Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm và nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu của thân cây ý dĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẢO XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA THÂN CÂY Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẢO XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA THÂN CÂY Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quỳnh Chi TS. Nguyễn Thùy Dƣơng HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS. Nguyễn Thùy Dƣơng, TS. Nguyễn Hoàng Anh và TS. Phƣơng Thiện Thƣơng là những thầy cô đã trực tiếp hƣớng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Trƣờng Cao đẳng Dƣợc TW Hải Dƣơng đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dƣợc liệu, Bộ môn Dƣợc lý - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Bộ môn Dƣợc liệu – Trƣờng Cao đẳng Dƣợc TW Hải Dƣơng và phòng hóa phân tích - Viện Dƣợc Liệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm luận văn. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dƣợc liệu, Bộ môn Dƣợc lý - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Bộ môn Dƣợc liệu – Trƣờng Cao đẳng Dƣợc TW Hải Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp và những ngƣời thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 8 năm 2014. Học viên Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Đặt vấn đề 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Bệnh lý sỏi tiết niệu 3 1.1.1. Định nghĩa bệnh lý sỏi tiết niệu 3 1.1.2. Đặc điểm dịch tễ 3 1.1.3. Phân loại và thành phần cấu tạo sỏi tiết niệu 3 1.1.4. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh sỏi tiết niệu 4 1.1.5. Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu 5 1.1.5.1. Điều trị ngoại khoa 5 1.1.5.2. Điều trị nội khoa 6 1.1.5.3. Phòng chống tái phát 6 1.2. Vai trò của dƣợc liệu trong điều trị sỏi tiết niệu 7 1.3. Cây Ý dĩ 11 1.3.1. Vị trí phân loại 11 1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 11 1.3.3. Công dụng theo Y học cổ truyền 12 1.3.4. Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của Ý dĩ 12 1.3.4.1. Thành phần hóa học 13 1.3.4.2. Tác dụng dƣợc lý 18 1.3.5. Các nghiên cứu trong nƣớc về thân Ý dĩ 18 1.3.5.1. Thành phần hóa học 18 1.3.5.2. Tác dụng dƣợc lý 20 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 22 2.1.1. Nguyên vật liệu 22 2.1.2. Thiết bị 23 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 24 2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học 24 2.3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về hóa học 25 2.3.2. Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 29 2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 34 3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học 34 3.1.1.1. Đặc điểm vi phẫu 34 3.1.1.2. Đặc điểm bột dƣợc liệu 35 3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về hóa học 38 3.1.2.1. Định tính các nhóm chất chính bằng các phản ứng hóa học 38 3.1.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 39 3.1.2.3. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 40 3.2. Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 55 3.2.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến thể tích nƣớc tiểu 55 3.2.2. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến pH nƣớc tiểu 55 3.2.3. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu 56 3.2.4. Tác dụng ức chế sự lắng đọng tinh thể calci oxalat trong thận của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75% 59 Chƣơng 4. BÀN LUẬN 61 4.1. Về xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 61 4.2. Về đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 I. Kết luận 65 II. Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A S : Hệ số đối xứng pic CaOx: Calci oxalat CE-MS: Capillary Electrophoresis with Mass Spectrometry COD: Calci oxalat dihydrat COM: Calci oxalat monohydrat DAD: Detector mảng Diod (Diode-Array Detector) EG: Ethylen glyol ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry EtOAc: Ethyl acetat HPLC: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IC 50 : nồng độ ức chế 50% LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) MeOH: Methanol MS: Mass Spectroscopy R S : Độ phân giải r: Hệ số tƣơng quan RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) SKLM: Sắc kí lớp mỏng T R : thời gian lƣu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về tác dụng của dƣợc liệu trong điều trị sỏi tiết niệu. 8 Bảng 1.2. Một số bài thuốc / dƣợc liệu trong nƣớc đã đƣợc nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu. 9 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của hạt Ý dĩ 14 Bảng 1.4. Thành phần hóa học của rễ cây Ý dĩ 18 Bảng 2.1. Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ 26 Bảng 2.2. Thang điểm phản ánh số lƣợng tinh thể niệu trung bình 32 Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất trong các mẫu thân Ý dĩ 38 Bảng 3.2. Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2 41 Bảng 3.3. Chƣơng trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient 43 Bảng 3.4. Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient 43 Bảng 3.5. Các thông số HPLC của chƣơng trình dung môi 1 và 2 44 Bảng 3.6. Các thông số HPLC của hệ acid 1 và hệ acid 2 45 Bảng 3.7. Chƣơng trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient 46 Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 47 Bảng 3.9. Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính 48 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát đƣờng chuẩn 49 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 50 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu 1 51 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi 52 Bảng 3.14. Kết quả định lƣợng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ 53 Bảng 3.15. Hàm lƣợng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric trong các mẫu Ý dĩ 54 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân cây Ý dĩ đến thể tích nƣớc tiểu (ml) 55 Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu 57 Bảng 3.18. Điểm đánh giá về số lƣợng ống thận có kết tập sỏi 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Thành phần hóa học của thân cây Ý dĩ 19 Hình 2.1. Cây Ý dĩ 22 Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo 31 Hình 3.1. Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi L. . 34 Hình 3.2. Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf 35 Hình 3.3. Đặc điểm bột thân của Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi L. 36 Hình 3.4. Đặc điểm bột thân Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf 37 Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết thân Ý dĩ với hệ dung môi Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1) quan sát ở UV 254 nm (A), 366 nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin - acid sulfuric (C) 39 Hình 3.6. Sắc kí đồ hệ dung môi 1 Hình 3.7. Sắc kí đồ hệ dung môi 2 41 Hình 3.8. Sắc kí đồ chƣơng trình dung môi 1 Hình 3.9. Sắc kí đồ chƣơng trình dung môi 2 43 Hình 3.10. Sắc kí đồ của hệ acid 1 Hình 3.11. Sắc kí đồ của hệ acid 2 45 Hình 3.12. Sắc kí đồ HPLC của mẫu dƣợc liệu 1 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu. 46 Hình 3.13. Đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy của acid p-coumaric 48 Hình 3.14. Sắc kí đồ HPLC của các mẫu dƣợc liệu và mẫu acid p-coumaric đối chiếu 54 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của dịch chiết toàn phần thân cây Ý dĩ đến pH nƣớc tiểu chuột 56 Hình 3.16. Hình ảnh tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu ở vật kính 40x 58 Hình 3.17. Hình ảnh vi thể thận chuột ở vật kính 10x và 40x 60 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sỏi tiết niệu là tình trạng bệnh lý đã đƣợc đề cập đến từ rất lâu trong y văn và là một bệnh mạn tính, hay gặp, hay tái phát với tỷ lệ mắc bệnh lớn khoảng 2 - 12% trong cộng đồng dân cƣ [19]. Sỏi gây tắc nghẽn đƣờng tiết niệu mà hậu quả có thể dẫn đến ứ nƣớc thận và hoại tử tổ chức thận, gây nhiễm khuẩn và gây đau, ảnh hƣởng đến sức khỏe và tính mạng của ngƣời bệnh [9]. Trên thế giới có những vùng có tỷ lệ sỏi tiết niệu cao gọi là vành đai sỏi. Việt Nam cũng nằm trong vùng vành đai sỏi của thế giới [19]. Các phƣơng pháp ngoại khoa điều trị sỏi tiết niệu đã tạo những bƣớc tiến đáng kể tuy nhiên lại gây ra nhiều biến chứng, đặc biệt chƣa cải thiện đƣợc tình trạng tái phát sỏi. Trong khi đó, vai trò của điều trị nội khoa trong bệnh lý sỏi tiết niệu vẫn còn rất hạn chế. Việt Nam có nguồn dƣợc liệu rất phong phú và đã có nhiều dƣợc liệu đƣợc nhân dân ta sử dụng với kinh nghiệm dân gian để điều trị sỏi tiết niệu. Tuy nhiên, mới có rất ít dƣợc liệu đƣợc nghiên cứu đầy đủ trên mô hình dƣợc lý thực nghiệm cũng nhƣ trên lâm sàng. Ý dĩ là loài cây bản địa ở Việt Nam đƣợc trồng từ thời cổ xƣa nhƣ một cây thuốc quý. Trong khi hạt Ý dĩ đã đƣợc nhân dân ta sử dụng từ lâu vừa nhƣ một loại thực phẩm vừa nhƣ một vị thuốc có tác dụng bồi bổ cơ thể thì phần thân Ý dĩ thƣờng không đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây của chúng tôi cho thấy thân Ý dĩ cũng là một nguồn dƣợc liệu rất đáng đƣợc quan tâm. Chúng tôi đã sƣu tầm đƣợc một bài thuốc sử dụng trong dân gian để điều trị sỏi tiết niệu gồm ba vị: thân cây Ý dĩ, lá cây Bồ đề, phần trên mặt đất của cây Xấu hổ. Những nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho thấy dịch chiết nƣớc thân Ý dĩ có tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro. Để có thể đƣa thân Ý dĩ vào sử dụng trong điều trị sỏi tiết niệu, cần có những nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học cũng nhƣ cần có các tiêu chuẩn để kiểm nghiệm dƣợc liệu này. [...]... tài Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm và nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1 Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm về mặt vi học và hóa học thân Ý dĩ 2 Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của thân Ý dĩ 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lý sỏi tiết niệu 1.1.1 Định nghĩa bệnh lý sỏi tiết niệu Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện... dung nghiên cứu  Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ:  Về đặc điểm vi học  Về thành phần hóa học: - Định tính bằng phản ứng hóa học - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng - Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC  Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ. .. cây Ý dĩ 19 1.3.5.2 Tác dụng dƣợc lý Các nghiên cứu trong nƣớc về thân Ý dĩ tập trung chủ yếu theo hai hƣớng: tác dụng hạ đƣờng huyết và tác dụng trên sỏi tiết niệu  Về tác dụng hạ đƣờng huyết, nhóm nghiên cứu của Phùng Thanh Hƣơng và cộng sự đã đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết nƣớc thân Ý dĩ đến nồng độ đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng bình thƣờng và chuột nhắt trắng gây tăng đƣờng huyết bởi các tác. .. đƣợc nghiên cứu với nhiều định hƣớng sinh học khác nhau nhƣ tác dụng chống ung thƣ [63], [65]; tác dụng chống dị ứng [45]; tác dụng trên nội tiết [55], [56], [61]; tác dụng chống oxy hóa [62]; tác dụng trên chuyển hóa glucose và lipid máu [54], [57], [72]  Rễ Ý dĩ có tác dụng chống viêm [67] Hiện chƣa có nghiên cứu nào trên thế giới công bố về thành phần hóa học cũng nhƣ tác dụng sinh học của thân Ý dĩ. .. hạn chế và khả năng dung nạp kém Vì vậy, việc tìm kiếm các phƣơng pháp điều trị thay thế khác đặc biệt là sử dụng dƣợc liệu đang là vấn đề đƣợc quan tâm hiện nay [38], [64] Những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học về tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của các dƣợc liệu Một số nghiên cứu về tác dụng trong điều trị sỏi tiết niệu của một số dƣợc liệu trên thế giới và Việt... Juzep.[64] Một số dƣợc liệu chứa saponin có tác dụng phân rã hệ thống treo mucoprotein-là tác nhân thúc đẩy sự kết tinh Một số dƣợc liệu có đặc tính kháng khuẩn, bảo vệ lớp chất dính của niêm mạc, do đó có vai trò nhƣ một hàng rào bảo vệ sỏi tiết niệu [53] Một số dƣợc liệu có tác dụng thăng bằng các chất điện giải, chất khoáng giống nhƣ tác dụng của hệ thống nội tiết bao gồm prostaglandin và các chất... COD và sỏi urat, ít có tác dụng trên sỏi COM và sỏi cystin Hơn nữa, các phƣơng pháp này còn gây nhiều tác dụng không mong muốn nhƣ tăng huyết áp, xuất huyết, hoại tử ống thận, tắc nghẽn niệu quản, nhiễm trùng, xơ hóa thận dẫn đến tổn thƣơng tế bào và những mảnh sỏi sót lại là điều kiện thuận lợi tái phát sỏi [60] Hiện có rất ít tác nhân dƣợc lý có thể lựa chọn để điều trị sỏi tiết niệu Muối citrat và. .. Ý dĩ 2.3.1.1 Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học Nghiên cứu đặc điểm vi học của thân Ý dĩ đƣợc tiến hành trên nhiều mẫu và trên cả 2 thứ khác nhau đó là Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L và Coix lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf theo phƣơng pháp trong tài liệu [2], [7], [30] Từ đó đƣa ra các tiêu chuẩn cụ thể để kiểm nghiệm dƣợc liệu về mặt vi học  Đặc điểm vi phẫu thân Ý dĩ - Chọn mẫu:... balbisiana [26] [25] In vitro Làm mòn sỏi và styracifolium (Osb.) Merr.) 6 Kim tiền thảo (Desmodium In vivo lợi tiểu Rau om (Limnophila In vivo Làm giãn cơ giúp [25] giảm đau aromatica (Lamk.) Merr.) Cơ chế tác dụng trên sỏi tiết niệu của các dƣợc liệu cũng đã đƣợc nghiên cứu: Một số dƣợc liệu có tác dụng điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu là do có vai trò “hòa tan” (bào mòn) sỏi nhƣ Bergenia ciliata (Haw.)... chiết chloroform thân cây Ý dĩ (16,5mg/kg) glucose huyết hạ 30,38 % so với thời điểm ban đầu Cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ là do: làm giảm tính kháng insulin, tăng nhạy cảm với insulin; ức chế quá trình tân tạo glucose ở gan; tăng dung nạp glucose vào trong tế bào [14]  Theo định hƣớng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã . đề tài Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm và nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm về. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 24 2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học 24 2.3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về. trình nghiên cứu của các nhà khoa học về tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của các dƣợc liệu. Một số nghiên cứu về tác dụng trong điều trị sỏi tiết niệu của một số dƣợc liệu trên thế giới và Việt