Phân tích gen mã hóa cho protein NHX liên quan đến tính chịu mặn ở lúa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Huy Dƣơng PHÂN TÍCH GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN NHX LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Huy Dƣơng PHÂN TÍCH GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN NHX LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ PHÚC Hà Nội – Năm 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học LỜI CẢM ƠN Trƣơc tiên xin gửi lời cảm ơn, biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Phúc, ngƣời thầy nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình thực đề tài tạo điều kiện thuận lợi giúp hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo môn Di truyền học dạy dỗ và tạo điều kiện sở vật chất môn suốt thời gian học tập nghiên cứu trƣờng Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm thuộc môn Di truyền học, phòng Genomics tạo điều kiện trang thiết bị đầy đủ, đại phục vụ cho nghiên cứu đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cử nhân Trần Xuân An, ngƣời giúp đỡ tận tình trình thực hành thí nghiệm cần thiết cho đề tài luận văn thạc sĩ Luận văn đƣợc thực với nguồn kinh phí từ quỹ NAFOSTED Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Huy Dƣơng Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Mục Lục MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung lúa 1.2 Khả chịu mặn lúa 1.2.1 Ảnh hƣởng mặn sinh trƣởng phát triển lúa 1.2.2 Đáp ứng thực vật nói chung lúa nói chung điều kiện mặn 1.3 Họ protein NHX thực vật 1.3.1 Nguồn gốc tiến hóa họ protein NHX thực vật 1.3.2 Chức họ protein thực vật 1.3.2.1 Điều hòa pH .9 1.3.2.2 Chống chịu mặn 1.3.3 Họ protein NHX lúa 10 1.4 Khái niệm chức yếu tố điều hòa cis thực vật 12 1.5 Tình hình nghiên cứu họ gen NHX giới Việt Nam 13 1.6 Một số công cụ tin sinh đƣợc sử dụng nghiên cứu in silico 14 1.6.1 Các công cụ tìm kiếm sở liệu .14 1.6.2 Các công cụ dự đoán cấu trúc phân tử protein 15 1.6.3 Các công cụ đánh giá kết dự đoán cấu trúc phân tử protein .16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số phƣơng pháp CTAB : 18 i Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học 2.2.2 Phƣơng pháp điện di gel Agarose 18 2.2.3 Phƣơng pháp PCR 19 2.2.4 Sử dụng sở liệu phần mềm tin sinh để nghiên cứu in silico gen mã hóa cho protein NHX phân tích kết nghiên cứu 20 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết nghiên cứu in silico họ gen OsNHX 22 3.1.1 Dữ liệu họ gen OsNHX 22 3.1.1.1 Vị trí phân bố gen NST 22 3.1.1.2 Cấu trúc gen thuộc họ gen NHX 23 3.1.1.3 Phân tích cấu trúc protein 25 3.1.2 Phân tích vùng promoter gen thuộc họ gen OsNHX 33 3.1.2.1 Nhận diện yếu tố cis thuộc vùng promoter 33 3.1.2.2 Thiết kế logo motif số yếu tố cis liên quan đến tính chịu mặn 37 3.1.3 Phân tích in silico liệu biểu gen OsNHX 39 3.1.3.1 Sự biểu gen thuộc họ gen OsNHX điều kiện bình thƣờng 39 3.1.3.2 Sự biểu gen thuộc họ OsNHX điều kiện stress 43 3.2 Kết phân tích đa hình vùng promoter gen OsNHX3 45 3.2.1 Kết phản ứng PCR 45 3.2.2 Kết giải trình tự 45 3.2.3 Đánh giá mức độ đa hình vùng promoter giống lúa nghiên cứu 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Tài liệu tham khảo 53 ii Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Danh mục bảng Bảng 1.1 Các gen chống chịu mặn thực vật Bảng 1.2 Các gen điều hòa liên quan đến tính chịu mặn thực vật Bảng 1.3 Số lƣợng vị trí protein thuộc họ protein NHX số loài thực vật Bảng 2.1 Danh sách 12 giống lúa dùng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng PCR vùng promoter gen OsNHX3 20 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 3.1 Thông tin sở liệu gen thuộc họ gen OsNHX lúa 22 Bảng 3.2 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotid gen thuộc họ OsNHX 25 Bảng 3.3 So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự amino acid protein họ OsNHX 25 Bảng 3.4 Chỉ số đánh giá mô hình 3D protein thuộc họ OsNHX 33 Bảng 3.5 Vị trí trình tự TSS yếu tố cis vùng promoter gen thuộc họ OsNHX 34 Bảng 3.6 Dữ liệu tạo dòng cDNA biểu gen OsNHX4 42 Bảng 3.7 Vị trí kiểu thay trình tự nuleotid vùng promoter gen OsNHX3 giống lúa nghiên cứu 48 Bảng 3.8 Sự thay đổi yếu tố điều hòa cis thay nucleotide vùng promoter gen OsNHX3 11 giống lúa 51 iii Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Danh mục hình Hình 1.1 Các đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn thực vật Hình 1.2 Thành phần họ protein OsNHX tham gia điều hòa định ion nội bào 11 Hình 3.1 Sơ đồ phân bố gen OsNHX NST lúa 23 Hình 3.2 Cấu trúc exon/intron gen thuộc họ gen NHX lúa 24 Hình 3.3a Mô hình cấu trúc miền protein xuyên màng OsNHX1 27 Hình 3.3b Mô hình cấu trúc miền protein xuyên màng OsNHX2 28 Hình 3.3c Mô hình cấu trúc miền protein xuyên màng OsNHX3 28 Hình 3.3d Mô hình cấu trúc miền protein xuyên màng OsNHX4 28 Hình 3.3e Mô hình cấu trúc miền protein xuyên màng OsNHX5 29 Hình 3.4a Mô hình 3D protein OsNHX1 30 Hình 3.4b Mô hình 3D protein OsNHX2 30 Hình 3.4c Mô hình 3D protein OsNHX3 31 Hình 3.4d Mô hình 3D protein OsNHX4 31 Hình 3.4e Mô hình 3D protein OsNHX5 31 Hình 3.5 Phân tích điểm Ramachandran protein OsNHX3 32 Hình 3.6 Logo consensus yếu tố ABRE 38 Hình 3.7 Logo consensus yếu tố G-box 38 Hình 3.8 Logo consensus yếu tố MBS 38 Hình 3.9 Logo consensus yếu tố CAAT 388 Hình 3.10 Logo consensus yếu tố TATA-box 39 Hình 3.11 Logo consensus yếu tố GCN4 39 Hình 3.12a Sự biểu gen OsNHX mô quan lúa 40 Hình 3.12b Biểu gen gen OsNHX qua giai đoạn phát triển lúa 41 Hình 3.13 Sự biểu gen OsNHX4 số mô, quan lúa 42 Hình 3.14 Sự biểu gen OsNHX1 (a) OsNHX2 (b) điều kiện stress mặn 43 Hình 3.15 Sự biểu gen OsNHX3 (c) OsNHX5 (d) điều kiện stress mặn 44 Hình 3.16 Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi pro-NHX3 45 iv Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Hình 3.17 Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa CD2 45 Hình 3.18 So sánh trình tự promoter 11 giống lúa với trình tự database 46 v Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxiribonucleic aa Amino acid Axit amin bp Base Pair Cặp bazơ nitơ Cds Coding sequense Trình tự mã hóa cho protein CREs Cis Regulatory Elements Yếu tố điều hòa cis CTAB Cetyl Trimethyl Amoni Bromide dNTPs Deoxyribonucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotide Triphosphate DPE Downstream Promoter Element Yếu tố promoter xuôi dòng DRE Drought Response Element Yếu tố đáp ứng hạn EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ethylen tetraaxetic axit EST Expressed Sequence Tag Tag trình tự biểu IRRI Viện nghiên cứu lúa quốc tế NHX The International Rice Research Institute National Center for Biotechnology Information Na+/H+ -Exchanger NST Chromosome Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RGAP Rice Genome Annotation Project Dự án giải hệ gen lúa TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA TSS Transciption Start Site NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia Mỹ Trao đổi ion Na+/H+ Vị trí khởi đầu phiên mã vi Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học MỞ ĐẦU Ở Việt Nam lúa trồng địa có khả thích nghi rộng với điều kiện sinh thái khác Tuy nhiên suất lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tốnhƣ phân bón, giống, kỹ thuật canh tác khác từ môi trƣờng sinh thái nhƣ khí hậu, độ mặn, độ chua độ màu mỡ đất Độ mặn yếu tố có nguy ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng, phát triển bình thƣờng suất lúa Những nghiên cứu trƣớc độ mặn cao đất không gây độc cho tế bào mà chúng ảnh hƣởng đến khả hấp thu chất dinh dƣỡng khác định nội môi quan, tế bào thực vật qua làm giảm suất chất lƣợng dinh dƣỡng lúa Do lựa chọn lƣơng thực nói chung lúa nói riêng theo hƣớng thích nghi với điều kiện sinh thái ngập mặn nhiệm vụ chiến lƣợc góp phần đảm bảo an ninh lƣơng thực Trong nhiều năm qua, công tác chọn tạo giống đạt đƣợc thành tựu định, song phƣơng pháp đƣợc ứng dụng chủ yếu lai tạo gây đột biến thực nghiệm nên kết nhiều hạn chế, chƣa đáp ứng đƣợc yêu cầu cải tạo giống lúa có chất lƣợng, có khả chống chịu với bất lợi từ môi trƣờng sinh thái Bên cạnh việc sâu nghiên cứu sở di truyền gen chịu mặn, đặc biệt gen tham gia trao đổi Ion Na+/H+ chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu Họ protein NHX đƣợc xem họ protein có liên quan đến tính chịu mặn thực vật đƣợc nghiên cứu năm gần đây, nhiên lúa họ protein lúa chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu cách đầy đủ Để góp phần nghiên cứu đầy đủ cấu trúc, chức họ protein NHX lúa, qua sàng lọc, tuyển chọn nhân dòng giống lúa có khả thích nghi cao với độ mặn chọn đề tài: “Phân tích gen mã hóa cho protein NHX liên quan đến tính chịu mặn lúa” Để đạt đƣợc mục tiêu đề tài tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu in silico họ gen mã hóa cho protein OsNHX lúa Phân tích đa hình vùng promoter gen OsNHX3 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học 21 Londo J P., Chiang Y.-C., Hung K.-H., Chiang T.-Y., & Schaal B A (2006) "Phylogeography of Asian wild rice, Oryza rufipogon, reveals multiple independent domestications of cultivated rice, Oryza sativa" Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(25), pp.9578–9583 22 M Akbar, T Yabuno, & S Nakao (1972) “Breeding for Saline-resistant Varieties of Rice” Japan J Breed, 22(5), pp.277-284 23 Ma Y., Wang J., Zhong Y., Cramer G R., Cheng Z.-M., & others (2015) "Genomewide analysis of the cation/proton antiporter (CPA) super family genes in grapevine (Vitis vinifera L.)" Plant Omics Journal, 8(4), pp 300-311 24 Mishra S., Alavilli H., Lee B., Panda S K., & Sahoo L (2014) "Cloning and Functional Characterization of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene from Mungbean (VrNHX1) and Its Ectopic Expression Enhanced Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana" PLoS ONE, 9(10), pp.e106678 25 Mudgal V., Madaan N., & Mudgal A (2010) "Biochemical Mechanisms of Salt Tolerance in Plants: A Review" International Journal of Botany, 6(2), pp.136– 143 26 Munns R., & Tester M (2008) "Mechanisms of Salinity Tolerance" Annual Review of Plant Biology, 59(1), pp.651–681 27 Pardo J M., Cubero B., Leidi E O., & Quintero F J (2006) "Alkali cation exchangers: roles in cellular homeostasis and stress tolerance" Journal of Experimental Botany, 57(5), pp.1181–1199 57 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học 28 Poljakoff A, & Mayber (1975) "Morphological and Anatomical Changes in Plants as a Response to Salinity Stress" In Plants in Saline Environments (pp 97–117) Springer Berlin Heidelberg 29 Reyes B G de los, Mohanty B., Yun S J., Park M.-R., & Lee D.-Y (2015) "Upstream regulatory architecture of rice genes: summarizing the baseline towards genus-wide comparative analysis of regulatory networks and allele mining" Rice, 8(1), pp.14 30 Rodríguez-Rosales M P., Gálvez F J., Huertas R., Aranda M N., Baghour M., Cagnac O., & Venema K (2009) "Plant NHX cation/proton antiporters" Plant Signaling & Behavior, 4(4), pp.265–276 31 Saghai Maroof M A., Biyashev R M., Yang G P., Zhang Q., & Allard R W (1994) "Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosomal locations, and population dynamics." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(12), pp.5466–5470 32 Sasaki T., Wu J., Mizuno H., Antonio B A., & Matsumoto T (2008) "The Rice Genome Sequence as an Indispensable Tool for Crop Improvement" Rice Biology in the Genomics Era, pp.3–12 33 Tuteja N (2007) "Mechanisms of High Salinity Tolerance in Plants" In Methods in Enzymology (Vol 428, pp 419–438) Elsevier 34 Venema K., Belver A., Marin-Manzano M C., Rodríguez-Rosales M P., & Donaire J P (2003) "A novel intracellular K+/H+ antiporter related to Na+/H+ antiporters 58 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học is important for K+ ion homeostasis in plants" The Journal of Biological Chemistry, 278(25), pp.22453–22459 35 Venema K., Quintero F J., Pardo J M., & Donaire J P (2002) "The arabidopsis Na+/H+ exchanger AtNHX1 catalyzes low affinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes" The Journal of Biological Chemistry, 277(4), pp.2413– 2418 36 Viswanathan Chinnusamy A J (2005) "Understanding and Improving Salt Tolerance in Plants" Crop Science, 45(2), pp.437–448 37 Wittkopp P J., & Kalay G (2012) "Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence" Nature Reviews Genetics, 13(1), pp.59–69 38 Wu C.-A., Yang G.-D., Meng Q.-W., & Zheng C.-C (2004) "The Cotton GhNHX1 Gene Encoding a Novel Putative Tonoplast Na+/H+ Antiporter Plays an Important Role in Salt Stress" Plant and Cell Physiology, 45(5), pp.600–607 39 Zörb C., Noll A., Karl S., Leib K., Yan F., & Schubert S (2005) "Molecular characterization of Na+ /H+ antiporters (ZmNHX) of maize (Zea mays L.) and their expression under salt stress" Journal of Plant Physiology, 162(1), pp.55–66 59 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Phụ Lục Phụ lục Kết đánh giá mô hình 3D protein OsNHX Hình Biểu đồ ProSA protein mẫu c4cz8A Hình Biểu đồ ProSA poteinOsNHX2 Nguyễn Huy Dƣơng Hình Biểu đồ ProSA poteinOsNHX1 Hình Biểu đồ ProSA poteinOsNHX3 ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Hình Biểu đồ ProSA poteinOsNHX4 Di truyền học Hình Biểu đồ ProSA poteinOsNHX5 Fig.7 Ramachandran plot of 3D protein OsNHX1 models Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Fig.8 Ramachandran plot of 3D protein OsNHX2 models Fig.9 Ramachandran plot of 3D protein OsNHX4 models Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Fig.10 Ramachandran plot of 3D protein OsNHX5 models Phụ lục Bảng Số lƣợng yếu tố điều hòa cis trình tự promoter gen OsNHX Số lƣợng yếu tố điều hòa Cis Họ gen OsNHX Cis Elements OsNHX1 OsNHX2 OsNHX3 OsNHX4 OsNHX5 4cl-CMA2b 0 0 5UTR Py-rich stretch 0 A-box 0 1 AAGAA-motif 1 ABRE ACE 1 AC-I 0 AC-II 0 0 AE-box 0 0 ARE 3 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học AT1-motif 0 0 ATCT-motif 0 AuxRR-core 0 Box Box I 1 0 Box II 0 box II 0 Box-W1 2 CAAT-box 26 27 27 16 28 CAT-box 1 CATT-box 0 CATT-motif 0 CCGTCC-box 0 1 CGTCA-motif 2 CTAG-motif 0 0 ELI-box3 0 0 G-Box 4 G-box GA-motif 0 1 GAG-motif 0 GARE-motif 0 0 Bảng Số lƣợng yếu tố điều hòa cis trình tự promoter gen OsNHX (tiếp) Cis element OsNHX1 OsNHX2 OsNHX3 OsNHX4 OsNHX5 GATA-motif 0 GATT-motif 0 0 GC-motif GC-repeat 0 1 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học GCN4_motif 0 GTGGC-motif 0 GT1-motif 1 0 HD-Zip1 0 HD_Zip2 0 HSE 1 I-box 2 1 L-box 0 0 LAMP-element 0 0 LTR 0 MBS 3 MBSI 0 MNF1 0 MSA-like 0 0 O2-site 0 Skn-1_motif 3 Sp1 16 26 13 TATA-box 19 54 53 41 42 TATC-box 0 0 TC-rich repeats 2 TCA-element TCCACCT-motif 1 0 TCCC-motif TCT-motif 0 0 TGA-motif 0 1 TGACG-motif 2 circadian 1 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học W box 2 RbcS-CMA7a 0 0 box E 0 plant_AP-2-like 0 0 Bảng Chú giải trình tự chức số yếu tố cis Trình tự Cis Elements 5UTR Py-rich TTTCTTCTCT stretch Chú giải chức cis-acting element conferring high transcription levels AAGAA-motif GAAAGAA ABRE CACGTG/ ACGTGGC cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness AC-I CCCACCTACC AE-box AGAAACAT part of a module for light response ARE AGAAACAT/ AGAAACAA part of a module for light response Box ATTAAT part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Box I TTTCAAA light responsive element CAAT-box CAAT/ CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học CGTCA-motif Di truyền học CGTCA cis-acting regulatory element involved in the MeJA- responsiveness ELI-box3 AAACCAATT elicitor-responsive element G-Box CACGTG/ CACGTGAAA cis-acting regulatory element involved in light responsiveness part of a light responsive GAG-motif AGAGAGT element GARE-motif TCTGTTG/AAACAGA/AAACAGA gibberellin-responsive element GATA-motif GATAGGG part of a light responsive element GATT-motif CTGCAGATTTCT part of a light responsive element GCN4_motif TGTGTCA cis-regulatory involved in element endosperm expression GTGGC-motif CAGCGTGTGGC part of a light responsive element I-box GATAGGG/ GATATGG part of a light responsive element LTR CCGAAA cis-acting element involved in low-temperature responsiveness MBS Nguyễn Huy Dƣơng TAACTG/CAACTG MYB binding site involved ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học in drought-inducibility MNF1 GTGCCC(A/T)(A/T) light responsive element O2-site GTTGACGTGA cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation Skn-1_motif GTCAT cis-acting regulatory element required for endosperm expression Sp1 CC(G/A)CCC light responsive element TATA-box TTTTA/TAATA/TATA/ TACAAAA core promoter element taTATAAAtc/taTATAAAg/TATAAA around -30 of transcription start TC-rich repeats ATTTTCTCCA/ ATTTTCTTCA cis-acting element involved in defense and stress responsiveness TCA-element CAGAAAAGGA cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness TCCACCT-motif TCCACCT TGACG-motif TGACG cis-acting regulatory element involved in the MeJA- responsiveness WUN-motif TCATTACGAA wound-responsive element Circadian CAANNNNATC cis-acting regulatory element involved in circadian control W-box Nguyễn Huy Dƣơng TTGAC ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Phụ lục Hình Kết phân tích in silico heat map gen OsNHX Phục lục Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa CD2 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa MD2 Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa MD1 Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa CD1 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa CB Hình Kết giải trình tự promoter gen OsNHX3 giống lúa CR Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN [...]... stress mặn [20], [30] [15] Họ gen NHX đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ Arabidopsis (AtNHX), cà chua (LeNHX), Lúa mỳ (TaNHX) ngô (ZmNHX) [39], [14], [3] Ở lúa Gen OsNHX1 lần đầu tiên đƣợc tạo dòng bởi Fukuda và cộng sự vào năm 1999 đã làm sáng tỏ cơ chế chịu mặn có liên quan đến họ gen OsNHX [12] Các phân tích sự biểu hiện của gen OsNHX1 ở nấm men cho thấy thể đột biến gen OsNHX1... quan đến tính chịu mặn có thể chia làm 2 nhóm chức năng Một là các gen mã hóa cho các phân tử protein tác hiệu (effectors), là những yếu tố có liên quan trực tiếp đến khả năng thích nghi, chống chịu điều kiện stress mặn Hai là các gen mã hóa yếu tố điều hòa hoạt động của effectors Mặc dù có rất nhiều gen tham gia vào quá trình chống chịu stress mặn song có thể nhận thấy nhóm gen tham gia mã hóa protein. .. các protein OsNHX đƣợc tiến hành trên lúa và nấm men Saccharomyces cerevisiae bởi Fukuda và cộng sự 2004 Kết quả phân tích cho thấy khi xử lý cây lúa với nồng độ Na+ cao, hàm lƣợng sản phẩm phiên mã của gen OsNHX1 cũng tăng lên Điều này chứng tỏ gen OsNHX1 chịu ảnh hƣởng bởi stress mặn và chủ yếu là kiểu stress ion Đánh giá mức độ biểu hiện gen OsNHX1 ở các mô cơ quan, ngƣời ta nhận thấy gen OsNHX1... trình tự amino acid đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ gen OsNHX Trình tự amino acid của đƣợc mã hóa bởi 5 gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa đƣợc thu thập và xử lý từ cở sở dữ liệu RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu) và Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) Qua phân tích dữ liệu cho thấy, protein thuộc họ gen OsNHX có số amino acid vào khoảng từ 528 đến 549 với mức độ tƣơng... thấp so với các gen OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX3 (Bảng 3.2) Bảng 3.2 So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotid các gen thuộc họ OsNHX Độ tƣơng đồng Nucleotid (%) OsNHX5 OsNHX4 OsNHX3 OsNHX2 OsNHX1 OsNHX5 x 50 42 49 45 OsNHX4 OsNHX3 50 42 x 46 46 x 44 52 44 47 OsNHX2 49 44 52 x 52 OsNHX1 Kích thƣớc gen (bp) 45 44 47 52 x 10377 4280 6144 4105 4924 Nhìn chung các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa có kích thƣớc... gồm 3 họ gen là HKT, NHX và SOS (Hình 1.1) Bảng 1.1 và 1.2 liệt kê một số gen quan đến tính chịu mặn ở thực vật [22] 4 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Bảng 1.1 Các gen chống chịu mặn ở thực vật [22] 5 Nguyễn Huy Dƣơng ĐH Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học Bảng 1.2 Các gen điều hòa liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật... vị ở một số bào quan nhƣ hệ gônghi [30] Ở Arabidopsis, họ protein NHX gồm 6 thành viên đƣợc phân chia thành hai lớp Lớp NHX thứ nhất gồm các protein từ AtNHX1 đến AtNHX4 định vị ở màng không bào [27] và có ái lực cao với Na+ hơn so với K+ [4] Lớp hai gồm các protein AtNHX4 và AtNHX5 định vị ở hệ gônghi và có ái lực với K+ cao hơn Na+ [7], [34] Gen đầu tiên đƣợc tạo dòng là AtNHX1, có liên quan đến. .. gen OsNHX 3.1.1 Dữ liệu về họ gen OsNHX Dựa trên dẫn liệu cây phát sinh chủng loại và chức năng phân tử protein ngƣời ta đã xác định đƣợc rằng họ gen NHX ở thực vật là một thành viên thuộc nhóm 1 (CPA1) của siêu họ gen mã hóa protein vận chuyển ion/proton (CPA) Siêu họ gen này có mặt ở hầu hết các nhóm sinh vật từ đơn bào cho đến những sinh vật bậc cao [30] Họ gen OsNHX đƣợc xác định dựa trên cơ sở... sánh các trình tự protein, mRNA từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ NCBI, rice Phytozome v10, RGAP7, RAPdb Phân tích kết quả chúng tôi đã xác định đƣợc họ gen OsNHX ở lúa gồm 5 gen thành viên là OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 (Bảng 3.1) Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác [5], [30] Bảng 3.1 Thông tin về cơ sở dữ liệu các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa Các gen Số hiệu locus... (http://wheat.pw.usda.gov/piece/index.php) So sánh cấu trúc của 5 gen thuộc họ gen OsNHX chúng tôi ghi nhận các gen OsNHX1 và OsNHX3 có cùng số Exon/Intron (14 exon), trong khi đó cả 2 gen OsNHX2 và OsNHX4 đều chứa 13 exon Sự khác biệt này là do exon số 5 (242bp) ở gen OsNHX2 đƣợc phân tách thành 2 exon với kích thƣớc nhỏ hơn (47bp và 195bp) có mặt ở các gen OsNHX1 và OsNHX3 Riêng gen OsNHX5 có cấu trúc dài nhất với 18 exon và ... chức họ protein NHX lúa, qua sàng lọc, tuyển chọn nhân dòng giống lúa có khả thích nghi cao với độ mặn chọn đề tài: Phân tích gen mã hóa cho protein NHX liên quan đến tính chịu mặn lúa Để đạt... dụng để tìm kiếm sở liệu gen nhƣ trình tự gen, protein, marker phân tử liên quan đến tính chịu mặn, chịu hạn gen Tuy nhiên việc sử dụng phân tích in silico để mô phân tích sở liệu chƣa đƣợc áp... KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Huy Dƣơng PHÂN TÍCH GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN NHX LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI