CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
Tổng cộng có 6 mẫu nghiên cứu, được thu thập ở 3 vùng sinh thái Tây Bắc,
Đông Bắc, Đồng bằng Sông Hồng và 1 mẫu có nguồn gốc từ Thái Lan (Bảng 2.1). Nhằm tránh tác động của ngoại cảnh tất cả các mẫu được gieo trồng tại Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được theo dõi hàng tuần trong giai đoạn từ tháng 12/2012 đến tháng 5/2013. Ngoài ra để so sánh với nghiên cứu đã thực hiện năm trước, có 4 mẫu được nghiên cứu lặp lại, gồm các mẫu Y2, Y7, Y9 và Y10 (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu nghiên cứu TT Mã số
mẫu
Địa điểm thu mẫu Đã được nghiên cứu năm 2012
Ghi chú
1 Y1 Mai Sơn – Sơn La (Sơn La 1) Cây trồng
thương mại
2 Y2 Đà Bắc – Hòa Bình X
3 Y3 Đạo Trù – Vĩnh Phúc
4 Y4 Hoàng Mai – Hà Nội
5 Y5 Chiang Rai – Thái Lan Cây trồng
thương mại
6 Y6 Thuận Châu – Sơn La (Sơn La 2) Cây trồng
thương mại
7 Y7 Mường Thanh – Điện Biên X
8 Y8 Thành phố Hải Dương
9 Y9 Văn Quan – Lạng Sơn X
10 Y10 Yên Sơn – Ba Vì X
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
- Kính lúp soi nổi Leica EZ4, kính hiển vi Leica CME.
- Máy ảnh kĩ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, giấy vẽ đồ thị, kim mũi mác,…
2.1.2.2. Nghiên cứu hóa học
a. Dụng cụ
- Máy HPTLC (Camag), bản mỏng silicagel (CF254). - Bộ dụng cụ cất hồi lưu, cân phân tích (Shimadzu AY220). - Thiết bị chiết siêu âm, bình nón dung tích 25ml.
- Cốc có mỏ dung tích 100ml,ống đong dung tích 25ml. - Ống nghiệm, pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, tủ sấy. - Cốc chạy sắc ký lớp mỏng, giấy lọc,…
b. Hóa chất
- Methanol, ethanol 96°, ethanol tuyệt đối, dichloromethan, ethylacetat, acid sulfuric đặc, vanilin.
2.1.2.3. Nghiên cứu sinh học phân tử a. Dụng cụ
- Cối chày, nitơ lỏng, tủ ấm, máy li tâm (Eppendorf 5415R), tủ sấy dụng cụ. - Ống eppendoff (2ml; 1,5ml; 0,2ml), micropipette (1000, 200, 100, 20,
10µl).
- Lò vi sóng (Saiko), máy điện di (Consort EV222), bộ soi chụp gel (UVP Doc-It) (UV 254).
- Máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). b. Hóa chất
- CTAB buffer (Gồm NaCl 1.4 M, CTAB 2%, PVP 1%, Na2EDTA 20mM,Tris Base 0.1 M) (Sigma).
- Dung dịch 24:1 (Gồm Chloroform : isoarylalcohol = 24:1). - Nitơ lỏng, SDS 10%.
- Isopropranol (Merk), cồn 70° (Merk).
- Tag DNA polymerase (1 U/µl).
- TAE:1 (Pha dung dịch gốc 1Lit TAE:10 gồm Tris base 48,4g; Acid acetic glacial 11,4ml; Na2EDTA 3,7g; pH (8-8.3).
- Agarose.
- Ethidiumbromid 10mg/ ml.
- 6X loading dye (10mM Tris HCl (pH 7,6), 0,03% Bromophenol Blue, 0,03%.
- Xylene cyanol/ FF, 60% glycerol, 60mM EDTA). - Nước cất pha tiêm.
- Cặp mồi ITS1 và ITS4.