaceae, Microascaceae, Halosphariaceae, Lulworthiaceae, Gnomoniaceae, Menlaconiaceae, Cryphonectriaceae, Valsaceae, Diaporthaceae, Calosphaeriaceae, Ophiostomataceae, Annulastascaceae, Magnaporthaceae, Sordariaceae, Lasiosphaeriaceae, Chaetosphaeriaceae, Boliniaceae, Coniochaetaceae, Xylariaceae) (Hình 1.14 B). Lớp Eurotiomycetes gồm 3 bộ (Chaetothiriales, Onygenales, Eurotiales), 4 họ (Herpotrichiellaceae, Chaetothyriaceae, Onygenaceae, Trichocomaceae) chính (Hình 1.14 C). Lớp Dothiodeomycetes gồm 3 bộ, họ 39 họ, trong có 8 họ thường gặp nhất là: Pleosporaceae, Tetraplosphaeriaceae, Tubeufiaceae, Mycosphaerellaceae, Teratosphaeriaceae, Capnodiaceae, Dividiellaceae và Dothideaceae (Hình 1.14 D) [152].
Hình 1.14 Cây phát sinh chủng loại của nhóm nấm Hyphomycetes dựa vào trình tựđa gen [152]
1.4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TRONG PHÂN LOẠI VI NẤM
1.4.1 Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom
Hiện nay trong phân loại nấm sợi, phương pháp phân loại chỉ dựa vào các
đặc điểm hình thái cũng có thể công bố loài mới và trong các nghiên cứu đa dạng vi nấm. Tuy nhiên để nghiên cứu có giá trị cao hơn thì việc phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự ADNr cần được tiến hành, trong đó, kết quả phân tích hình thái vẫn được coi trọng. Kết quả của việc phân tích trình tự ADNr chỉ là làm sáng tỏ, rõ nét thêm cho việc phân tích hình thái. Sau đây là sơ đồ các bước trong phân loại và khẳng định đến loài của một chủng vi nấm (hình 1.15):
Hình 1.15 Sơđồ các bước tiến hành phân loại 1 chủng vi nấm
1.4.2 Phân loại một bậc phân loại nấm mới
Từ các bước phân loại 1 chủng nấm nhưđã trình bày ở trên, có một số trường hợp xảy ra:
i) Kết quả phân loại hình thái trùng với kết quả phân tích trình tự gen, khi đó có thể kết luận đến loài.
Chủng phân lập
Nuôi cấy trên môi trường dùng để phân loại
Quan sát các đặc điểm hình thái điển hình: - Đặc điểm quan sát bằng mắt thường. - Đặc điểm quan sát dưới kính hiển vi: Cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử; bào tử,...
- Các phương thức hình thành bào tử
- Thời gian: 7-14 ngày hoặc 1-3 tháng (đối với loài phát triển chậm). - Nhiệt độ 25oC.
Tra cứu các khóa phân loại: - Ở mức độ chi - Ở mức độ loài - Thời gian: 3-5 ngày - Nhiệt độ 25oC. Thu sinh khối Tách chiết ADNr Blast search Phân tích trình tự ADNr PCR ADNr Phân tích cây chủng loại phát sinh Định tên đến loài Độ tương đồng lớn hơn 98% Độ tương đồng nhỏ hơn 98% Kết luận
ii) Kết quả phân loại hình thái không trùng với kết quả phân tích trình tự gen, khi đó kết quả phân loại dựa vào kết quả phân tích hình thái.
iii) Phân tích hình thái không có loài (chi) tương tự, thêm vào đó kết quả
phân tích trình tự gen ADNr có độ tương đồng nhỏ hơn 98%. Khi đó chủng nghiên cứu được nghi ngờ là một bậc phân loại mới, có thể ở mức độ lớp, bộ, họ, chi hoặc loài.
Một loài được khẳng định là mới nếu chúng có hình thái khác biệt với tất cả
các loài đã công bố trong chi. Cũng có thể khẳng định một loài là mới khi dựa vào trình tự ADNr đoạn 18S, 28S và vùng ITS của chủng nghiên cứu, chúng có độ tương
đồng thấp hơn 98% và vị trí trên cây phân loại nằm trên một nhánh khác biệt so với