CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học
2.2.1.1. Mục đích
Xác định sự đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học của 10 mẫu Ý dĩ (Bảng 2.1) được gieo trồng tại Vườn thực vật, Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.2.1.2. Cách làm
- Thu mẫu: Tiến hành thu trực tiếp hạt trên cây. Chọn hạt chắc, hong đến khô ở điều kiện thường, dùng làm giống.
- Gieo hạt: Hạt của 10 mẫu Ý dĩ (Bảng 2.1) được ngâm trong nước ấm 4-6 tiếng (3 sôi/2 lạnh) và được gieo trong các chậu nhựa đã được chuẩn bị sẵn đất (Hình 2.1). Mỗi mẫu gieo 15 hạt.
Hình 2.1. Chậu nhựa dùng để trồng các mẫu Ý dĩ
- Chăm sóc các mẫu Ý dĩ và theo dõi các chỉ tiêu nông – sinh học và đặc điểm hình thái từ khi gieo đến ngày 02/05/2013 (mỗi mẫu theo dõi 3 cây lấy kết quả trung bình). Tổng cộng có 20 chỉ tiêu được theo dõi (Bảng 2.2)
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu nông – sinh học được theo dõi TT Chỉ tiêu Đơn vị đo Cách đo lường
1. Số chùm quả/cây Chùm Đếm số chùm quả/cây ở thời điểm thu hoạch
2. Số quả/chùm Quả Đếm số quả/chùm ở thời điểm thu
hoạch
3. Số quả/cây Quả Đếm số quả/cây vào thời điểm thu
hoạch
4. Khối lượng 100 quả Gam Cân 100 quả 5. Khối lượng 1000 hạt Gam Cân 1000 hạt
6. Tỷ lệ vỏ trấu/quả % Cân quả, bóc/xát, cân hạt tính tỷ lệ 7. Tỷ lệ nẩy mầm của hạt % Gieo hạt, tính tỷ lệ nảy mầm 8. Thời gian có lá đầu tiên Ngày Theo dõi hàng ngày
9. Chiều cao theo các tháng Cm Đo chiều cao sau mỗi tháng 10. Số lá theo các tháng Lá Đếm số lá sau mỗi tháng 11. Thời gian đẻ nhánh Tuần Mỗi tuần theo dõi 1 lần 12. Chiều cao ở thời điểm
đẻ nhánh
Cm Đo chiều cao ở thời điểm đẻ nhánh
13. Số lá/thân ở thời điểm đẻ nhánh
Lá Đếm số lá/thân ở thời điểm đẻ nhánh
14. Thời gian ra hoa Tuần Mỗi tuần theo dõi 1 lần 15. Chiều cao ở thời điểm ra
hoa
Cm Đo chiều cao ở thời điểm ra hoa
16. Số lá/thân ở thời điểm ra hoa
Lá Đếm số lá/thân ở thời điểm ra hoa
17. Số nhánh/thân ở thời điểm ra hoa
Nhánh Đếm số nhánh/thân ở thời điểm ra hoa
18. Chiều dài gióng cây trưởng thành
Cm Đo chiều dài gióng ở thời điểm ra hoa
19. Số gióng cây trưởng thành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gióng Đếm số gióng/thân ở thời điểm ra hoa
20. Tổng số lá/cây Lá Tính từ khi mọc đến khi đạt số lá cuối cùng, đánh dấu các lá để đếm
- Đặc điểm thực vật: Mô tả theo phương pháp mô tả chẩn đoán, chỉ tập trung vào các đặc điểm khác biệt quan sát được trên tất cả các mẫu nghiên cứu [3], [4].
- Tên khoa học của 10 mẫu Ý dĩ do PGS.TS. Trần Văn Ơn (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) thẩm định.
- Dựa vào các chỉ tiêu theo dõi được, các đặc điểm khác nhau được mã hóa tạo thành ma trận dữ liệu và được phân tích bằng phép phân tích chùm (Cluster Analysis), sử dụng phần mềm PCORD.
2.2.2. Nghiên cứu đa dạng về di truyền
2.2.2.1. Mục đích
- Xác định sự đa dạng về di truyền dựa vào trình tự DNA của các mẫu Ý dĩ bằng cách so sánh trình tự gen của các mẫu nghiên cứu với nhau hoặc so sánh trình tự gen của các mẫu nghiên cứu với trình tự gen đã công bố trong ngân hàng gen quốc tế của chi Coix L.
2.2.2.2. Cách làm
- Được tiến hành qua 2 bước sau:
+ Bước 1: Tách DNA. Các bước tách DNA được tách theo qui trình 12 bước (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Các bước thực hiên tách DNA từ mẫu lá Ý dĩ TT Quy trình thực hiện Yêu cầu Ghi chú
1 Chuẩn bị mẫu lá Lá bánh tẻ (0,04g)
2 Nghiền Sử dụng Nitơ lỏng Lấy 1/2 ống
3 Bổ sung: 800µl CTAB
buffer và 56µl SDS Lắc đều
4 Ủ máy cách thủy 65°C/ 60 phút Kiểm tra, lắc
đều 5 Để nguội ở nhiệt độ phòng 6 Bổ sung hỗn hợp 24:1 800 µl Lặp lại 1 lần từ b6-b8 7 Ly tâm 11000 vòng /phút×30phút/6°C
8 Thu dịch nổi Sử dụng micropipette
Bảo quản tủ lạnh sâu 3h giờ
10 Ly tâm 12,000 vòng/phút×30 phút/6°C
11 Lấy tủa, rửa tủa Rửa tủa bằng cồn 70°
12 Bảo quản DNA
Hòa tan trong nước cất tiệt trùng hoặc TE
Bảo quản tủ lạnh sâu.
+ Bước 2: Giải trình tự DNA của 10 mẫu Ý dĩ và xử lý kết quả
DNA của 10 mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm Macrogen, Hàn Quốc để giải trình tự DNA. Quá trình giải trình tự DNA được thực hiện trên máy giải trình gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Trình tự nucleotid của các mẫu Ý dĩ được so sánh với 7 đoạn trình tự đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế của chi Coix L. bao gồm các đoạn trình tự 300669377, 68164101, 451173147, 451173146, 451173145, 451173144 , 1314374 (Phụ lục 4). Sau khi xử lý, đoạn trình tự nucleotid cuối cùng để đưa vào so sánh là ITS1 – 5.8S – ITS2. Tất cả các trình tự nucleotid được gióng hàng trong phần mềm Bioedit để xác định sự khác nhau giữa các đoạn nucleotid nghiên cứu, và sử dụng phần mềm PAUP để xây dựng cây phân loại.
2.2.3. Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp HPTLC
2.2.3.1. Mục đích
- Dựa vào sự tương đồng peak sắc ký của các mẫu Ý dĩ sau khi tiến hành HPTLC để chia thành các nhóm khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sơ bộ đánh giá sự khác biệt về hàm lượng của các hoạt chất có trong hạt của các mẫu Ý dĩ dựa trên việc so sánh diện tích của các vết có cùng Rf xuất hiện trên sắc ký đồ sau khi tiến hành HPTLC.
2.2.3.2. Cách làm
a. Chiết hoạt chất trong nhân hạt Ý dĩ bằng phương pháp chiết siêu âm - Nhân hạt Ý dĩ được nghiền thành bột mịn bằng chày cối sứ.
5,0ml dung môi methanol.
- Để bình nón vào bể chiết siêu âm, thời gian chiết là 30 phút. - Lọc dịch chiết methanol qua giấy lọc, cô đến cắn rồi thêm 1,0ml dung môi methanol hòa tan cắn làm dịch chấm sắc ký.
b. Chạy sắc ký HPTLC
- Chuẩn bị: Bản mỏng silicagel đã hoạt hóa ở 105°C/30 phút, hệ dung môi chạy sắc ký: Dicholoromethan: ethanol: ethylacetat (95:5:5), thuốc thử hiện màu: Hòa tan 4,0g vanilin trong 200ml ethanol 96°; thêm từ từ 4,0ml acid sulfuric đặc.
- Chạy sắc ký:
• Lượng dịch chấm: Mỗi mẫu được chấm lặp lại, lần 1 chấm 1,5μl và lần 2 chấm 3,0μl.
• Lượng dung môi cần thiết là 35ml, thời gian bão hòa dung môi là 5 phút
• Thời gian treo bản mỏng: 5 phút.
• Thời gian triển khai sắc ký: 7 phút.
• Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút.
• Nhúng bản mỏng trong thuốc thử hiện màu, rồi sấy ở 105°C/5 phút. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Win Cat version 1.7.4.