toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75%
Về số lượng ống thận lắng đọng tinh thể calci oxalat:
Sau khi xác định số lƣợng ống thận xuất hiện lắng đọng các tinh thể. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.18:
Bảng 3.18. Điểm đánh giá về số lượng ống thận có kết tập sỏi
Lô Liều (g/kg) N
Điểm phản ánh mức độ lắng đọng tinh thể calci oxalat tại thận
Trung vị (tứ phân vị) Chứng bệnh - 8 8,0 (2,2 – 9,6) Chứng dƣơng 2,5 9 0,4 (0,2 – 0,7)* Ý dĩ 2,52 8 0,2 (0,0 – 1,0)# * p < 0,05 khi so sánh với chứng bệnh # p < 0,05 so với lô chứng bệnh
(Sử dụng thuật toán Mann – Whitney U test)
Nhận xét: Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô chứng dƣơng thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh.
Số lƣợng ống thận có kết tập sỏi ở lô Ý dĩ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh và không có sự khác biệt đáng kể khi so với lô chứng dƣơng.
Về hình ảnh mô bệnh học thận dưới kính hiển vi quang học phân cực:
Hình ảnh vi thể thận của các chuột đại diện cho từng lô đƣợc trình bày trong các hình 3.17.
60 Lô chứng bệnh 10x 40x Lô chứng dƣơng 10x 40x Lô Ý dĩ 10x 40x Hình 3.17. Hình ảnh vi thể thận chuột ở vật kính 10x và 40x
Nhận xét: Trên hình ảnh vi thể thận, tinh thể CaOx ở lô chứng bệnh lắng đọng rất nhiều, kết tụ lại thành các đám sỏi lớn, nằm rải rác trong thận.
61
Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Về xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ
Hiện nay chƣa có một thuốc hóa dƣợc nào thực sự hiệu quả để điều trị sỏi tiết niệu, đặc biệt là trong dự phòng tái phát sỏi, do đó xu hƣớng sử dụng dƣợc liệu trong điều trị sỏi tiết niệu đang ngày càng đƣợc quan tâm.
Thân Ý dĩ là thành phần của một bài thuốc mà chúng tôi sƣu tầm đƣợc để điều trị sỏi tiết niệu. Các kết quả đánh giá sơ bộ ban đầu trên mô hình in vitro cho thấy thân Ý dĩ có tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể calci oxalat. Các nghiên cứu về thành phần hóa học theo định hƣớng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu đã phân lập đƣợc acid p- coumaric có tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với giá trị IC50 là 2,35mM, thấp hơn so với giá trị IC50 của natri citrat là 9,61 mM [36]. Nhƣ vậy acid p- coumaric có thể đƣợc coi là hoạt chất trong thân Ý dĩ có tác dụng điều trị sỏi tiết niệu.
Những kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy Ý dĩ là một dƣợc liệu có tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu. Để có thể đƣa dƣợc liệu vào sử dụng trong điều trị, cần phải có các tiêu chuẩn đánh giá để đảm bảo chất lƣợng của dƣợc liệu. Hiện nay trong Dƣợc điển Việt Nam IV [21], Dƣợc điển Trung Quốc [48] và Dƣợc điển Châu Âu 8.2 [49] mới chỉ có chuyên luận kiểm nghiệm hạt Ý dĩ, chƣa có các tiêu chuẩn kiểm nghiệm thân Ý dĩ.
Vì vậy, đề tài tiến hành xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ bao gồm các phƣơng pháp kiểm nghiệm về mặt vi học, định tính định lƣợng acid p- coumaric trong thân Ý dĩ.
Đặc điểm vi học của thân Ý dĩ đƣợc nghiên cứu trên thứ Ý dĩ Coix lachryma- jobi L. var. lachryma-jobi L., là thứ Ý dĩ đã đƣợc đánh giá tác dụng sinh học theo hƣớng điều trị sỏi tiết niệu. Mẫu để nghiên cứu đặc điểm vi học đƣợc thu hái từ hai vùng: Hà Nội và Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu Ý dĩ đƣợc thu từ hai vùng (mẫu 1, mẫu 2) không có sự khác biệt về vi phẫu cũng nhƣ đặc điểm bột dƣợc liệu.
62
Tiêu chuẩn định tính bằng phản ứng hóa học đƣợc xây dựng dựa trên kết quả định tính sự có mặt của các nhóm chất chính trong dƣợc liệu. Acid p-coumaric là thành phần chính có hoạt tính nên đƣợc lựa chọn làm chất chỉ điểm (marker) trong định tính dƣợc liệu bằng sắc ký lớp mỏng.
Trong quá trình xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ về vi học và hóa học, bên cạnh thứ lachryma – jobi, mẫu của thứ Ý dĩ Coix lachryma-jobi L. var. ma- yuen Stapf – thứ Ý dĩ đƣợc quy định trong Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Châu Âu, cũng đã đƣợc nghiên cứu về đặc điểm vi học cũng nhƣ thành phần hóa học. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt cả về mặt vi học cũng nhƣ hóa học giữa 2 thứ.
Acid p-coumaric đƣợc coi là hoạt chất có tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat, do đó chúng tôi tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng thành phần này trong thân Ý dĩ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát dung môi chiết xuất ban đầu dựa vào độ tan của acid p-coumaric. Tuy nhiên, kết quả cho thấy với cả 2 dung môi đƣợc lựa chọn là methanol 80% và ethyl acetat, dịch chiết đều chứa rất nhiều tạp chất, do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát quá trình tinh chế tiếp theo bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi là ethyl acetat. Kết quả cho thấy, sau khi chiết lại bằng ethyl acetat, dịch chiết đã loại bỏ đƣợc nhiều tạp chất. Để đơn giản tối đa quy trình chiết xuất, sau khi lựa chọn đƣợc điều kiện sắc kí lỏng hiệu năng cao phù hợp, dịch chiết methanol 80% cũng đã đƣợc đem phân tích lại trên hệ thống HPLC với những điều kiện trên. Tuy nhiên kết quả sắc kí đồ cho thấy acid p-coumaric không tách đƣợc khỏi các chất khác trong dịch chiết, vì vậy vẫn phải áp dụng quá trình tinh chế chiết lỏng- lỏng để loại tạp.
Các điều kiện sắc kí ban đầu cho quá trình định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC đƣợc lựa chọn dựa trên kết quả của Geetha và cộng sự [51]. Nhƣng trên thực tế do dịch chiết của các dƣợc liệu khác nhau là rất khác nhau nên chúng tôi đã thay đổi một số điều kiện cho phù hợp.Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới về định lƣợng acid p-coumaric trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp HPLC đều sử dụng detector mảng diod do ƣu điểm tạo đƣợc phổ UV của chất phân tách trong khoảng bƣớc sóng đã chọn,
63
kiểm tra đƣợc sự tinh khiết của sản phẩm và định danh đƣợc sản phẩm bằng cách so sánh phổ tƣơng ứng của đỉnh sắc kí với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc phổ của một chất chuẩn biết trƣớc. Tuy nhiên dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và nhằm xây dựng đƣợc một phƣơng pháp có thể ứng dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm, sản xuất, chúng tôi lựa chọn detector UV-VIS theo dõi tại bƣớc sóng 326 nm cho quá trình định lƣợng với một số thuận lợi nhƣ: độ nhạy cao (10-6 g/ml), ít phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện sắc kí và rẻ tiền.
Sau quá trình thẩm định, chúng tôi đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phƣơng pháp HPLC và áp dụng quy trình này để định lƣợng 3 mẫu Ý dĩ với 2 thứ là Coix lachryma – jobi L.var. lachryma–jobi
L và Coix lachryma – jobi L.var. mayuen Stapf đƣợc thu hái ở 2 địa điểm là Thái Nguyên và Hà Nội.
4.2. Về đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ dĩ
Thân Ý dĩ đã thể hiện đƣợc tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro [37]. Tuy nhiên tác dụng trên in vitro chỉ là những kết quả bƣớc đầu, để có thể đƣa Ý dĩ vào sử dụng với tác dụng chữa sỏi tiết niệu cần có các nghiên cứu trên in vivo.
Do đó, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ.
Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng mô hình sử dụng chất gây sỏi là EG với nồng độ 0,75% gây sỏi thực nghiệm trên chuột cống trắng giống đực để đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ. Mô hình này gây đƣợc sỏi thận cho động vật thí nghiệm trong vòng 28 ngày và ổn định, cho tỷ lệ chuột có sỏi cao (80%); không có biểu hiện độc tính: thể trạng chuột bình thƣờng và không có chuột chết trong quá trình thí nghiệm; chức năng gan, thận bình thƣờng; chứng dƣơng natri citrat 2,5g/kg thể hiện tác dụng rõ rệt trên mô hình này [35].
Liều dƣợc liệu đƣợc ngoại suy từ nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải có sử dụng bài thuốc gồm 3 dƣợc liệu Ý dĩ, Bồ đề và Xấu hổ, kết quả bài thuốc với mức liều
64
thấp nhất 2,52g/kg bƣớc đầu có tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu in vivo [17]. Từ đó chúng tôi áp dụng mức liều này (2,52g/kg) cho dƣợc liệu Ý dĩ trong nghiên cứu. Kết quả cho thấy thân Ý dĩ sử dụng đƣờng uống với mức liều 2,52g/kg không ảnh hƣởng tới thể tích nƣớc tiểu, pH nƣớc tiểu, số lƣợng tinh thể calci oxalat trong nƣớc tiểu nhƣng lại làm giảm sự lắng đọng sỏi tại thận gây ra bởi ethylen glycol tƣơng tự chứng dƣơng natri citrat. Nhƣ vậy Ý dĩ là dƣợc liệu có tiềm năng trong điều trị sỏi tiết niệu đặc biệt là dự phòng tái phát sỏi.
Acid p-coumaric, chất phân lập đƣợc từ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết thân Ý dĩ với nồng độ ≥1mM đã thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể calci oxalat rõ rệt khi đƣợc đánh giá trên in vitro và tác dụng này tăng dần theo nồng độ. Nghiên cứu khác cho thấy, acid này có tác dụng chống oxy hóa [71] – một cơ chế ức chế tạo sỏi. Do đó, chúng tôi nghĩ đến tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu trên in vivo của Ý dĩ có vai trò của acid p-coumaric. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu tiếp theo để khẳng định vai trò ức chế hình thành sỏi của acid p-coumaric trên động vật thực nghiệm.
Có rất nhiều cơ chế ức chế sự hình thành sỏi tiết niệu: lợi niệu, ức chế sự kết tinh, duy trì cân bằng yếu tố ức chế và thúc đẩy tạo tinh thể, cải thiện chức năng thận, điều chỉnh chuyển hóa oxalat, chống oxy hóa, ức chế phospholipase, chống khuẩn và tác dụng giảm đau chống viêm [59], [68]. Một trong những giả thuyết đƣợc đƣa ra là: Ý dĩ làm tăng chuyển dạng tinh thể CaOx từ dạng COM khó đào thải và dễ gắn vào các tế bào thành dạng COD dễ đào thải hơn. Do đó, làm giảm sự gắn của các tinh thể lên tế bào, sự kết tụ các tinh thể với nhau và làm tăng sự đào thải tinh thể CaOx ra khỏi đƣờng tiết niệu [17]. Mặt khác, acid p-coumaric chiết xuất từ thân Ý dĩ dù có tác dụng ức chế hình thành tinh thể CaOx in vitro rõ rệt tuy nhiên các tinh thể tồn tại chủ yếu dƣới dạng COM [37]. Do vậy, cần có những nghiên cứu cụ thể và chính xác hơn để đánh giá cơ chế trên.
65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận
Sau thời gian làm thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành đƣợc các mục tiêu đề ra với kết quả cụ thể nhƣ sau:
1. Đã xây dựng đƣợc một số phƣơng pháp kiểm nghiêm thân Ý dĩ về: - Đặc điểm vi học.
- Định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
- Đã xây dựng và thẩm định đƣợc phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC
2. Đã đánh giá đƣợc tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân của thứ Ý dĩ Coix lachryma – jobi L. var. lachryma–jobi L. Kết quả cho thấy thân Ý dĩ sử dụng đƣờng uống với mức liều 2,52g/kg làm giảm sự lắng đọng sỏi tại thận gây ra bởi ethylen glycol tƣơng tự chứng dƣơng natri citrat.
II. Kiến nghị
Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc, có thể thấy thân cây Ý dĩ là một dƣợc liệu có triển vọng trong điều trị sỏi tiết niệu. Với nguồn nguyên liệu dồi dào trong nƣớc, để có thể sử dụng thân cây Ý dĩ một cách hiệu quả trong điều trị sỏi tiết niệu, đề tài xin đƣa ra kiến nghị:
- Tiếp tục hoàn thiện để đƣa ra tiêu chuẩn kiểm nghiệm thân Ý dĩ.
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Quán Anh (1999), Sỏi thận, Sỏi niệu quản, Sỏi bàng quang, Bệnh
học ngoại khoa, tập 2, NXB Y học, tr. 132 - 140.
2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Hoàng Quỳnh Hoa, (2005), Thực tập thực
vật học, Trung tâm thông tin – Thƣ viện trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.
3. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, (2007), Thực vật dược NXB Y học, tr. 139- 354.
4. Bộ môn Dƣợc học cổ truyền - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội (2005), Dược
học cổ truyền, NXB Y học, tr. 335-336.
5. Bộ môn Dƣợc liệu - Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội (2004), Bài giảng Dược liệu, tập1, tr. 42.
6. Bộ môn Dƣợc liệu – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2006), Thực tập dược
liệu phần hóa học, Trung tâm thông tin – Thƣ viện trƣờng đại học Dƣợc
Hà Nội.
7. Bộ môn Dƣợc liệu (2006), Thực tập dược liệu phần hiển vi, Trung tâm thông tin – Thƣ viện trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.
8. Bộ y tế (2006), Hóa Phân Tích, NXB Y học, tr. 135- 140.
9. Bộ Y Tế (2007), Bệnh học và điều trị nội khoa (kết hợp Đông - Tây y), NXB Y học, tr. 241 - 248.
10. Bộ Y Tế (2010), Bệnh học (sách đào tạo Dược sỹ Đại học), NXB Y học, tr. 201 - 204.
11. Các bộ môn nội - Trƣờng Đại học Y Hà Nội (2007), Bài giảng bệnh học
nội khoa, tập 1, NXB Y học, tr. 377 - 390.
12. Tào Duy Cần, Trần Sỹ Viên, (2007), Cây thuốc, vị thuốc, bài thuốc Việt Nam, NXB Hà Nội, tr. 244 - 245.
13. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 741-742.
14. Nguyễn Thị Đông (2013), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên
động vật thực nghiệm của phân đoạn chiết chloroform từ thân cây Ý dĩ,
Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
15. Nguyễn Thị Đông (2009), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch
chiết thân cây Ý dĩ trên một số mô hình thực nghiệm, Khóa luận tốt nghiệp
dƣợc sỹ, Đại học Dƣợc Hà Nội.
16. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc kí lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng
vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên,
67
17. Nguyễn Thị Hải (2013), Đánh giá tác dụng trên mô hình gây sỏi tiết niệu
in vivo và độc tính của bài thuốc gồm ba vị dược liệu: Ý dĩ, bồ đề, xấu hổ,
Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, đại học Dƣợc Hà Nội.
18. Nguyễn Thị Thu Hằng (2011), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết của thân cây ý dĩ (Coix lachryma jobi L., họ Lúa (Poaceae), khóa luận tốt nghiệp dƣợc sỹ, Đại học Dƣợc Hà Nội.
19. Trần Văn Hinh (2007), Bệnh sỏi đường tiết niệu, NXB Y học.
20. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, tập 3, NXB trẻ, tr. 724-735. 21. Hội đồng Dƣợc điển (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. 938.
22. Hội tiết niệu - thận học Việt Nam (2007), Bệnh học tiết niệu, NXB Y học. 23. Đỗ Văn Khái (2010), Nghiên cứu thành phần hóa học một phân đoạn có
tác dụng hạ đường huyết của thân cây Ý dĩ (Coix lachryma jobi L.,
Poaceae), khóa luận tốt nghiệp dƣợc sỹ, Đại học Dƣợc Hà Nội.
24. Hà Hoàng Kiệm (2012), Thận học lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 611-612.
25. Bùi Mỹ Linh (2007), Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều trị sỏi
thân: chuối hột, kim tiền thảo và rau om, Luận án tiến sĩ, Đại học Y Dƣợc
thành phố Hồ Chí Minh.
26. Bùi Mỹ Linh, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, (2000), "Thăm dò tác dụng in vitro