acid p-coumaric một lƣợng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tỷ lệ thu hồi đƣợc xác định bằng tỷ lệ của chất chuẩn đối chiếu thu đƣợc từ kết quả định lƣợng so với lƣợng chất chuẩn thêm vào ban đầu. Tiến hành định lƣợng 2 lần đối với mỗi mẫu chiết, chiết lặp lại 3 lần riêng biệt.
Áp dụng phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng để định lƣợng acid p-coumaric
trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu đƣợc định lƣợng 3 lần, lấy kết quả trung bình.
2.3.2. Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ Ý dĩ
- Mục đích: Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm đã triển khai cho chuột cống trắng giống đực khỏe mạnh đƣợc uống nƣớc hàng ngày có bổ sung tác nhân gây sỏi là ethylen glycol nồng độ 0,75% trong vòng 4 tuần để gây
30
sỏi calci oxalat lắng đọng trong thận để đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ [35].
- Chuẩn bị dịch chiết dƣợc liệu:
1kg mẫu dƣợc liệu 1 (Coix lachryma – jobi L. var. lachryma – jobi L.) đƣợc chiết với dung môi là ethanol 70% bằng cách ngâm ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ thu dịch chiết lần 1. Bã dƣợc liệu tiếp tục đƣợc chiết lần 2, lần 3 với ethanol 70% và tiến hành rút dịch chiết sau 24 giờ. Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc 0,45 µm, cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, tiếp tục cô dịch chiết đƣợc cao lỏng 3:1 để thử tác dụng sinh học.
- Bố trí thí nghiệm:
Chuột cống trắng giống đực đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô:
Tất cả các lô chuột đều đƣợc gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nƣớc uống hàng ngày. Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thƣờng.
Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột đƣợc uống nƣớc với thể tích 1ml/100g chuột.
Lô chứng dƣơng: Hàng ngày chuột đƣợc uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột.
Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột. Chuột uống nƣớc cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong 28 ngày.
Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nƣớc tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lƣợng và kích thƣớc tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu. Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học.
31
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo
Các thông số đánh giá
Thể tích nƣớc tiểu
Nƣớc tiểu 5 giờ đƣợc lấy vào ngày trƣớc ngày kết thúc thí nghiệm thông qua lồng hứng nƣớc tiểu. Rút thức ăn trong quá trình lấy mẫu. Nƣớc tiểu ngay sau đó đƣợc xác định thể tích bằng ống đong.
Vào thời điểm ban đầu, cho chuột uống nƣớc, thuốc đối chiếu natri citrat hoặc cao lỏng Ý dĩ đã đƣợc quy định theo lô. Sau đó, cứ mỗi 2h cho chuột uống EG 0,75% với thể tích 1ml/100g chuột.
pH nƣớc tiểu
pH nƣớc tiểu của từng chuột đƣợc xác định ngay sau khi thu gom nƣớc tiểu. Tinh thể niệu
Ngay sau khi thu gom, lấy 2ml nƣớc tiểu đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ 1,7ml dung dịch phía trên. Phần còn lại đƣợc làm đồng đều, sau đó đƣa lên phiến kính và soi bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng thƣờng ở vật kính 10x và 40x. Quan sát kích thƣớc và mật độ của tinh thể calci oxalat (bao gồm tinh thể COM và COD) trong nƣớc tiểu trên 5 vi trƣờng độc lập. Xác định số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình và cho điểm theo thang (bảng 2.2)
32
Bảng 2.2. Thang điểm phản ánh số lượng tinh thể niệu trung bình
Số lƣợng tinh thể calci oxalat trung bình Điểm
0 ≤ số tinh thể < 1 0
1 ≤ số tinh thể < 4 1
4 ≤ số tinh thể < 7 2
7 tinh thể 3
Mô bệnh học thận
Vào ngày kết thúc thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc giết bằng ether mê. Giải phẫu lấy hai thận. Thận trái đƣợc bảo quản bằng dung dịch formol 10%. Tiêu bản thận đƣợc cắt tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội (mỗi thận làm một tiêu bản, thận cắt dọc với lát cắt 5-7µm). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học dƣới ánh sáng phân cực ở vật kính 10x và 40x tại bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Trên một lát cắt thận, đếm số lƣợng ống thận có sỏi CaOx trên 5 vi trƣờng khác nhau, mỗi thận đánh giá trên 10 vi trƣờng độc lập (điểm tối đa trên mỗi thận là 10).