trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC
a) Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phương pháp HPLC
Khảo sát quá trình xử lí mẫu
Dựa vào độ tan của acid p-coumaric, tiến hành khảo sát quá trình chiết xuất với hai dung môi: methanol 80% và ethyl acetat. Cách tiến hành nhƣ sau: cân 5g dƣợc liệu, chiết hồi lƣu với MeOH 80% hoặc EtOAc (2 lần, mỗi lần trong 1 giờ). Gộp dịch chiết, cất quay đến cắn. Cắn đƣợc sơ bộ kiểm tra sự có mặt của acid p- coumaric bằng sắc kí lớp mỏng, hệ dung môi khai triển: Toluen : ethyl acetat : acid formic (4:2:1) với chất đối chiếu là acid p-coumaric. Kết quả cho thấy với cả 2 dung môi này đều chiết đƣợc acid p-coumaric, tuy nhiên trong điều kiện sắc kí đã đƣợc khai triển nhận thấy dịch chiết còn chứa rất nhiều tạp chất.
Do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành loại tạp từ dịch chiết MeOH 80% ban đầu bằng phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng với dung môi EtOAc. Kết quả cho thấy, sau khi chiết lại bằng EtOAc, dịch chiết đã loại bỏ đƣợc nhiều tạp chất.
Quy trình xử lí mẫu cuối cùng đƣợc lựa chọn nhƣ sau:
Cân chính xác khoảng 5g dƣợc liệu đem chiết hồi lƣu với MeOH 80% (2 lần, mỗi lần trong 1 giờ), gộp dịch chiết lại định mức vào bình 50 ml, hút chính xác 25 ml dịch chiết rồi đem cất quay đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml nƣớc rồi đem chiết với EtOAc cho đến khi mất màu. Dịch chiết đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cô đặc đến cắn, hòa tan vào MeOH, định mức vào bình 25 ml rồi lọc (bỏ 5ml dịch lọc đầu) để đƣợc dung dịch tiêm sắc kí.
Khảo sát điều kiện sắc kí
- Chƣơng trình sắc kí lỏng đƣợc khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện sắc kí đã đƣợc khai triển bởi Geetha và cộng sự [51]:
Cột tách : cột Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm) Tốc độ dòng: v = 0,5 ml/phút
41 Thể tích tiêm mẫu : V = 10µl
Detector : UV-VIS ở bƣớc sóng λ = 326 nm Nhiệt độ cột : t = 35 oC
- Mẫu phân tích: mẫu thử là mẫu 1 (thu hái tại Hà Nội) (đƣợc chuẩn bị theo quy trình đã đƣợc mô tả trong phần khảo sát quá trình xử lý mẫu)
- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch acid p-coumaric chuẩn trong MeOH có nồng độ 1,27 mg/ml. Sau đó pha loãng mẫu thành nồng độ 0,127 mg/ml.
Khảo sát thành phần dung môi pha động
Thử nghiệm đƣợc tiến hành với 2 hệ dung môi sau: - Hệ dung môi 1: MeOH- acid formic 1% (5:5)
- Hệ dung môi 2: MeOH- acid formic 1% (6:4)
Kết quả sắc kí đồ HPLC mẫu thử với các hệ dung môi 1 và 2 đƣợc trình bày ở hình 3.6 và 3.7 :
Hình 3.6. Sắc kí đồ hệ dung môi 1 Hình 3.7. Sắc kí đồ hệ dung môi 2
Các thông số đo đƣợc trình bày ở bảng 3.2
42
Hệ dung môi tR(phút) AS RS
Hệ 1 7,923 0,137 0,295
Hệ 2 6,654 1,207 1,384
Nhận xét:
Với các thành phần dung môi pha động đã khảo sát nhƣ trên nhận thấy pic chính đã tách tƣơng đối rõ ràng. So sánh các thông số đo đƣợc giữa hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2 nhận thấy các giá trị AS và RS của hệ dung môi 1 quá thấp, hệ số đối xứng pic AS của hệ dung môi 2 mặc dù nằm trong khoảng giới hạn yêu cầu nhƣng độ phân giải RS vẫn còn thấp, pic chính vẫn bị dính chân, thời gian lƣu của chất phân tích thấp, pic ra sớm dẫn đến các pic bị chồng nhau. Nghi ngờ pic tách ra không phải của một chất mà là của nhiều chất. Có thể do chƣơng trình rửa giải đẳng dòng không đủ khả năng để tách các chất. Do đó cần thay đổi chƣơng trình dung môi sang chế độ rửa giải gradient với thành phần dung môi pha động gồm MeOH và acid formic 1%.
Khảo sát chƣơng trình dung môi
Tiến hành khảo sát chƣơng trình dung môi cho chế độ rửa giải gradient. Hệ dung môi: gồm 2 kênh.
Kênh A: pha nƣớc chứa acid formic 1% Kênh B: MeOH
Khảo sát 2 chƣơng trình dung môi sau: - Chƣơng trình dung môi 1:
43 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3. Chương trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient
t (phút) 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-35
MeOH (%) 10-40 40-50 50 50-60 60 60-100 100
- Chƣơng trình dung môi 2:
Bảng 3.4. Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient
t (phút) 0-5 5-8 8-15 15-20 20-25 25-30 30-35
MeOH (%) 10-50 50-55 55 55-60 60 60-100 100 Kết quả sắc kí đồ HPLC mẫu thử với các chƣơng trình dung môi 1 và chƣơng trình dung môi 2 đƣợc trình bày ở hình 3.8 và 3.9:
(Do sau khi chạy thử chƣơng trình dung môi 1 nhận thấy tín hiệu của pic sắc kí hơi cao, tiến hành chạy chƣơng trình dung môi 2 với thể tích tiêm mẫu giảm một nửa (V= 5µl) để bảo vệ cột, tránh gây tắc cột).
Hình 3.8. Sắc kí đồ chương trình dung môi 1 Hình 3.9. Sắc kí đồ chương trình dung môi 2
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500mVDetector A Ch1:326nm
44 Các thông số đo đƣợc trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Các thông số HPLC của chương trình dung môi 1 và 2
Chƣơng trình
dung môi tR(phút) AS RS
Chƣơng trình 1 22,080 1,645 0,451
Chƣơng trình 2 19,412 1,486 0,925
Nhận xét:
Với các chƣơng trình dung môi đã khảo sát, nhận thấy ở chƣơng trình dung môi 1 giá trị RS thấp, pic chính chƣa tách hoàn toàn với một pic khác, chân pic có dính với một pic nhỏ. Ở chƣơng trình dung môi 2, mặc dù pic cân đối hơn, đỉnh pic chính nhọn, pic tách tốt hơn nhƣng RS vẫn chƣa đạt giá trị tối ƣu. Hình ảnh trên sắc kí đồ cho thấy pic chính ở chƣơng trình dung môi 2 vẫn còn bị dính chân. Căn cứ vào kết quả trên, lựa chọn chƣơng trình dung môi 2 cho quá trình khảo sát tiếp theo và tiếp tục tiến hành khảo sát loại acid sử dụng.
Khảo sát loại acid sử dụng
Khảo sát loại acid sử dụng cho chƣơng trình dung môi 2 rửa giải gradient đã khảo sát ở trên:
Thể tích tiêm mẫu: V= 5µl. Kênh A:
- Hệ 1: pha nƣớc chứa acid formic 1%
- Hệ 2: pha nƣớc chứa acid phosphoric 0,01% Kênh B: MeOH
45 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500mVDetector A Ch1:326nm
Hình 3.10. Sắc kí đồ của hệ acid 1 Hình 3.11. Sắc kí đồ của hệ acid 2
Các thông số đo đƣợc trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Các thông số HPLC của hệ acid 1 và hệ acid 2
Hệ acid tR(phút) AS RS
Hệ acid 1 19,412 1,486 0,925
Hệ acid 2 19,565 1,258 1,497 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét :
Với các loại acid đã khảo sát nhận thấy khi thay đổi từ acid formic 1% sang acid phosphoric 0,01%, pic chính đã tách ra hoàn toàn, đỉnh pic nhọn và cân đối hơn. Các giá trị AS và RS của hệ acid 2 đều nằm trong khoảng giới hạn yêu cầu. Căn cứ vào kết quả khảo sát này, chúng tôi lựa chọn kênh A là pha nƣớc chứa acid phosphoric 0,01% cho chƣơng trình dung môi gradient.
Nhƣ vậy, sau quá trình khảo sát, chúng tôi lựa chọn các điều kiện sắc kí cho quá trình định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ nhƣ sau:
46 Cột tách : cột Ascentis C18 Tốc độ dòng: v = 0,5ml/phút Thể tích tiêm mẫu : V = 5µl Detector : UV-VIS ở bƣớc sóng λ = 326 nm Nhiệt độ cột : t = 35 oC
Chƣơng trình dung môi: gồm 2 kênh
Kênh A: pha nƣớc chứa acid phosphoric 0,01% Kênh B: MeOH
Chƣơng trình dung môi:
Bảng 3.7. Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient
t (phút) 0-5 5-8 8-15 15-20 20-25 25-30 30-35
MeOH (%) 10-50 50-55 55 55-60 60 60-100 100
Áp dụng các điều kiện sắc kí đã khảo sát ở trên đối với mẫu chuẩn, sắc kí đồ so sánh mẫu thử với mẫu chuẩn đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 m in -100000 -75000 -50000 -25000 0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 225000 250000 275000 300000 325000 350000 375000 400000 uV
Hình 3.12. Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 1 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu.
47 Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác 0,0127 g chất chuẩn acid p-coumaric hòa tan với 10ml MeOH trong bình định mức 10ml thu đƣợc dung dịch có nồng độ 1,27 mg/ml, pha loãng mẫu thành các nồng độ 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm đƣợc dãy các dung dịch chuẩn.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Phân tích mẫu acid p-coumaric chuẩn ở nồng độ 0,635 µg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Kết quả xác định nồng độ giới hạn đƣợc thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD
Nồng độ acid p- coumaric(µg/ml) 0,635 0,254 0,127 0,0889 0,0635 Diện tích pic (mAU.s) 136920 78436 33784 24393 Không có tín hiệu
Nồng độ của dung dịch chuẩn là 0,0889 µg/ml thì tỷ số giữa chiều cao tín hiệu và nhiễu đƣờng nền : S/N = 2x 3,7/3,05 = 2,43 , đạt trong khoảng từ 2-3. Nhƣ vậy nồng độ 0,0889 µg/ml đƣợc coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp. Giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3x LOD = 0,2934 µg/ml.
Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính
Chuẩn bị một dãy gồm 7 dung dịch acid p-coumaric chuẩn có nồng độ 0,635 µg/ml đến 63,5 µg/ml rồi tiến hành chạy sắc kí. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trong bảng 3.9, 3.10. Đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy đƣợc thể hiện ở hình 3.13.
48
Bảng 3.9. Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính
Nồng độ
(µg/ml) 0,635 1,27 2,54 6,35 12,7 25,4 63,5
Diện tích
pic(mAU.s) 136920 271421 501426 1385704 2800545 5485741 13999234
49
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát đường chuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Nồng độ thực (µg/ml) Nồng độ tìm thấy(a) (µg/ml) Độ đúng(b) (%) 1 0,635 0,750 118,11 2 1,27 1,36 107,09 3 2,54 2,40 94,49 4 6,35 6,41 100,95 5 12,7 12,8 100,78 6 25,4 25,0 98,43 7 63,5 63,63 100,2
(a) Tính từ phƣơng trình hồi quy (b) % so với nồng độ thực
Với khoảng nồng độ của acid p-coumaric từ 0,635 µg/ml đến 63,5 µg/ml có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic với phƣơng trình :
Y = 220472 * x – 28425 ( hệ số tƣơng quan r = 0,9999) Trong đó: Y : Diện tích pic acid p-coumaric
x : Nồng độ acid p-coumaric ( µg/ml)
Nồng độ acid p-coumaric xác định đƣợc từ đƣờng chuẩn so với nồng độ thực dao động từ 94,43% đến 118,11%.
Khảo sát tính thích hợp hệ thống
Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc kí, tiến hành pha một mẫu chuẩn có nồng độ 6,35 µg/ml, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn cho kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.11:
50
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB
Diện tích pic (mAU.s)
1389951 1351458 1388316 1380761 1373296 1360176 1373993
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic RSD là 1,13% (< 2%).
Kết quả bảng 3.11 cho thấy các điều kiện sắc kí đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lƣợng acid p- coumaric.
Thẩm định độ lặp lại của phƣơng pháp
Chuẩn bị mẫu thử : Cân chính xác khoảng 5g dƣợc liệu (mẫu dƣợc liệu 1) đem chiết hồi lƣu với MeOH 80% (2 lần, mỗi lần trong 1 giờ), gộp dịch chiết lại định mức vào bình 50 ml, hút chính xác 25 ml dịch chiết rồi đem cất quay đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml nƣớc rồi đem chiết với EtOAc (3 lần). Dịch chiết đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cô đặc đến cắn và hòa tan vào MeOH, định mức vào bình 25 ml rồi lọc (bỏ 5ml dịch lọc đầu) để đƣợc dung dịch tiêm sắc kí.
Mỗi mẫu đƣợc phân tích lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình. Hàm lƣợng (%) của acid p-coumaric tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối tính theo công thức:
C x 50 x 100 x P x 100 HL (%) = --- 1000 x M x (100-B)
Trong đó:
C: Nồng độ acid p-coumaric trong dung dịch mẫu thử tính theo phƣơng trình hồi quy (µg/ml)
P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (Pacid p-coumaric chuẩn = 0,996) M: Khối lƣợng mẫu dƣợc liệu đem phân tích (mg)
51
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt để định lƣợng một mẫu thân Ý dĩ (mẫu 1). Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu 1
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 m dƣợc liệu ( mg) 5013,2 5024,5 5052,8 5016,8 5037,7 5034,4 Hàm lƣợng p- coumaric (%) 0,0252 0,0253 0,0252 0,0250 0,0249 0,0250 Hàm lƣợng trung bình tìm thấy acid p-coumaric trong mẫu Ý dĩ 1 là 0,0251% (RSD = 0,62% < 2%)
Kết qủa thu đƣợc cho thấy có thể áp dụng chƣơng trình đã lựa chọn để định lƣợng acid p-coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ.
Khảo sát tỷ lệ thu hồi
- Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 20g dƣợc liệu (mẫu dƣợc liệu 1) và khoảng 0,0060 g acid p-coumaric chuẩn. Cho vào bình chiết rồi tiến hành chiết nhƣ quy trình đã khảo sát.
- Mẫu nền: Cân chính xác khoảng 20g dƣợc liệu (mẫu dƣợc liệu 1) rồi tiến hành chiết nhƣ quy trình đã khảo sát. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau đó pha loãng mẫu thêm chuẩn và mẫu nền 10 lần và đem phân tích bằng HPLC. Tiến hành chiết lặp lại 3 lần. Mỗi lần đƣợc đo lặp lại 2 lần.
Tỷ lệ thu hồi đƣợc tính theo công thức: C thêm chuẩn – C nền
H (%) = --- x 100 C chuẩn đƣợc thêm vào
52
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi
Số lần định lƣợng Lƣợng acid p-coumaric thêm vào (g) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 0,0058 80,04 2 0,0058 80,51 3 0,0059 81,48 4 0,0059 82,25 5 0,0061 81,23 6 0,0061 83,17
Tỷ lệ thu hồi trung bình của phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng phƣơng pháp HPLC là 81,47%.
b) Kết quả định lượng acid p-coumaric trên các mẫu thân Ý dĩ
Áp dụng quy trình đã xây dựng đƣợc để định lƣợng acid p-coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ, mỗi mẫu thực hiện chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần đo lặp lại 2 lần, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.14 và sắc kí đồ ở hình 3.14.
53
Bảng 3.14. Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ
STT Tên mẫu Khối lƣợng (mg) Độ ẩm (%) Stb pic (mAu.s) Hàm lƣợng p-coumaric (% kl/kl) 1 Mẫu 1 5013,2 13,28 4828185 0,0252 2 Mẫu 1 5024,5 13,28 4856370 0,0253 3 Mẫu 1 5037,7 13,28 4793320 0,0249 4 Mẫu 2 5077,0 12,48 7299180 0,0373 5 Mẫu 2 5036,9 12,48 7407820 0,0381 6 Mẫu 2 5034,4 12,48 7378923 0,0380 7 Mẫu 3 5065,9 13,66 5835709 0,0303 8 Mẫu 3 5014,2 13,66 5804764 0,0305 9 Mẫu 3 5070,9 13,66 5860255 0,0304
54
Hình 3.14. Sắc kí đồ HPLC của các mẫu dược liệu và mẫu acid p-coumaric đối chiếu
Hàm lƣợng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric của các mẫu Ý dĩ đƣợc thể hiện ở