2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học
Nghiên cứu đặc điểm vi học của thân Ý dĩ đƣợc tiến hành trên nhiều mẫu và trên cả 2 thứ khác nhau đó là Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi L. và Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf theo phƣơng pháp trong tài liệu [2], [7], [30]. Từ đó đƣa ra các tiêu chuẩn cụ thể để kiểm nghiệm dƣợc liệu về mặt vi học.
Đặc điểm vi phẫu thân Ý dĩ
- Chọn mẫu: sau khi thu hái, chọn nhiều mẫu thân không quá già hoặc quá non, ngâm trong hỗn hợp nƣớc – glycerin – ethanol (1:1:1) để làm mềm và bảo quản.
- Cắt tiêu bản bằng máy cắt cầm tay.
- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung nƣớc Javen, rửa sạch bằng nƣớc, tẩy tiếp bằng chloralhyrdrat 75%, rửa lại bằng nƣớc, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nƣớc đến hết acid. Sau đó tiến hành nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylen.
- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dƣới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn máy ảnh.
25
-Sấy khô dƣợc liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng dao cầu cắt nhỏ rồi nghiền bằng thuyền tán. Rây lấy bột mịn.
-Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
-Lên tiêu bản bột dƣợc liệu bằng nƣớc cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi có gắn máy ảnh. Ảnh các đặc điểm đƣợc chuyển vào máy vi tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh.
2.3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về hóa học
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học
Sử dụng các phản ứng hóa học thƣờng quy nhƣ mô tả trong tài liệu [6] để xác định một số nhóm chất chính có trong thân Ý dĩ. Cách tiến hành nhƣ ở phụ lục 2 và đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1
26 Bảng 2.1. Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ STT Nhóm chất Các phản ứng hóa học định tính 1 Glycosid tim - Phản ứng Lieberman- Burchardat - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller- Kiliani 2 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt
3 Anthranoid - Phản ứng Borntraeger - Vi thăng hoa
4
Flavonoid
- Phản ứng Cyanidin
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10% - Phản ứng diazo hóa
- Phản ứng với FeCl3
5 Coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton - Phản ứng diazo hóa
- Quan sát huỳnh quang
6 Tanin
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% - Phản ứng với dung dịch gelatin 1% - Phản ứng với chì acetat 10 %
7 Alcaloid
- Phản ứng với TT. Mayer - Phản ứng với TT Bouchardat - Phản ứng với TT Dragendorff 8 Acid hữu cơ - Phản ứng với tinh thể Na2CO3
9 Đƣờng khử - Phản ứng với thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B 10 Acid amin - Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3 %
11 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol 12 Chất béo Vết mờ để lại trên giấy lọc 13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc
27
Từ kết quả định tính đƣa ra phƣơng pháp kiểm nghiệm dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 5g dƣợc liệu cho vào bình nón, thêm MeOH 80% ngập dƣợc liệu, ngâm lạnh 24h, lọc lấy dịch chiết MeOH, cô đến cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 10ml nƣớc rồi đem chiết với EtOAc (2 lần x 10ml). Dịch chiết ethyl acetat đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan, bay hơi dung môi đến cắn. Lấy cắn hòa tan trong 5ml MeOH để đƣợc dung dịch chấm sắc kí.
- Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: hòa tan acid p-coumaric trong MeOH để đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 1mg/ml.
- Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck). Bản mỏng đƣợc hoạt hóa ở 1100C trong 1h .
- Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1)
- Đưa chất lên bản mỏng: 10 µL mẫu thử; 0,5 µL chất đối đƣợc đƣa lên bản mỏng dƣới dạng vạch dài 8mm.
- Khai triển: 10 cm
- Làm khô: trong không khí.
- Quan sát: dƣới ánh sáng tử ngoại ở 2 bƣớc sóng 254 nm và 365 nm
- Hiện màu: sử dụng thuốc thử vanillin/acid sulfuric, sấy bản mỏng ở 1100C trong 5 phút. Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng.
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC
Khảo sát quá trình xử lí mẫu
Dựa vào độ tan của acid p-coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù hợp. Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu tiếp theo để loại tạp chất trong dịch chiết.
Khảo sát điều kiện sắc kí
Phép phân tích đƣợc thực hiện trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS.
28
Điều kiện khảo sát ban đầu đƣợc tiến hành dựa trên kết quả định lƣợng acid p-coumaric bằng phƣơng pháp HPLC trong cây Leptadinia reticulate của Geetha và cộng sự [51]. Tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí trên cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo sát chƣơng trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải gradient (gradient elution).
Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phƣơng pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng từ 0,8-1,5. Thời gian lƣu (tR) của các chất phân tích không quá lớn nhƣng phải đảm bảo tách xa nhau [8], [16].
Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
- Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền.
Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng nền (S/N) (S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền, S/N = 2-3). Giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3x LOD [16].
Xây dựng đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành chuẩn bị và phân tích 7 mẫu chuẩn có nồng độ là 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 µg/ml. Xây dựng phƣơng trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ acid p-coumaric có trong mẫu chuẩn. Từ các thông số thu đƣợc tính toán hệ
29
số tƣơng quan r, yêu cầu r ≥ 0,995 [16]. Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ acid p-coumaric định lƣợng đƣợc với nồng độ thực.
Tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp hệ thống đƣợc dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc kí đủ để tiến hành quá trình phân tích. Pha một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic yêu cầu là RSD ≤ 2% [16].
Độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ lặp lại của phƣơng pháp là mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm cá thể khi phƣơng pháp đƣợc áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu. Tiến hành định lƣợng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dƣợc liệu và tính độ lệch chuẩn tƣơng đối, với yêu cầu RSD ≤ 2% [16].
Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá trình chiết tách xử lí mẫu.
Thêm vào mẫu Ý dĩ 1 (mẫu thu hái tại Hà Nội) đã đƣợc xác định hàm lƣợng acid p-coumaric một lƣợng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tỷ lệ thu hồi đƣợc xác định bằng tỷ lệ của chất chuẩn đối chiếu thu đƣợc từ kết quả định lƣợng so với lƣợng chất chuẩn thêm vào ban đầu. Tiến hành định lƣợng 2 lần đối với mỗi mẫu chiết, chiết lặp lại 3 lần riêng biệt.
Áp dụng phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng để định lƣợng acid p-coumaric
trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu đƣợc định lƣợng 3 lần, lấy kết quả trung bình.
2.3.2. Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ Ý dĩ
- Mục đích: Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm đã triển khai cho chuột cống trắng giống đực khỏe mạnh đƣợc uống nƣớc hàng ngày có bổ sung tác nhân gây sỏi là ethylen glycol nồng độ 0,75% trong vòng 4 tuần để gây
30
sỏi calci oxalat lắng đọng trong thận để đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ [35].
- Chuẩn bị dịch chiết dƣợc liệu:
1kg mẫu dƣợc liệu 1 (Coix lachryma – jobi L. var. lachryma – jobi L.) đƣợc chiết với dung môi là ethanol 70% bằng cách ngâm ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ thu dịch chiết lần 1. Bã dƣợc liệu tiếp tục đƣợc chiết lần 2, lần 3 với ethanol 70% và tiến hành rút dịch chiết sau 24 giờ. Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc 0,45 µm, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, tiếp tục cô dịch chiết đƣợc cao lỏng 3:1 để thử tác dụng sinh học.
- Bố trí thí nghiệm:
Chuột cống trắng giống đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô:
Tất cả các lô chuột đều đƣợc gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nƣớc uống hàng ngày. Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thƣờng.
Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột đƣợc uống nƣớc với thể tích 1ml/100g chuột.
Lô chứng dƣơng: Hàng ngày chuột đƣợc uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột.
Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột. Chuột uống nƣớc cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong 28 ngày.
Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nƣớc tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lƣợng và kích thƣớc tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu. Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học.
31
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Các thông số đánh giá
Thể tích nƣớc tiểu
Nƣớc tiểu 5 giờ đƣợc lấy vào ngày trƣớc ngày kết thúc thí nghiệm thông qua lồng hứng nƣớc tiểu. Rút thức ăn trong quá trình lấy mẫu. Nƣớc tiểu ngay sau đó đƣợc xác định thể tích bằng ống đong.
Vào thời điểm ban đầu, cho chuột uống nƣớc, thuốc đối chiếu natri citrat hoặc cao lỏng Ý dĩ đã đƣợc quy định theo lô. Sau đó, cứ mỗi 2h cho chuột uống EG 0,75% với thể tích 1ml/100g chuột.
pH nƣớc tiểu
pH nƣớc tiểu của từng chuột đƣợc xác định ngay sau khi thu gom nƣớc tiểu. Tinh thể niệu
Ngay sau khi thu gom, lấy 2ml nƣớc tiểu đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ 1,7ml dung dịch phía trên. Phần còn lại đƣợc làm đồng đều, sau đó đƣa lên phiến kính và soi bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng thƣờng ở vật kính 10x và 40x. Quan sát kích thƣớc và mật độ của tinh thể calci oxalat (bao gồm tinh thể COM và COD) trong nƣớc tiểu trên 5 vi trƣờng độc lập. Xác định số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình và cho điểm theo thang (bảng 2.2)
32
Bảng 2.2. Thang điểm phản ánh số lượng tinh thể niệu trung bình
Số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình Điểm
0 ≤ số tinh thể < 1 0
1 ≤ số tinh thể < 4 1
4 ≤ số tinh thể < 7 2
7 tinh thể 3
Mô bệnh học thận
Vào ngày kết thúc thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc giết bằng ether mê. Giải phẫu lấy hai thận. Thận trái đƣợc bảo quản bằng dung dịch formol 10%. Tiêu bản thận đƣợc cắt tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội (mỗi thận làm một tiêu bản, thận cắt dọc với lát cắt 5-7µm). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng phân cực ở vật kính 10x và 40x tại bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Trên một lát cắt thận, đếm số lƣợng ống thận có sỏi CaOx trên 5 vi trƣờng khác nhau, mỗi thận đánh giá trên 10 vi trƣờng độc lập (điểm tối đa trên mỗi thận là 10).
2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc lƣu trữ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007.
Mẫu liên tục, thuộc phân phối chuẩn đƣợc biểu diễn dƣới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Xtb ± SD). Sử dụng kiểm định ANOVA với phân tích hậu kiểm (post - hoc) Dunnett để so sánh sự khác biệt và giá trị trung bình giữa các lô.
Mẫu phân hạng, không thuộc phân phối chuẩn đƣợc biểu dƣới dạng trung vị và tứ phân vị. Dùng thuật toán Mann – Whitney U test để so sánh kết quả giữa lô thử với lô chứng.
33
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm vi học của thân Ý dĩ trên 2 thứ Ý dĩ khác nhau là Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi L. và Coix lachryma-jobi L. var.
ma-yuen Stapf.
3.1.1.1. Đặc điểm vi phẫu
Hình ảnh vi phẫu thân đại diện của 2 thứ Coix lachryma-jobi L. var.
lachryma-jobi L. và Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf đƣợc trình bày ở hình 3.1 và hình 3.2
Vật kính 10x Vật kính 40x
Hình 3.1. Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L.var. lachryma-jobi L.
Ghi chú: 1. Biểu bì; 2. Trụ bì hóa mô cứng 3. Vòng mô cứng; 4. Libe; 5. Gỗ; 6. Mô mềm
35
Vật kính 10x Vật kính 40x
Hình 3.2. Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf
Ghi chú: 1. Biểu bì; 2. Trụ bì hóa mô cứng; 3. Vòng mô cứng; 4. Gỗ; 5. Mô mềm; 6. Libe
Nhận xét: Vi phẫu thân Ý dĩ đƣợc tiến hành trên nhiều mẫu của 2 thứ. Kết quả cho thấy hình ảnh vi phẫu không có sự khác biệt giữa các mẫu. Vi phẫu thân Ý dĩ có đặc điểm chung nhƣ sau: Vi phẫu hình gần tròn. Tế bào biểu bì hình chữ nhật hoặc đa giác xếp khít nhau, rải rác có lỗ khí. Phía trong biểu bì là một lớp tế bào mô cứng, tế bào hình đa giác, kích thƣớc bằng hoặc hơi lớn hơn tế bào biểu bì. Hệ thống dẫn gồm nhiều bó libe gỗ theo kiểu bó mạch kín xếp lộn xộn. Mỗi bó có cấu tạo nhƣ sau: libe chồng lên gỗ; xung quanh là bao mô cứng gồm 2-4 lớp tế bào hình đa giác, kích thƣớc nhỏ. Mô mềm gồm các tế bào gần tròn hoặc hơi đa giác.
3.1.1.2. Đặc điểm bột dƣợc liệu
Đặc điểm bột thân đại diện của 2 thứ Coix lachryma-jobi L. var. lachryma- jobi L. và Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf đƣợc trình bày ở hình 3.3 và