Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây ý dĩ

Các mẫu Ý dĩ được gieo trồng trong cùng một điều kiện và trong cùng một mùa vụ tại Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được nghiên cứu xác định tính đa dạng về

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Trần Văn Ơn – Giảng viên Bộ môn Thực Vật, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã

trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô TS Hoàng Quỳnh Hoa,

ThS Phạm Hà Thanh Tùng, DS Nghiêm Đức Trọng, cùng toàn thể các thầy cô

giáo và các chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới sự dạy dỗ, dìu dắt của các thầy cô giáo trong nhà trường trong suốt 5 năm học vừa qua Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt

thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2013

Sinh viên Nguyễn Hữu Thế

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2.2.1 Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 21

3.1.2 Đặc điểm nông học của các mẫu Ý dĩ 35

3.1.3 Kết quả nghiên cứu tính đa dạng về đặc điểm hình thái và

C Cystosin

CTAB Cetyltrimethylammonium (cetrimonium) bromide

DNA Acid deoxyribonucleic

dATP Deoxy Adenosine Triphosphate

dCTP Deoxy Cytidine Triphosphate

dGTP Deoxy Guanosine Triphosphate

dTTP Deoxy Thymidine Triphosphate

ddATP Dideoxy Adenosine Triphosphate

ddCTP Dideoxy Cytidine Triphosphate

ddGTP Dideoxy Guanosine Triphosphate

ddTTP Dideoxy Thymidine Triphosphate

ddNTP Dideoxy Nucleoside Triphosphate

dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Axit

FDA Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm

GAP Good Agricultural Practices - Thực hành tốt trồng trọt cây thuốc HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

IC50 Inhibitory Concentration 50 -Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

ITS Internal Transcribed Spacer

KLT Kanglaite

mARN Messenger Acid Ribonucleic – ARN thông tin

MeOH Methanol

Nu Nucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

Rf Retention Factor – Hệ số lưu trữ

STZ Streptozocin

1 Bảng 1.1 Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình

tự gen bằng phương pháp Maxam và Gilbert

15

2 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu nghiên cứu 19

3 Bảng 2.2 Các chỉ tiêu nông – sinh học được theo dõi 22

4 Bảng 2.3 Các bước thực hiện tách DNA từ mẫu lá Ý dĩ 24

5 Bảng 3.1 Bảng tổng kết các chỉ tiêu nông – sinh học và đặc điểm

hiệu

1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Coixol và α-monolinolein 5

2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Coixenolide 6

3 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8) 7

4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13) 8

5 Hình 1.5 Thuốc tiêm Kanglaite 12

6 Hình 1.6 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 14

7 Hình 2.1 Chậu nhựa dùng để trồng các mẫu Ý dĩ 22

8 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La) 27

9 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình) 28

10 Hình 3.3 Thân mang lá mẫu Y3 (Đạo Trù – Vĩnh Phúc) 29

11 Hình 3.4 Thân mang lá mẫu Y4 (Hoàng Mai – Hà Nội) 29

12 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan) 30

13 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái của mẫu Y6 (Thuận Châu – Sơn La) 31

14 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu Y7 (Mường Thanh – Điện Biên) 32

15 Hình 3.8 Đặc điểm hình thái mẫu Y8 (Thành phố Hải Dương) 33

16 Hình 3.9 Đặc điểm hình thái mẫu Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn) 34

1 Phụ lục 1 Các chỉ tiêu nông – sinh học theo dõi được từ tháng 12/2012

đến tháng 05/2013

2 Phụ lục 2 Bảng mã hóa các biến số đặc điểm hình thái và chỉ tiêu nông

– sinh học

3 Phụ lục 3 Kết quả chồng peak sắc ký 10 mẫu Ý dĩ

4 Phụ lục 4 7 đoạn trình tự nucleotid dùng để so sánh từ ngân hàng gen

quốc tế

5 Phụ lục 5 Trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ

6 Phụ lục 6 Độ tương đồng di truyền của 9 mẫu Ý dĩ

7 Phụ lục 7 Kết quả gióng hàng trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ và 7

đoạn trình tự so sánh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.), họ Lúa (Poaceae), là cây thuốc đã được sử dụng

lâu đời và phổ biến trên Thế giới cũng như ở Việt Nam với nhiều công dụng Rễ Ý

dĩ dùng để chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp đau xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, kinh bế, trừ giun đũa, đau

bụng giun Hạt Ý dĩ được dùng chữa áp-xe phổi, ruột thừa, viêm ruột ỉa chảy, phong

thấp sưng đau, loét dạ dày, loét cổ tử cung, mụn cóc, eczema Ý dĩ là thuốc bổ và bồi dưỡng cơ thể tốt, dùng bổ sức cho người già và trẻ em, dùng lợi sữa cho người

phụ nữ sinh đẻ Gần đây, các nghiên cứu trong và ngoài nước đã phát hiện tác dụng

hạ đường huyết [10], [35] và tác dụng chống ung thư [29] của cây này

Mặc dù được sử dụng phổ biến với nhiều công dụng quan trọng như vậy, nhưng nguồn dược liệu Ý dĩ sử dụng ở trong nước chủ yếu được nhập khẩu từ Trung Quốc Ở miền Bắc Việt Nam, Ý dĩ chủ yếu mọc hoang và được trồng rải rác với qui mô nhỏ, chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng trong nước Vì vậy, cần phải

mở rộng qui mô trồng cây Ý dĩ theo các quy chuẩn của Thực hành tốt trồng cây thuốc (GAP), nhưng ở miền Bắc Việt Nam có nhiều thứ/giống Ý dĩ khác nhau, với hình thái khá giống nhau mà cho đến nay vẫn gây ra sự nhầm lẫn giữa các

thứ/giống Mỗi thứ/giống có thể cho năng suất và chất lượng khác nhau, dẫn đến hiệu quả kinh tế và điều trị có thể khác nhau.Vì vậy, việc xác định tính đa dạng sinh

học của cây Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam là cần thiết Năm 2012, Dược sĩ Nguyễn Kim Khanh đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam Kết quả thu được là 6 mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học nhưng có sự khác

biệt về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền [11] Tuy nhiên nghiên cứu này

mới chỉ nghiên cứu trên 2 thứ là: Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi và Coix

lacryma-jobi L var stenocarpa Oliv

Do đó đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ” được tiếp tục

thực hiện với 2 mục tiêu chính là:

1 Xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền của

một số giống Ý dĩ

2 Khảo sát sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt của một số giống

Ý dĩ bằng phương pháp HPTLC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây Ý dĩ

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Coix L

Chi Coix L thuộc họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Hành (Liliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coix L

Cây thảo sống hàng năm hay lâu năm Thân mọc thẳng đứng cao 1,5 – 2m, phân nhánh ở những ngọn có hoa Ở gốc thân có nhiều rễ phụ Lá mọc so le, mặt lá ráp, gân lá song song không có cuống Hoa đơn tính cùng gốc Bông hoa đực ngắn màu lục nhạt trông tựa một nhánh của bông lúa; hoa cái nằm trong một lá bắc dày

và cứng, từ màu xanh chuyển sang màu nâu đến tím đen Quả hình trứng hơi nhọn đầu (thường gọi nhầm là nhân) được bao bọc bởi một lá bắc cứng (thường gọi nhầm

Mùa hoa quả: Tháng 5 - 12 [2]

Ở Việt Nam, đã xác định Ý dĩ có 4 thứ sau: [5], [9]

- Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi - Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều

năm, thân có đường kính 8-10mm Lá phẳng, cuống dài 40-50cm, rộng 4-5cm, gân

giữa to, gân bên rất mảnh; bẹ nhẵn, lưỡi nhỏ 1mm Cụm hoa ở ngọn nhánh Bông chét đực ở trên, dài 6-7cm Nhị vàng Bông chét cái ở dưới, có bao hình bầu, dài 8-9mm, đường kính 6mm, khi chín nâu đen rồi trắng, rất cứng Thứ này mọc ở các đất hoang đến vùng nước lợ

- Coix lacryma-jobi L var mayuen (Rom) Stapf (C.chinensis Todaro ex

Balansa) – Ý dĩ, Bo bo: Cây cỏ sống hàng năm Thân phân nhánh, nhẵn, to, xốp, cao 1-2m Lá phẳng, thuôn dài, hình tim ở gốc, nhọn đầu, dài 10-50cm, gân giữa

lớn nổi rõ, gân bên rất mảnh; bẹ lá nhẵn, kéo dài, thường rất rộng Cụm hoa là bông

mọc thẳng đứng, có cuống Hoa đơn tính cùng gốc Bông chét đực mọc chụm 2-3 chiếc một chỗ trên cuống chung mảnh, có mày cứng bao bọc Bông chét cái hình

bầu dục; lá bắc rất dày, cứng mà trắng nhạt hay xanh xám Quả hình cầu hay hình

bầu dục, có vỏ dạng giấy hay hóa cứng Phân bố Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Indonexia, Philippin Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng, thường gặp ở các bờ nước, nơi đất ẩm ven rừng, ven đường Ra hoa từ tháng 7 đến tháng 12

- Coix lacryma-jobi L var puellarum Balansa (C.puellarum Balansa) – Bo

bo dại, Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều năm, cao trên 50cm, phân nhánh nhiều, ruột

xốp, nhẵn Lá mềm, phẳng, mép nhăn nheo, đầu nhọn, gốc hình tim, gân mảnh nổi

rõ cả 2 mặt; bẹ lá nhẵn, thuôn dài Cụm hoa ở nách lá hay ngọn thân Bông chét đực

ở trên đỉnh, hợp với cuống chung xếp sát nhau; mày bóng, cứng Bông chét cái có lá

bắc cứng bao bọc, màu trắng tím, bóng Quả có lá bắc phát triển ôm lấy toàn bộ

phần bên trong nhỏ bé, hình cầu,bóng, cứng rắn Cây mọc hoang ở ven đồi thấp ẩm, ven bờ nước hoặc ở trên các rẫy Ra hoa quả gần như quanh năm

- Coix lacryma-jobi L var stenocarpa Oliv: Cây cỏ sống nhiều năm, sống trên cạn hay dưới nước Thân nổi hay nằm, có rễ ở mắt dài đến 30m Lá có phiến, dài 30 – 90cm, rộng 2 – 4cm, mặt trên có lông; cuống không lông Hoa mọc ở kẽ lá,

với bông chét đực thòng, màu xanh Bông chét đực mọc chụm 3 chiếc một chỗ trên cuống chung mảnh Quả cứng, màu vàng hay nâu

Năm 2012, Nguyễn Kim Khanh đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ, chủ yếu là các giống hoang dại có nguồn gốc từ 6 tỉnh ở miền Bắc

Việt Nam (Hà Nội, Quảng Ninh, Điện Biên, Bắc Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn) Các

mẫu Ý dĩ được gieo trồng trong cùng một điều kiện và trong cùng một mùa vụ tại Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được nghiên

cứu xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học, tính đa dạng về di truyền và tính đa dạng về hóa học Kết quả là 6 mẫu Ý dĩ có sự khác biệt và được chia thành 3 nhóm; nhóm 1 gồm các mẫu Ba Vì – Hà Nội, Sơn Động – Bắc Giang

và Văn Quan – Lạng Sơn; nhóm 2 gồm các mẫu Ba Chẽ - Quảng Ninh và Mường

Thanh - Điện Biên và nhóm 3 gồm mẫu Đà Bắc - Hoà Bình Tuy nhiên, số lượng

mẫu nghiên cứu còn ít (6 mẫu); sự khác biệt dựa trên đặc điểm hình thái và nông học không tương đồng với sự khác biệt về di truyền; dựa trên thành phần hoá học, các mẫu Ý dĩ nghiên cứu không khác biệt rõ ràng về thành phần, nhưng sai khác rõ ràng về hàm lượng [11]

1.1.3 Thành phần hóa học

Quả Ý dĩ chứa 50 – 79% tinh bột, 16 – 19% protein, 2 - 7% dầu béo, lipid (5,67% glycolipid, 1,83% phospholipid, sterol…), thiamin, acid amin, adenosine, chất vô cơ,… ; coixenolid (khoảng 0,25%), coixol, α-monolinolein (Hình 1.1) [2]

Rễ Ý dĩ chứa 17,6% protein, 7,2% chất béo, 52% tinh bột, benzoxazolon (chất

dĩ được chiết với aceton ở nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành phân lập và tinh chế

bằng sắc ký cột silicagel thu được hợp chất có công thức C38H70O4, n20

D=1.4705, [α]20

D=0o Hợp chất này có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u được gọi là coixenolide (Hình 1.2)

3 Coixenolid Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Coixenolid

H-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton), 13

C-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

1.1.3.3 Các h ợp chất lactam [29]

Năm 2008, Ming-Yi Lee và cộng sự đã tìm ra 5 hợp chất ức chế tế bào ung

thư từ dịch chiết methanol thân Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L var ma-yuen Stapf) là:

Coixspirolactam A (4), coixspirolactam B (5), coixspirolactam C (6), coixlactam (7)

và methyl dioxindol – 3 – acetat (8) Bột thân Ý dĩ được chiết bằng methanol, cắn tạo thành được lắc với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol Năm hợp

chất trên phân lập từ phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột silicagel và được tinh

chế bằng HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) trên cột Si – 60 Lichrosorb Dựa vào các phương pháp phân tích quang phổ gồm IR (phổ hồng ngoại), 1H-NMR (phổ

cộng hưởng từ hạt nhân proton), 13

C-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13

C), NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều) và MS (phổ khối) người ta xác định

2D-cấu trúc của 5 hợp chất đó (Hình 1.3)

7

NH

1 3

6

5 4 3a

N H

1 2 3 4

3a 4

3

N H

1 2

7 Coixlactam 8 methyl dioxindol – 3 – acetat

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8)

1.1.3.4 Các h ợp chất có tính acid [34]

Năm 1994, Numata M và cộng sự từ dịch chiết aceton của nhân hạt Ý dĩ đã tìm thấy các thành phần có tác dụng ức chế sự tăng trưởng khối u trên chuột Các thành phần này được tách riêng bằng sắc ký cột silicagel và được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích: Quang phổ hồng ngoại và sắc ký lỏng - khí Các thành phần này được xác định là 4 acid béo: Acid palmitic, acid stearic, acid oleic

10 8

N43

Năm 2008, Ming-Yi Lee và cs đã nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào khối u

từ thân Ý dĩ và 5 hợp chất lactam được tách từ dịch chiết MeOH thân Ý dĩ (Coix

bào là A549 – ung thư phổi ở người, HT – 29 (Ung thư tế bào biểu mô trực tràng ở người) và COLO 205 – ung thư tế bào biểu mô ruột bằng phương pháp thử MTT (3 – 4,5 – dimethylthiazol – 2 – yl – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid) Kết quả cho

thấy dịch chiết thân Ý dĩ ở các phân đoạn và 5 hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế tế bào ung thư Tuy nhiên, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế

mạnh hơn các phân đoạn còn lại (IC50 trong phân đoạn ethyl acetat từ 82% đến 153%) [29]

Dịch chiết cồn bột Ý dĩ cũng được báo cáo là làm giảm có ý nghĩa số lượng các tiểu nang bất thường tiền ung thư [30]

Năm 1986, Michiko Takahashi và cs đã phân lập được 3 chất là coixan A, B

và C từ hạt của Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L var ma-yuen) và đã chỉ ra rằng dịch

chiết hạt Ý dĩ và 3 chất này có tác dụng hạ đường huyết trên chuột [35]

Năm 2009, ThS Phùng Thanh Hương và cs đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết thân Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L var ma-yuen Stapf) trên chuột

bình thường, chuột tiêm STZ (Streptozocin) và chuột tiêm adrenalin (Liều 20g dược

liệu khô/kg) Kết quả thu được như sau:

- Trên chuột bình thường: Sau khi cho uống dịch chiết thân cây Ý dĩ và tiến hành xác định nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử ở thời điểm 0h, 1h, 2h, 3h, 4h và 5h thấy glucose huyết không thay đổi theo thời gian

- Trên chuột tiêm STZ: Sau khi tiêm STZ 72h, định lượng glucose huyết lúc đói của chuột, sau đó cho chuột uống dịch chiết Ý dĩ và sau 10 ngày định lượng lại

nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử Tiến hành song song với lô chứng

uống nước cất Kết quả cho thấy nồng độ glucose ở lô thử giảm khoảng 36% Như

vậy dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột tiêm STZ

- Trên chuột tiêm adrenalin: Chuột nhịn đói 12h được cho uống dịch chiết Sau 3h tiêm adrenalin với liều 0.6mg/kg, định lượng glucose huyết ở thời điểm trước khi tiêm và sau khi tiêm 60ph Tiến hành song song với lô chứng uống nước

cất Kết quả cho thấy sau khi tiêm adrenalin liều 0.6mg/kg, glucose huyết của chuột

ở cả 2 lô đều tăng, nhưng ở lô uống dịch chiết, mức tăng glucose huyết (~72%) thấp hơn lô chứng (~125%) Như vậy, dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạn chế tăng glucose huyết bởi tác nhân adrenalin [10]

Năm 2009, Din – Wen Huang và cs đã điều tra những ảnh hưởng của dịch chiết vỏ hạt Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L var ma-yuen Stapf) trên lipopolysaccharide gây ra đáp ứng viêm tại đại thực bào RAW 264.7 và cho thấy dịch chiết vỏ hạt Ý dĩ

có tác dụng chống viêm do chúng chống lại sự gia tăng sản sinh tế bào của nitric oxide và prostaglandin E2 gây ra bởi lipopolysaccharide bằng cách làm giảm sự sản

xuất ra các enzym nitric dioxide synthase và cyclooxygenase [25]

1.1.5 Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ

1.1.5.1 Tính v ị, quy kinh, công năng, chủ trị [14]

- Theo Y học cổ truyền, Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn; quy vào 5 kinh

• Trừ phong thấp, đau nhức, phối hợp với Ma hoàng, Phòng kỷ, Mộc thông

• Thanh nhiệt độc, trừ mủ: Dùng điều trị chứng phế quản hóa mủ (áp xe

phổi) Rễ Ý dĩ kết hợp với Lô căn, Đào nhân, Diếp cá

• Thư cân giải kinh: Dùng khi chân tay bị co quắp

• Giải độc tiêu viêm: Dùng Ý dĩ trong bệnh viêm ruột thừa Phối hợp với Kim ngân hoa trong bệnh nổi mụn ở mặt, trứng cá Hạt Ý dĩ nấu cháo ngày 10g, hoặc phối với thuốc thanh nhiệt giải độc

1.1.5.2 Sử dụng

Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là hạt, còn gọi là Dĩ mễ, Dĩ nhân, Ý dĩ nhân,

hạt Bo bo, Bo bo Ngoài ra, người ta còn dùng thân, rễ để làm thuốc [12]

Do có lượng protid, chất béo và tinh bột khá cao nên quả Ý dĩ được coi là nguồn lương thực có giá trị, đồng thời là một vị thuốc quý Ý dĩ thường được dùng chữa rối loạn tiêu hóa, phù thũng, bí đái, trường ung, tả lỵ, đau bụng, phong thấp lâu ngày không khỏi, gân co quắp khó vận động Nhân dân Việt Nam thường dùng

Ý dĩ làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, nhất là đối với trẻ em Dược liệu thường có mặt trong nhiều đơn thuốc và biệt dược, như 54.5% trong bột bổ tỳ trừ giun, 40% trong

bột cam trẻ em và 10% trong viên Phì nhi liên hoàn hoặc kẹo bổ tỳ Ý dĩ hầm với

hạt Sen và thịt nạc là món ăn – vị thuốc cho những người cơ thể gầy yếu, suy dinh dưỡng [2]

Liều dùng 8 – 30g Thường dùng dưới dạng thuốc sắc Dùng riêng hay kết hợp

với các thuốc khác

1.1.5.3 Một số bài thuốc trong Y học cổ truyền

• Chữa trường ung bụng trướng đầy tiểu tiện khó: Ý dĩ, Qua lâu nhân, mỗi vị

6 – 9g; Mẫu đơn bì, Đào nhân, mỗi vị 6g Sắc nước uống [2]

• Chữa thủy thũng: Ý dĩ, Xích tiểu đậu, Đông qua bì, mỗi vị 30g; Hoàng kỳ,

Phục linh, mỗi vị 15g Sắc nước uống [2]

• Chữa tiểu tiện ra máu: Ý dĩ 20g, nước 600ml, sắc đến khi còn 20ml

Uống liên tục cho đến khi thấy tiểu tiện bình thường là được [12]

• Chữa bệnh phổi, nôn ra máu: Ý dĩ 40g, nước 400ml (2 bát) sắc còn

1 bát (200ml) thêm ít rượu vào uống làm 2 lần trong ngày Uống luôn 10 ngày [12]

• Bổ, chữa lao lực: Ý dĩ 5g, Mạch môn đông 3g, Tang bạch bì 3g, Bách bộ 3g, Thiên môn đông 3g, nước 600ml Sắc còn 200ml chia làm 3 lần uống trong ngày [12]

• Chữa tê thấp: Ý dĩ nhân 40g, Thổ phục linh 20g, nước 600ml sắc còn 200ml Chia làm 2 lần uống trong ngày Uống liền 10 ngày nếu thấy tiểu

tiện nhiều là bệnh giảm [12]

1.1.5.4 M ột số sản phẩm từ Ý dĩ

Thuốc tiêm Kanglaite (KLT) (Hình 1.5) [38] là thuốc chống ung thư mới được chiết xuất từ hạt Ý dĩ FDA (Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm) của Hoa Kỳ đã phê duyệt giai đoạn II thử nghiệm của KLT để kiểm tra hiệu quả của nó trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ Một số nghiên cứu cho thấy nó

có thể ức chế một số gen chống quá trình tự diệt tế bào và kích hoạt một số gen tiền

tự diệt tế bào

Hình 1.5 Thu ốc tiêm Kanglaite

Thuốc tiêm này có thể ức chế đáng kể nhiều loại tế bào ung thư khác nhau, do

đó, nó đã trở thành phần cốt lõi của nghiên cứu là làm thế nào để tiếp tục khám phá thuốc tiêm KLT để thúc đẩy sự tự hủy diệt tế bào khối u bằng cách tác động lên các gen có liên quan [31]

Thuốc tiêm KLT ức chế sự tăng trưởng tế bào HepG2 bằng cách gây chết tế bào thông qua sự kích hoạt con đường Fas/FasL [32]

Tóm lại, các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đã nghiên cứu nhiều tác

dụng và công dụng của cây Ý dĩ, chủ yếu trên thứ Coix lachryma jobi L var

ngoài đã nghiên cứu đa dạng các mẫu Ý dĩ dựa vào dấu vân tay DNA, hay dấu vân tay TLC [26] Ở Việt Nam đã có đề tài nghiên cứu đa dạng sinh học cây Ý dĩ với các chỉ tiêu dấu vân tay DNA, dấu vân tay TLC và đặc điểm hình thái, nông học [11]

1.2 DNA và phương pháp xác định trình tự DNA [6], [8], [15]

1.2.1 Một số tính chất và chức năng của DNA

Cấu tạo của DNA đảm bảo cho nó thực hiện chức năng "giữ" được thông tin

di truyền

DNA là 1 chuỗi xoắn kép Trên mỗi mạch đơn của DNA các Nu liên kết với nhau bằng liên kết phophodieste bền vững Trên 2 mạch của DNA, các Nu liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với T bằng 2 liên kết H, G liên kết với C bằng 3 liên kết H (tuy liên kết H không bền, dễ dàng bị

cắt đứt bởi 1 loại enzym trong quá trình tháo xoắn nhưng với số lượng Nu lớn → làm cho cấu trúc không gian ổn định) Từ 4 loại Nu nhưng do sự sắp xếp khác nhau,

số lượng và thành phần khác nhau, tạo ra sự đa dạng của các phân tử DNA ở các loài sinh vật khác nhau

Tính chất của DNA đảm bảo nó " truyền đạt" được thông tin di truyền: DNA

có khả năng tự nhân đôi, nhờ vậy NST sẽ nhân đôi đảm bảo thông tin di truyền được truyền đạt qua các thế hệ sau DNA chứa các gen cấu trúc, các gen này có khả năng phiên mã để tạo mARN rời từ đó hình thành protein, quy định tính trạng cho sinh vật

DNA có khả năng đột biến, hình thành những thông tin di truyền mới, các thông tin di truyền này tự nhân đôi nhờ cơ chế tái bản của DNA

DNA có sự biến tính thuận nghịch: Khi dung dịch DNA bị đun nóng trên nhiệt độ riêng thì cấu trúc tự nhiên bị phá hủy, hai chuỗi bổ sung tách khỏi nhau

và tạo ra cấu trúc đơn xoắn ngẫu nhiên Nếu làm lạnh nhanh và duy trì nhiệt độ khoảng 25°C dưới Tm trong một khoảng thời gian nhất định thì hai sợi đơn DNA biến tính sẽ bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung

Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (Internal Transcribed Spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid Vùng phiên mã

nội ITS của ADN ribosom (ITS-rADN) được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu phân loại loài của thực vật Vùng ITS có 3 phần: ITS1, 5.8S và ITS2 (Hình 1.6)

với kích thước thay đổi từ 500 đến 700bp

Vùng ITS Hình 1.6 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS

Trình tự nucleotid vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình

tự nucleotid của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế khá phong phú, thuận lợi cho phân tích so sánh Vùng ITS có ưu điểm là: Vùng ITS có độ lặp

lại cao trong ADN nhân của thực vật, sản phẩm PCR của ADN nhân có thể sử dụng cho thông tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài, và vùng ITS có kích thước nhỏ và tính bảo thủ cao nên dễ dàng khuếch đại

1.2.2 Phương pháp xác định trình tự gen

1.2.2.1 Khái niệm

Phương pháp giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA

1.2.2.2 Nguyên tắc: Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau

- Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân

tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau

- Nguyên tắc enzym học: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid cùng

với các deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau

1.2.2.3 Các ph ương pháp giải trình tự gen

a Phương pháp Maxam và Gilbert

- Phương pháp này được thực hiện dựa theo nguyên tắc hóa học

- Các bước thực hiện:

26S ADNr nhân

18S ADNr nhân

• Bước 1: Đánh dấu phóng xạ 32

P ở đầu 5’ của mạch khuôn, biến tính và điện di tách lấy một mạch DNA làm mạch khuôn, cho các xử lý tiếp theo

• Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu (Bảng 1.1)

Có thể sử dụng 4 – 5 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau

Bảng 1.1 Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình tự gen bằng

phương pháp Maxam và Gilbert

1 Dimethyl sunfat Cắt tại G

2 Acid PH = 2 Cắt tại A và G

3 Hydrazin Cắt tại C và T

4 Hydrazin + NaCl Cắt tại C

5 NaOH Cắt tại A hoặc C (A>C)

Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất định các mạch đơn DNA khuôn đã đánh dấu phóng xạ, được xử lý hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA dài

của mạch DNA khuôn

Phương pháp xác định trình tự nucleotid bằng các phản ứng hóa học đặc hiệu

của Maxam và Gilbert có độ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót để chọn một kết quả gần đúng nhất Do đó, phương pháp Maxam và Gilbert ít được ứng dụng trong thực tiễn

b Phương pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid của Sanger và cộng sự

- Phương pháp này được thực hiện theo nguyên tắc enzym học

- Các bước thực hiện:

• Bước 1: Biến tính DNA khuôn, điện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung

ure) để thu các mạch đơn DNA

• Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA

Lấy bốn ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống (Mạch

khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ, enzym ADN polymerase và dNTP (dATP,

dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch đệm thích hợp) Thêm vào mỗi ống tương ứng

một lượng nhỏ (khoảng 1%) một loại ddNTP nhất định: Ống 1 bổ sung 1% ddATP,

ống 2 thêm 1% ddTTP, ống 3 thêm 1% ddGTP và ống 4 thêm 1% ddCTP

• Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn

nhiệt

• Bước 4: Điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch đơn DNA

được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn

Tổng hợp kết quả ở 4 ống, thu được các đoạn mạch đơn hơn kém nhau một

nucleotid, thu được trình tự đoạn mạch đơn mới được tổng hợp và xác định được

trình tự của mạch DNA khuôn

Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có độ chính

xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động

c Giải trình tự DNA bằng máy tự động (Sequencer)

- Nguyên tắc: Máy giải trình tự gen bán tự động hoặc tự động hoàn toàn được

thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh

Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP đánh dấu huỳnh

quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang

khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau

Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA

đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả giúp kiểm

soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao

- Các bước thực hiện:

• Bước 1: Chuẩn bị DNA khuôn, DNA khuôn phải đảm bảo độ tinh sạch cao,

có kích thước thích hợp (thường sử dụng các mẫu DNA đã được tách dòng

• Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp, so sánh kết

quả xác định trình tự ở cả 2 mạch đơn mới, đồng thời căn cứ vào đồ thị để sửa các sai sót và chọn kết quả đúng nhất

1.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

1.3.1 S ắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là dạng nâng cao và tự động hóa của sắc ký lớp mỏng (TLC) cho phép chấm mẫu lên bản mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách Sự cải tiến về kĩ thuật này làm tăng hiệu lực tách

và giảm thời gian phân tích Sự khác nhau giữa TLC và HPTLC ở chỗ kích thước

và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ TLC thường có phạm vi kích thước hạt

từ 10-50 µm, trung bình khoảng 20 µm nhưng với HPTLC phạm vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5 µm Phương pháp đưa mẫu lên bản

mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ chấm mẫu chính xác làm giảm đường kính vết chấm ban đầu Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng hiệu lực tách của peak [1], [17]

1.3.2 Dấu vân tay sắc ký [7],[13], [19]

Để lập dấu vân tay TLC của dược liệu, cần chọn điều kiện chiết, điều kiện chạy sắc kí, pha động, hiện vết Tiến hành chạy nhiều lần để xem xét độ lặp, đặc

hiệu của các vết hiện và tách rõ trên sắc kí đồ Tiến hành chọn lựa vết đặc trưng, lập

bảng Rf và màu sắc các vết cùng sắc kí đồ là dấu vân tay TLC của dược liệu theo điều kiện sắc kí đã chọn

Để xây dựng một dấu vân tay của dược liệu bằng phương pháp HPTLC, ta

chọn các điều kiện chiết mẫu, điều kiện sắc kí như cột, pha động, loại detector phát

hiện thích hợp với các thành phần hóa học của dược liệu đó Tiến hành sắc kí nhiều lần với nhiều mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu để xem xét độ lặp lại, độ tinh khiết

và độ ổn định của các peak được rửa giải trên sắc kí đồ Sau đó tiến hành chọn lựa các peak đăc trưng cho dược liệu, các peak này đảm bảo các yêu cầu sau:

- Peak phải xuất hiện ổn định

- Độ lặp lại tương đối của thời gian lưu phải nhỏ hơn 1%

- Peak có độ tinh khiết cao (>95%)

- Diện tích peak phải tương đối lớn ( >1% tổng diện tích các peak chính)

- Độ phân giải với các peak cạnh không nhỏ hơn 1,0

1.3.3 Ứng dụng HPTLC

- Phương pháp HPTLC dùng để nhận dạng dược liệu bằng cách xây dựng dấu vân tay hóa học của dược liệu Vì mỗi dược liệu có thành phần hóa học với tỷ lệ nhất định các chất và chứa các hoạt chất đặc trưng cho dược liệu đó

- Phương pháp HPTLC còn được dùng để kiểm nghiệm dược liệu, xác định sự

giống nhau và khác nhau giữa thành phần hóa học của dược liệu cần nhận dạng so với dược diệu chuẩn thông qua việc xây dựng dấu vân tay hóa học của dược liệu Qua tổng quan nghiên cứu về cây Ý dĩ đặc biệt là nghiên cứu của Nguyễn Kim Khanh thực hiện năm 2012, chúng tôi tiếp tục mở rộng nghiên cứu đề tài này

để xác định chính xác sự đa dạng sinh học của cây Ý dĩ; số lượng mẫu là 10, trong

đó giữ nguyên 4 mẫu đã được nghiên cứu năm 2012 (Bảng 2.1), và nghiên cứu thêm 6 mẫu có nguồn gốc từ Đạo Trù – Vĩnh Phúc (Y3), Hoàng Mai – Hà Nội (Y4), Thành phố Hải Dương (Y8), Mai Sơn – Sơn La (Y1), Thuận Châu – Sơn La (Y6) và Chiang Rai – Thái Lan (Y5)

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, hoá chất

2.1.1 Nguyên vật liệu

Tổng cộng có 6 mẫu nghiên cứu, được thu thập ở 3 vùng sinh thái Tây Bắc, Đông Bắc, Đồng bằng Sông Hồng và 1 mẫu có nguồn gốc từ Thái Lan (Bảng 2.1)

Nhằm tránh tác động của ngoại cảnh tất cả các mẫu được gieo trồng tại Vườn thực

vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được theo dõi hàng tuần trong giai đoạn từ tháng 12/2012 đến tháng 5/2013 Ngoài ra để so sánh với nghiên

cứu đã thực hiện năm trước, có 4 mẫu được nghiên cứu lặp lại, gồm các mẫu Y2, Y7, Y9 và Y10 (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu nghiên cứu

4 Y4 Hoàng Mai – Hà Nội

5 Y5 Chiang Rai – Thái Lan Cây trồng

9 Y9 Văn Quan – Lạng Sơn X

10 Y10 Yên Sơn – Ba Vì X

2.1.2 Thi ết bị, hóa chất

2.1.2.1 Nghiên c ứu đặc điểm thực vật

- Kính lúp soi nổi Leica EZ4, kính hiển vi Leica CME

- Máy ảnh kĩ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, giấy vẽ đồ thị, kim mũi mác,…

2.1.2.2 Nghiên c ứu hóa học

a Dụng cụ

- Máy HPTLC (Camag), bản mỏng silicagel (CF254)

- Bộ dụng cụ cất hồi lưu, cân phân tích (Shimadzu AY220)

- Thiết bị chiết siêu âm, bình nón dung tích 25ml

- Cốc có mỏ dung tích 100ml,ống đong dung tích 25ml

- Ống nghiệm, pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, tủ sấy

- Lò vi sóng (Saiko), máy điện di (Consort EV222), bộ soi chụp gel (UVP Doc-It) (UV 254)

- Máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems)

- Isopropranol (Merk), cồn 70° (Merk)

- 10X PCR buffer, MgCl2 25mg, dNTPs 10mM mỗi loại

- Tag DNA polymerase (1 U/µl)

- TAE:1 (Pha dung dịch gốc 1Lit TAE:10 gồm Tris base 48,4g; Acid acetic glacial 11,4ml; Na2EDTA 3,7g; pH (8-8.3)

- Agarose

- Ethidiumbromid 10mg/ ml

- 6X loading dye (10mM Tris HCl (pH 7,6), 0,03% Bromophenol Blue, 0,03%

- Xylene cyanol/ FF, 60% glycerol, 60mM EDTA)

- Nước cất pha tiêm

- Cặp mồi ITS1 và ITS4

2.1.3 Ph ần mềm hỗ trợ

- Phần mềm phân loại: Phần mềm PCORD vesion 4, phần mềm PAUP

- Phần mềm xử lý HPTLC: WinCat version 1.7.4

- Phần mềm gióng hàng trình tự nucleotid Bioedit

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên c ứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học

2.2.1.1 Mục đích

Xác định sự đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học của 10 mẫu Ý dĩ (Bảng 2.1) được gieo trồng tại Vườn thực vật, Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

Hình 2.1 Chậu nhựa dùng để trồng các mẫu Ý dĩ

- Chăm sóc các mẫu Ý dĩ và theo dõi các chỉ tiêu nông – sinh học và đặc điểm hình thái từ khi gieo đến ngày 02/05/2013 (mỗi mẫu theo dõi 3 cây lấy kết quả trung bình) Tổng cộng có 20 chỉ tiêu được theo dõi (Bảng 2.2)

B ảng 2.2 Các chỉ tiêu nông – sinh học được theo dõi

TT Chỉ tiêu Đơn vị đo Cách đo lường

1 Số chùm quả/cây Chùm Đếm số chùm quả/cây ở thời điểm

4 Khối lượng 100 quả Gam Cân 100 quả

5 Khối lượng 1000 hạt Gam Cân 1000 hạt

6 Tỷ lệ vỏ trấu/quả % Cân quả, bóc/xát, cân hạt tính tỷ lệ

7 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt % Gieo hạt, tính tỷ lệ nảy mầm

8 Thời gian có lá đầu tiên Ngày Theo dõi hàng ngày

9 Chiều cao theo các tháng Cm Đo chiều cao sau mỗi tháng

10 Số lá theo các tháng Lá Đếm số lá sau mỗi tháng

11 Thời gian đẻ nhánh Tuần Mỗi tuần theo dõi 1 lần

12 Chiều cao ở thời điểm

đẻ nhánh

Cm Đo chiều cao ở thời điểm đẻ nhánh

13 Số lá/thân ở thời điểm

đẻ nhánh

Lá Đếm số lá/thân ở thời điểm đẻ

nhánh

14 Thời gian ra hoa Tuần Mỗi tuần theo dõi 1 lần

15 Chiều cao ở thời điểm ra

hoa

Cm Đo chiều cao ở thời điểm ra hoa

16 Số lá/thân ở thời điểm ra

- Tên khoa học của 10 mẫu Ý dĩ do PGS.TS Trần Văn Ơn (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) thẩm định

- Dựa vào các chỉ tiêu theo dõi được, các đặc điểm khác nhau được mã hóa

tạo thành ma trận dữ liệu và được phân tích bằng phép phân tích chùm (Cluster Analysis), sử dụng phần mềm PCORD

2.2.2 Nghiên cứu đa dạng về di truyền

2.2.2.1 Mục đích

- Xác định sự đa dạng về di truyền dựa vào trình tự DNA của các mẫu Ý dĩ bằng cách so sánh trình tự gen của các mẫu nghiên cứu với nhau hoặc so sánh trình

tự gen của các mẫu nghiên cứu với trình tự gen đã công bố trong ngân hàng gen

quốc tế của chi Coix L

2.2.2.2 Cách làm

- Được tiến hành qua 2 bước sau:

+ Bước 1: Tách DNA Các bước tách DNA được tách theo qui trình 12 bước (Bảng 2.3)

B ảng 2.3 Các bước thực hiên tách DNA từ mẫu lá Ý dĩ

8 Thu dịch nổi Sử dụng micropipette

9 Tủa DNA Sử dụng isopropranol

Bảo quản tủ lạnh sâu 3h giờ

10 Ly tâm 12,000 vòng/phút×30 phút/6°C

11 Lấy tủa, rửa tủa Rửa tủa bằng cồn 70°

12 Bảo quản DNA

Hòa tan trong nước cất tiệt trùng

hoặc TE Bảo quản tủ lạnh sâu

+ Bước 2: Giải trình tự DNA của 10 mẫu Ý dĩ và xử lý kết quả

DNA của 10 mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm Macrogen, Hàn Quốc để

giải trình tự DNA Quá trình giải trình tự DNA được thực hiện trên máy giải trình gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems) Trình tự nucleotid của các mẫu Ý dĩ được so sánh với 7 đoạn trình tự đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế của

chi Coix L bao gồm các đoạn trình tự 300669377, 68164101, 451173147,

451173146, 451173145, 451173144 , 1314374 (Phụ lục 4) Sau khi xử lý, đoạn trình tự nucleotid cuối cùng để đưa vào so sánh là ITS1 – 5.8S – ITS2 Tất cả các trình tự nucleotid được gióng hàng trong phần mềm Bioedit để xác định sự khác nhau giữa các đoạn nucleotid nghiên cứu, và sử dụng phần mềm PAUP để xây dựng cây phân loại

2.2.3 Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp HPTLC

2.2.3.2 Cách làm

a Chiết hoạt chất trong nhân hạt Ý dĩ bằng phương pháp chiết siêu âm

- Nhân hạt Ý dĩ được nghiền thành bột mịn bằng chày cối sứ

- Cân chính xác 0,5gam bột Ý dĩ vào bình nón 25,0ml rồi thêm chính xác

5,0ml dung môi methanol

- Để bình nón vào bể chiết siêu âm, thời gian chiết là 30 phút

- Lọc dịch chiết methanol qua giấy lọc, cô đến cắn rồi thêm 1,0ml

dung môi methanol hòa tan cắn làm dịch chấm sắc ký

b Chạy sắc ký HPTLC

- Chuẩn bị: Bản mỏng silicagel đã hoạt hóa ở 105°C/30 phút, hệ dung môi

chạy sắc ký: Dicholoromethan: ethanol: ethylacetat (95:5:5), thuốc thử hiện màu: Hòa tan 4,0g vanilin trong 200ml ethanol 96°; thêm từ từ 4,0ml acid sulfuric đặc

- Chạy sắc ký:

• Lượng dịch chấm: Mỗi mẫu được chấm lặp lại, lần 1 chấm 1,5μl và lần 2

chấm 3,0μl

• Lượng dung môi cần thiết là 35ml, thời gian bão hòa dung môi là 5 phút

• Thời gian treo bản mỏng: 5 phút

• Thời gian triển khai sắc ký: 7 phút

• Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút

• Nhúng bản mỏng trong thuốc thử hiện màu, rồi sấy ở 105°C/5 phút

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Win Cat version 1.7.4

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học

3.1.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu Ý dĩ ở thời điểm ngày 02/05/2013 3.1.1.1 Mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La)

Thân hình trụ, cao 115cm, màu xanh nhạt, phân nhánh, chia thành nhiều đốt, đường kính thân 0,8cm Lá màu xanh đậm, hình mác, hơi hẹp, thuôn dài, đầu nhọn, dài 50-55cm, rộng 3-4cm Bẹ lá không lông, dài 15cm; gân song song, gân giữa nổi

to và gân 2 bên mảnh

Hoa đơn tính cùng gốc, cuống hoa dài 5-6mm Trên bông chét đực có nhiều hoa đực mọc thành chùm gồm 2-3 hoa đực, trong đó có một hoa đực có cuống mảnh Nhị 3 rời đều màu vàng Bông chét cái hình cầu được bao bọc bởi 1 lá bắc rất dày,cứng, màu xanh xám hay màu tím nhạt, dài 8-9 mm, đường kính 5-6mm Bầu

nhụy hình bầu dục, màu trắng xanh, dài 3-4mm, đường kính 1-2mm; vòi nhụy màu tím, có lông bao phủ; 2 nhị lép màu trắng xanh

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La)

1: Một bông nhỏ; 2: Bông hoa đực; 3: Một hoa đực nguyên vẹn; 4: Mày lớn hoa đực; 5: Một bao phấn; 6: Hoa cái; 7: Hoa cái (phải) và mày chung của cụm hoa

(trái); 8: Bộ nhụy

- Tên khoa h ọc: Mẫu được thẩm định có tên khoa học là Coix lacryma-jobi

L var mayuen (Rom) Stapf (C.chinensis Todaro ex Balansa)

3.1.1.2 Mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình)