1.3.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là dạng nâng cao và tự động hóa của sắc ký lớp mỏng (TLC) cho phép chấm mẫu lên bản mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách. Sự cải tiến về kĩ thuật này làm tăng hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích. Sự khác nhau giữa TLC và HPTLC ở chỗ kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ. TLC thường có phạm vi kích thước hạt từ 10-50 µm, trung bình khoảng 20 µm nhưng với HPTLC phạm vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5 µm. Phương pháp đưa mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ chấm mẫu chính xác làm giảm đường kính vết chấm ban đầu. Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng hiệu lực tách của peak [1], [17].
1.3.2. Dấu vân tay sắc ký [7],[13], [19]
Để lập dấu vân tay TLC của dược liệu, cần chọn điều kiện chiết, điều kiện chạy sắc kí, pha động, hiện vết. Tiến hành chạy nhiều lần để xem xét độ lặp, đặc hiệu của các vết hiện và tách rõ trên sắc kí đồ. Tiến hành chọn lựa vết đặc trưng, lập
bảng Rf và màu sắc các vết cùng sắc kí đồ là dấu vân tay TLC của dược liệu theo điều kiện sắc kí đã chọn.
Để xây dựng một dấu vân tay của dược liệu bằng phương pháp HPTLC, ta chọn các điều kiện chiết mẫu, điều kiện sắc kí như cột, pha động, loại detector phát hiện thích hợp với các thành phần hóa học của dược liệu đó. Tiến hành sắc kí nhiều lần với nhiều mẫu thử và mẫu chuẩn đối chiếu để xem xét độ lặp lại, độ tinh khiết và độ ổn định của các peak được rửa giải trên sắc kí đồ. Sau đó tiến hành chọn lựa các peak đăc trưng cho dược liệu, các peak này đảm bảo các yêu cầu sau:
- Peak phải xuất hiện ổn định.
- Độ lặp lại tương đối của thời gian lưu phải nhỏ hơn 1%. - Peak có độ tinh khiết cao (>95%)
- Diện tích peak phải tương đối lớn ( >1% tổng diện tích các peak chính). - Độ phân giải với các peak cạnh không nhỏ hơn 1,0.