1.3.5.1. Thành phần hóa học
Gần đây nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc của 7 chất từ thân Ý dĩ bao gồm : stigmast-4-en-3-on 31, β-sitosterol 32,
19
stigmasterol 33, (E)-ethyl-3-(4-hydroxyphfrenyl) acrylat 34, acid isovanillic 35 , 4-hydroxy benzaldehyd 36 [18], [23] và acid p-coumaric 37 [37] .
20
1.3.5.2. Tác dụng dƣợc lý
Các nghiên cứu trong nƣớc về thân Ý dĩ tập trung chủ yếu theo hai hƣớng: tác dụng hạ đƣờng huyết và tác dụng trên sỏi tiết niệu.
Về tác dụng hạ đƣờng huyết, nhóm nghiên cứu của Phùng Thanh Hƣơng và cộng sự đã đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết nƣớc thân Ý dĩ đến nồng độ đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng bình thƣờng và chuột nhắt trắng gây tăng đƣờng huyết bởi các tác nhân khác nhau. Kết quả cho thấy dịch chiết nƣớc thân cây Ý dĩ ở liều 20g/kg thể trọng chuột không làm thay đổi đáng kể đƣờng huyết của chuột nhắt trắng bình thƣờng, nhƣng có tác dụng hạn chế sự tăng đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng gây tăng đƣờng huyết thực nghiệm bởi glucose ngoại sinh và adrenalin. Đồng thời ở liều này, dịch chiết nƣớc thân cây Ý dĩ có tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột gây đái tháo đƣờng bằng streptozocin [15]. Trong số các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn chloroform là phân đoạn có tác dụng hạ đƣờng huyết mạnh nhất [28]. Phân đoạn này cũng đƣợc đáng giá tác dụng và cơ chế tác dụng trên đƣờng huyết của chuột gây tăng đƣờng huyết thực nghiệm. Kết quả cho thấy: trên chuột gây đái tháo đƣờng bởi streptozocin liều 150 mg/kg, sau 7 ngày cho chuột uống cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ (33mg/kg) glucose huyết hạ 50,84 % so với thời điểm ban đầu; trên chuột đái tháo đƣờng typ 2, sau 15 ngày uống cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ (16,5mg/kg) glucose huyết hạ 30,38 % so với thời điểm ban đầu. Cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ là do: làm giảm tính kháng insulin, tăng nhạy cảm với insulin; ức chế quá trình tân tạo glucose ở gan; tăng dung nạp glucose vào trong tế bào [14].
Theo định hƣớng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã sơ bộ đánh giá bƣớc đầu tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của thân Ý dĩ. Kết quả cho thấy dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ ở nồng độ 1g/ml (tính theo dƣợc liệu khô tuyệt đối) có tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với tỷ lệ phần trăm ức chế là 39%. Tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ.
21
Trên hình ảnh sỏi quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi nhận thấy dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ làm giảm số lƣợng tinh thể, nhiều tinh thể tồn tại ở dạng calci oxalat dihydrat (COD) là dạng dễ đào thải khỏi cơ thể. Trong số các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn ethyl acetat là phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh nhất sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro. Từ phân đoạn ethyl acetat nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc thành phần chính là acid p-coumaric [37]. Kết quả đánh giá tác dụng
in vitrotrên sỏi tiết niệu của acid p-coumaric cho thấy: ở nồng độ ≥ 1mM, acid p- coumaric thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ. Phần trăm ức chế tối đa đạt đƣợc là 72,0% ở nồng độ 10mM. Tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của acid p-coumaric mạnh hơn chứng dƣơng natri citrat, với giá trị IC50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy 95%: 1,47 – 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29 – 11,16) của natri citrat [36].
1.3.6. Kiểm nghiệm Ý dĩ theo tiêu chuẩn Dƣợc điển
Ý dĩ đã đƣợc sử dụng làm thuốc từ lâu chủ yếu với bộ phận dùng là hạt. Hiện nay một số Dƣợc điển đã có tiêu chuẩn kiểm nghiệm hạt Ý dĩ đó là Dƣợc điển Việt Nam IV, Dƣợc điển Trung Quốc, Dƣợc điển Châu Âu với thứ Ý dĩ đƣợc quy định trong Dƣợc điển là Coix lachryma - jobi L. var. ma-yuen Stapf, họ Lúa (Poaceae). Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm trong các Dƣợc điển này gồm: mô tả đặc điểm hạt, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột, định tính bắng sắc ký lớp mỏng, độ ẩm, độ tro toàn phần, tạp chất, tỷ lệ vụn nát, chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu [21], [48], [49]. Riêng Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Châu Âu có thêm tiêu chuẩn định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng chất đối chiếu là glycerin trioxalat [48] hoặc triolein [49].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy thân Ý dĩ cũng là một dƣợc liệu đáng quan tâm. Tuy nhiên Dƣợc điển các nƣớc chƣa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm thân Ý dĩ.
22
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Dƣợc liệu
Dƣợc liệu là phần, bỏ lá của cây Ý dĩ.
- Mẫu 1: thu hái tại Từ Liêm – Hà Nội vào tháng 10 năm 2012 và đƣợc TS Trần Thế Bách - Phòng Thực Vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là: Coix lachryma-jobi L. var. lachryma–jobi L., họ Lúa (Poaceae).
- Mẫu 2, mẫu 3: thu hái tại Phú Lƣơng - Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2013 và đƣợc PGS.TS Trần Văn Ơn - Bộ môn Thực Vật - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giám định tên khoa học lần lƣợt là: Coix lachryma–jobi L. var. lachryma–jobi L. và Coix lachryma–jobi L. var. ma-yuen Stapf, họ Lúa (Poaceae).
Tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại Phòng thực vật, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật và Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dƣợc liệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
Dƣợc liệu đƣợc sấy khô, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon buộc kín để nơi khô ráo.
23 Hóa chất :
- Ethylen glycol 1,111 – 1,115g/ml (Xilong chemical); Natri citrat (Merck). - Chất chuẩn: acid p-coumaric của hãng Sigma- Aldrich với hàm lƣợng 99,6%. - Methanol, nƣớc cất, acid phosphoric, acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết
dùng cho HPLC.
- Dung môi: methanol, ethyl acetat, toluen, acid formic… dùng cho chiết xuất và sắc kí đạt tiêu chuẩn phân tích.
Bản mỏng : Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của hãng Merck. Động vật thí nghiệm :
- Chuột cống trắng sáu tuần tuổi, giống đực, cân nặng khoảng 110 ± 20 gam, do Học viện quân y cung cấp.
- Động vật đƣợc nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm đến cân nặng khoảng 140 ± 20 gam trƣớc khi thực hiện nghiên cứu, động vật đƣợc cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng cung cấp, uống nƣớc tự do.
2.1.2. Thiết bị
- Kính hiển vi kết nối máy ảnh của hãng Laica. - Máy cất quay Buchi Rotavapor R210.
- Tủ sấy Binder.
- Đèn tử ngoại Vilbez Lourmat (hai bƣớc sóng λ = 254 nm và λ = 366 nm). - Máy đo độ ẩm Sartorius.
- Máy chấm SKLM Linomat 5 của hãng Camag ; hệ thống chụp ảnh và lƣu ảnh Respon 3 của hãng Camag.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-LC 10A (Shimadzu), cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm).
- Máy cất nƣớc 2 lần Hamillton của hãng Hamillton Laboratory Glas Limited.
- Máy đo pH Euteck instrument pH 510. - Máy li tâm HERMLE Z300.
24
2.2. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ: Về đặc điểm vi học.
Về thành phần hóa học:
- Định tính bằng phản ứng hóa học. - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC.
Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng một số phƣơng pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học 2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học 2.3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về vi học
Nghiên cứu đặc điểm vi học của thân Ý dĩ đƣợc tiến hành trên nhiều mẫu và trên cả 2 thứ khác nhau đó là Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi L. và Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf theo phƣơng pháp trong tài liệu [2], [7], [30]. Từ đó đƣa ra các tiêu chuẩn cụ thể để kiểm nghiệm dƣợc liệu về mặt vi học.
Đặc điểm vi phẫu thân Ý dĩ
- Chọn mẫu: sau khi thu hái, chọn nhiều mẫu thân không quá già hoặc quá non, ngâm trong hỗn hợp nƣớc – glycerin – ethanol (1:1:1) để làm mềm và bảo quản.
- Cắt tiêu bản bằng máy cắt cầm tay.
- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung nƣớc Javen, rửa sạch bằng nƣớc, tẩy tiếp bằng chloralhyrdrat 75%, rửa lại bằng nƣớc, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nƣớc đến hết acid. Sau đó tiến hành nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylen.
- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dƣới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn máy ảnh.
25
-Sấy khô dƣợc liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng dao cầu cắt nhỏ rồi nghiền bằng thuyền tán. Rây lấy bột mịn.
-Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
-Lên tiêu bản bột dƣợc liệu bằng nƣớc cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi có gắn máy ảnh. Ảnh các đặc điểm đƣợc chuyển vào máy vi tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh.
2.3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp kiểm nghiệm về hóa học
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học
Sử dụng các phản ứng hóa học thƣờng quy nhƣ mô tả trong tài liệu [6] để xác định một số nhóm chất chính có trong thân Ý dĩ. Cách tiến hành nhƣ ở phụ lục 2 và đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1
26 Bảng 2.1. Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ STT Nhóm chất Các phản ứng hóa học định tính 1 Glycosid tim - Phản ứng Lieberman- Burchardat - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller- Kiliani 2 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt
3 Anthranoid - Phản ứng Borntraeger - Vi thăng hoa
4
Flavonoid
- Phản ứng Cyanidin
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10% - Phản ứng diazo hóa
- Phản ứng với FeCl3
5 Coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton - Phản ứng diazo hóa
- Quan sát huỳnh quang
6 Tanin
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% - Phản ứng với dung dịch gelatin 1% - Phản ứng với chì acetat 10 %
7 Alcaloid
- Phản ứng với TT. Mayer - Phản ứng với TT Bouchardat - Phản ứng với TT Dragendorff 8 Acid hữu cơ - Phản ứng với tinh thể Na2CO3
9 Đƣờng khử - Phản ứng với thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B 10 Acid amin - Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3 %
11 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol 12 Chất béo Vết mờ để lại trên giấy lọc 13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc
27
Từ kết quả định tính đƣa ra phƣơng pháp kiểm nghiệm dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 5g dƣợc liệu cho vào bình nón, thêm MeOH 80% ngập dƣợc liệu, ngâm lạnh 24h, lọc lấy dịch chiết MeOH, cô đến cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 10ml nƣớc rồi đem chiết với EtOAc (2 lần x 10ml). Dịch chiết ethyl acetat đƣợc loại nƣớc bằng Na2SO4 khan, bay hơi dung môi đến cắn. Lấy cắn hòa tan trong 5ml MeOH để đƣợc dung dịch chấm sắc kí.
- Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: hòa tan acid p-coumaric trong MeOH để đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 1mg/ml.
- Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck). Bản mỏng đƣợc hoạt hóa ở 1100C trong 1h .
- Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1)
- Đưa chất lên bản mỏng: 10 µL mẫu thử; 0,5 µL chất đối đƣợc đƣa lên bản mỏng dƣới dạng vạch dài 8mm.
- Khai triển: 10 cm
- Làm khô: trong không khí.
- Quan sát: dƣới ánh sáng tử ngoại ở 2 bƣớc sóng 254 nm và 365 nm
- Hiện màu: sử dụng thuốc thử vanillin/acid sulfuric, sấy bản mỏng ở 1100C trong 5 phút. Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng.
Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC
Khảo sát quá trình xử lí mẫu
Dựa vào độ tan của acid p-coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù hợp. Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu tiếp theo để loại tạp chất trong dịch chiết.
Khảo sát điều kiện sắc kí
Phép phân tích đƣợc thực hiện trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS.
28
Điều kiện khảo sát ban đầu đƣợc tiến hành dựa trên kết quả định lƣợng acid p-coumaric bằng phƣơng pháp HPLC trong cây Leptadinia reticulate của Geetha và cộng sự [51]. Tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí trên cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo sát chƣơng trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải gradient (gradient elution).
Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phƣơng pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng từ 0,8-1,5. Thời gian lƣu (tR) của các chất phân tích không quá lớn nhƣng phải đảm bảo tách xa nhau [8], [16].
Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
- Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền.
Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng nền (S/N) (S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền, S/N = 2-3). Giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3x LOD [16].
Xây dựng đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành chuẩn bị và phân tích 7 mẫu chuẩn có nồng độ là 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 µg/ml. Xây dựng phƣơng trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ acid p-coumaric có trong mẫu chuẩn. Từ các thông số thu đƣợc tính toán hệ
29
số tƣơng quan r, yêu cầu r ≥ 0,995 [16]. Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ acid p-coumaric định lƣợng đƣợc với nồng độ thực.
Tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp hệ thống đƣợc dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc kí đủ để tiến hành quá trình phân tích. Pha một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc kí 6 lần với điều kiện đã lựa chọn. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic yêu cầu là RSD ≤ 2% [16].
Độ lặp lại của phƣơng pháp