Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học
Sử dụng các phản ứng hóa học thƣờng quy nhƣ mô tả trong tài liệu [6] để xác định một số nhóm chất chính có trong thân Ý dĩ. Cách tiến hành nhƣ ở phụ lục 2 và đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1
26 Bảng 2.1. Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ STT Nhóm chất Các phản ứng hóa học định tính 1 Glycosid tim - Phản ứng Lieberman- Burchardat - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller- Kiliani 2 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt
3 Anthranoid - Phản ứng Borntraeger - Vi thăng hoa
4
Flavonoid
- Phản ứng Cyanidin
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10% - Phản ứng diazo hóa
- Phản ứng với FeCl3
5 Coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton - Phản ứng diazo hóa
- Quan sát huỳnh quang
6 Tanin
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% - Phản ứng với dung dịch gelatin 1% - Phản ứng với chì acetat 10 %
7 Alcaloid
- Phản ứng với TT. Mayer - Phản ứng với TT Bouchardat - Phản ứng với TT Dragendorff 8 Acid hữu cơ - Phản ứng với tinh thể Na2CO3
9 Đƣờng khử - Phản ứng với thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B 10 Acid amin - Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3 %
11 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol 12 Chất béo Vết mờ để lại trên giấy lọc 13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc
27
Từ kết quả định tính đƣa ra phƣơng pháp kiểm nghiệm dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 5g dƣợc liệu cho vào bình nón, thêm MeOH 80% ngập dƣợc liệu, ngâm lạnh 24h, lọc lấy dịch chiết MeOH, cô đến cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 10ml nƣớc rồi đem chiết với EtOAc (2 lần x 10ml). Dịch chiết ethyl acetat đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan, bay hơi dung môi đến cắn. Lấy cắn hòa tan trong 5ml MeOH để đƣợc dung dịch chấm sắc kí.
- Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: hòa tan acid p-coumaric trong MeOH để đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 1mg/ml.
- Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck). Bản mỏng đƣợc hoạt hóa ở 1100C trong 1h .
- Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1)
- Đưa chất lên bản mỏng: 10 µL mẫu thử; 0,5 µL chất đối đƣợc đƣa lên bản mỏng dƣới dạng vạch dài 8mm.
- Khai triển: 10 cm
- Làm khô: trong không khí.
- Quan sát: dƣới ánh sáng tử ngoại ở 2 bƣớc sóng 254 nm và 365 nm
- Hiện màu: sử dụng thuốc thử vanillin/acid sulfuric, sấy bản mỏng ở 1100C trong 5 phút. Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng.
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC
Khảo sát quá trình xử lí mẫu
Dựa vào độ tan của acid p-coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù hợp. Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu tiếp theo để loại tạp chất trong dịch chiết.
Khảo sát điều kiện sắc kí
Phép phân tích đƣợc thực hiện trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS.
28
Điều kiện khảo sát ban đầu đƣợc tiến hành dựa trên kết quả định lƣợng acid p-coumaric bằng phƣơng pháp HPLC trong cây Leptadinia reticulate của Geetha và cộng sự [51]. Tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí trên cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo sát chƣơng trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải gradient (gradient elution).
Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phƣơng pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng từ 0,8-1,5. Thời gian lƣu (tR) của các chất phân tích không quá lớn nhƣng phải đảm bảo tách xa nhau [8], [16].
Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
- Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền.
Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng nền (S/N) (S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền, S/N = 2-3). Giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3x LOD [16].
Xây dựng đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành chuẩn bị và phân tích 7 mẫu chuẩn có nồng độ là 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 µg/ml. Xây dựng phƣơng trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ acid p-coumaric có trong mẫu chuẩn. Từ các thông số thu đƣợc tính toán hệ
29
số tƣơng quan r, yêu cầu r ≥ 0,995 [16]. Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ acid p-coumaric định lƣợng đƣợc với nồng độ thực.
Tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp hệ thống đƣợc dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc kí đủ để tiến hành quá trình phân tích. Pha một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic yêu cầu là RSD ≤ 2% [16].
Độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ lặp lại của phƣơng pháp là mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm cá thể khi phƣơng pháp đƣợc áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu. Tiến hành định lƣợng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dƣợc liệu và tính độ lệch chuẩn tƣơng đối, với yêu cầu RSD ≤ 2% [16].
Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau quá trình chiết tách xử lí mẫu.