Nguyên lý
Các chủng nấm tồn tại trong lớp lá rụng rất đa dạng và phong phú, những chủng có khả năng phát triển nhanh trên môi trường nuôi cấy hầu hết đã được phân lập bằng phương pháp rửa bề mặt. Tuy nhiên, một số chủng do đặc thù có khả năng bám vào bề mặt xác thực vật, đặc biệt là xác thực vật tồn tại trong các ao, hồ, sông, suối thường hình thành các giác bám, lâu dần phát triển theo hướng lan tỏa nhiều chiều tạo nên các hình dạng đặc biệt: dạng sao, dạng hoa, dạng cây. Những loài nấm này thường có kích thước lớn và khó phát triển hay hình thành bào tử trên môi trường nuôi cấy nên không thể phân lập chúng dựa vào phương pháp rửa bề mặt mà phải dựa vào phương pháp đặc biệt, phương pháp tách bào tử đơn độc [23-25; 82; 113-119]. Phương pháp này trước tiên ta phải quan sát hình dạng các bào tử tồn tại trong mẫu dưới kính hiển vi, sau đó dùng dụng cụ đặc biệt (gọi là Skarmen) gắn trên kính soi mẫu vật để trực tiếp gắp từng bào tử có hình dạng đặc biệt đó sang môi trường nuôi cấy và để chúng phát triển trong điều kiện thích hợp 25oC.
Chuẩn bị hóa chất
Môi trường nuôi cấy LCA, môi trường thạch-khoai tây, nước cất vô trùng. Chuẩn bị dụng cụ
Kéo, túi li lông có kẹp zip, kính hiển vi soi mẫu trực tiếp, bộ dụng cụ Bộ vi thao tác Skerma gồm 5 phần (Hình 2.2).
1) Dùng pipet Pasteur hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến nhiệt độ nung chảy, sau đó dùng kẹp nhẹ nhàng kéo dài tạo thành 1 ống thủy tinh rất nhỏ (khoảng 2µm). Lấy một
đoạn 3cm gắn vào cục nam châm (Hình 2.2 D) (cốđịnh bằng parafin nóng chảy). 2) Cố định phần dụng cụ dùng để gắn kim nhọn (Hình 2.2 B) vào vật kính 10 của kính hiển vi quan sát mẫu vật trực tiếp.
Hình 2.2 Các bộ phận của bộ vi thao tác Skarmen
3) Gắn nam châm có ống thuỷ tinh vào rãnh kim loại của dụng cụ trên Hình 2.2 B.
4) Di chuyển phần thiết bị có gắn nam châm lên xuống cho đến khi nhìn thấy
đầu ống thuỷ tinh ở giữa vi trường.
5) Gắn đầu kim hàn (Hình 2.2 E) vào biến thế (Hình 2.2 A) và đặt vào vị trí
đặt tiêu bản của kính hiển vi.
6) Chỉnh kính, tìm vi trường, quan sát đầu kim hàn, điều chỉnh sao cho đầu que hàn và ống thuỷ tinh sát nhau và đều quan sát được dưới kính hiển vi.
7) Bật biến thế (Hình 2.2 A) nấc cao để đầu que hàn nóng đỏ và tiến về phía
ống thuỷ tinh, ấn que hàn chạm vào ống thuỷ tinh để ống thuỷ tinh bắt đầu nóng chảy, kéo nhanh ống thuỷ tinh khỏi kim hàn tạo thành que thuỷ tinh thuôn nhọn.
D B
E C A
8) Hạ nhiệt độ que hàn bằng cách giảm biến thế, dùng đầu que hàn chạm nhẹ
vào đầu que thuỷ tinh kéo nhẹ tạo thành hình chữ L. Giờ đây ta có thể bắt đầu thực hành lấy từng bào tửđơn độc trên đĩa thạch.
Các bước tiến hành phân lập bào tửđơn độc
1) Chuẩn bị mẫu: lá cây khô, cho vào hộp nhựa hoặc túi ni lông có chứa nước vô trùng sẵn để làm ẩm, giữ 2-3 ngày ở nhiệt độ phòng để kích thích bào tử nẩy mầm.
2) Lấy mẫu lá trên cắt thành những miếng nhỏ có kích thước 15- 20 x 30-40 mm. 3) Dùng kẹp nhẹ nhàng đặt mẫu lá lên trên bề mặt môi trường thạch LCA, nhẹ
nhàng dính mẫu lá xuống bề mặt thạch để bào tử nấm bám vào bề mặt thạch.
4) Quan sát đĩa thạch trên dưới kính hiển vi, tìm bào tử có hình dạng đặc biệt, khi thấy bào tử cần tìm thì giữ nguyên vị trí.
5) Gắn phần dụng cụ hình chữ V (Hình 2.2 C) của bộ vi thao tác vào vật kính 10 của kính hiển vi, tiếp đến gắn phần nam châm có que thuỷ tinh hình chữ L vừa làm xong vào phần dụng cụ chữ V đó.
Điều chỉnh lên xuống sao cho có thể quan sát được đầu chữ L của que thuỷ tinh. 6) Nâng kính lên sao cho đầu que thủy tinh sát với bề mặt thạch, lúc này ta có thể quan sát được cả bào tử nấm cần tìm và cảđầu L của que thuỷ tinh.
7) Dùng que L kéo bào tử cần lấy ra phần sạch của đĩa thạch môi trường, dùng chính kim phần chữ L đó đánh dấu điểm đặt bào tử.
8) Hạđĩa môi trường thấp xuống và dùng que cấy vô trùng cắt miếng thạch có chứa bào tử tại điểm đánh dấu, chuyển sang đĩa thạch môi trường LCA hoặc thạch- khoai tây, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày. Nếu bào tử nảy mầm thì có thể chuyển sang thạch nghiêng để giữ giống sau khi đã
đểở thạch đĩa 2-4 tuần.
Ý nghĩa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân lập được các chủng nấm có hình dạng đặc biệt, khó phát triển trên môi trường nuôi cấý. Đây là phương pháp khó thực hiện, ít nhà khoa học có thể ứng dụng phương pháp này, nhưng nếu ứng dụng thành công thì sẽ có nhiều khả năng tìm được loài mới