Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa pectinase từ aspergillus niger

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC THÁI HỒNG CHUYÊN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PECTINASE TỪ Aspergillus niger CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. TRẦN QUỐC DUNG Huế, 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Những tài liệu tham khảo cho luận văn này có nguồn gốc rõ ràng. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Người cam đoan Thái Hồng Chuyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới: Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học Trường ĐH Khoa học Huế. Toàn thể quý Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Huế, đã giảng dạy tận tình chu đáo đã giúp tôi tiếp thu được nhiều kiến thức mới. PGS. TS. Trần Quốc Dung, người Thầy đã chỉ bảo tận tình, hướng dẫn chu đáo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Ban lãnh đạo, phòng Kỹ thuật gen Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã tạo điều kiện tốt nhất khi tôi tiến hành nghiên cứu tại Viện. Trung tâm Huyết học Truyền máu - Bệnh viện Trung ương Huế, nơi tôi đang công tác, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được theo học Cao học và tiến hành nghiên cứu hoàn thành luận văn. Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ chia sẽ, động viên để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Hồng Chuyên MỤC LỤC - Trang phụ bìa - Lời cam đoan - Lời cảm ơn - Mục lục - Danh mục các chữ viết tắt - Danh mục hình ảnh MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Aspergillus niger ............................................................................... 3 1.2. PECTIN ............................................................................................ 4 1.2.1. Nguồn gốc pectin ........................................................................ 4 1.2.2. Cấu tạo phân tử pectin ................................................................. 5 1.1.3. Tính chất của pectin .................................................................... 7 1.3. PECTINASE ..................................................................................... 8 1.3.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất của pectinase ................................ 8 1.3.1.1. Pectinesterase ..................................................................... 8 1.3.1.2. Polygalacturonase .............................................................. 9 1.3.2.3. Transeliminase ................................................................. 11 1.3.2. Nguồn nguyên liệu để thu nhận pectinase .................................. 12 1.3.3. Tính chất của pectinase từ Aspergillus niger ............................. 12 1.3.4. Ứng dụng của pectinase............................................................. 13 1.3.4.1. Ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chế phẩm từ trái cây ................................................................................................ 14 1.3.4.2. Ứng dụng trong chăn nuôi ................................................ 14 1.3.4.3. Ứng dụng trong ngành công nghiệp bông sợi ................... 15 1.3.4.4. Ứng dụng trong lên men chè và cà phê............................. 16 1.4. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger ................... 16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................... 20 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................................. 20 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................. 20 2.2.2. Thời gian nghiên cứu................................................................. 20 2.3. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................. 20 2.3.1. Nguyên liệu ............................................................................... 20 2.3.2. Hóa chất .................................................................................... 21 2.3.3. Môi trường ................................................................................ 22 2.3.4. Trang thiết bị ............................................................................. 22 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 23 2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus niger .. 23 2.4.1.1. Phân lập Aspergillus niger ............................................... 23 2.4.1.2. Tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả năng sinh pectinase tốt .................................................................................. 23 2.4.1.3. Định danh loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................. 24 2.4.2. Phương pháp tạo dòng gen ........................................................ 24 2.4.2.1. Tách chiết RNA tổng số của Aspergillus niger ................. 24 2.4.2.2. Thiết kế primers ............................................................... 25 2.4.2.3. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA ............................. 25 2.4.2.4. Tinh sạch cDNA từ sản phẩm phản ứng RT-PCR ............ 26 2.4.2.5. PCR ................................................................................. 26 2.4.2.6. Gắn sản phẩm cDNA vào vector ...................................... 27 2.4.2.7. Chuẩn bị tế bào E. coli khả biến ....................................... 27 2.4.2.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ................. 28 2.4.2.9. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ........................................... 29 2.4.2.10. Kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector................................................................................... 29 2.4.3. Giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng ............................. 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 30 3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Aspergillus niger CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE TỐT ............................................................. 30 3.1.1. Phân lập Aspergillus niger ......................................................... 30 3.1.2. Tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase tốt bằng phương pháp đo vòng phân giải ............................................. 32 3.1.3. Định danh Aspergillus niger bằng kỹ thuật sinh học phân tử ..... 33 3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger ................... 34 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................ 34 3.2.2. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA ...................................... 35 3.2.3. Tinh sạch sản phẩm cDNA từ phản ứng RT-PCR ...................... 36 3.2.4. Tạo dòng sản phẩm cDNA vào vector và kiểm tra sự hiện diện của nó trong vector .............................................................................. 37 3.3. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE SẢN PHẨM cDNA ĐƯỢC TẠO DÒNG .............................................................................. 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN POLYGALACTURONASE I ĐƯỢC TẠO DÒNG TỪ CHỦNG Aspergillus niger CH13I.......................................................... 42 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa : amino acid BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : base pair cs : cộng sự dNTP : deoxynucleotide triphosphate EDTA : ethylene diamine tetraacetic acid EtBr : ethidium bromide IPTG : isopropyl -D-1- thiogalactopyranoside kb : kilobase LB : Luria and Bertani NCBI : The National Center for Biotechnology Information Nxb : nhà xuất bản OD : optical density PDA : Potato Dextroga Agar rpm : rotation per minute S.O.C : Super Optimal broth with Catabolite repression Taq : Themophilus aquaticus DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Axít D-galacturonic 6 1.2 Cấu tạo phân tử pectin 6 2.1 Sơ đồ vector pGEM®-T Easy 21 2.2 Vị trí gắn sản phẩm cDNA vào vector 27 3.1 Khuẩn lạc A. niger sau 3 ngày nuôi 30 3.2 Thể sinh bào tử (bên trái) và sợi nấm (bên phải) của A. niger 31 3.3 Thể sinh bào tử của A. niger 31 3.4 Bào tử của A. niger 32 3.5 Sinh khối A. niger sau 72 giờ nuôi cấy 32 3.6 Vòng phân giải pectin của chủng A. niger CH13I 33 3.7 Trình tự trên gen rRNA 28S của chủng A. niger CH13I 33 3.8 Kết quả so sánh trình tự bảo thủ trên gen rRNA 28S của chủng A. niger CH13I và A. niger CBS 513.88 34 3.9 Hình ảnh điện di RNA tổng số của A. niger 34 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR 35 3.11 Hình ảnh điện di lượng lớn sản phẩm phản ứng RT-PCR 36 3.12 3.13 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR Khuẩn lạc trắng và xanh của chủng E. coli DH5α sau 16 giờ nuôi cấy Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 37 38 38 3.15 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp 39 3.16 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt hạn chế 40 3.17 Trình tự nucleotide của sản phẩm cDNA được tạo dòng 41 3.18 3.19 Trình tự aa suy diễn của gen polygalacturonase I được tạo dòng từ chủng A. niger CH13I Kết quả so sánh trình tự nucleotide và trình tự aa suy diễn của gen pgaI được tạo dòng với các gen pgaI khác 41 45 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử. Giáo sư Paul Berg thuộc trường Đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980 là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ DNA tái tổ hợp đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau mang lại lợi ích to lớn. Pectin là một thành phần quan trọng trong thành phần cấu tạo của mô thực vật. Đó là một polymer có cấu trúc phức tạp với vai trò làm cầu nối các sợi cellulose giúp ổn định cấu trúc mô thực vật. Việc phân hủy pectin bằng tác nhân hóa lý gặp nhiều khó khăn làm ảnh hưởng đến tốc độ và chất lượng của nhiều quá trình công nghiệp [16]. Pectinase là tên gọi chung của phức hợp enzyme phân giải pectin. Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Pectinase có nguồn gốc khác nhau sẽ có phản ứng thủy phân các liên kết khác nhau và điều kiện tối ưu phản ứng khác nhau. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người [2], [25]. Pectinase là một trong những enzyme được ứng dụng đầu tiên trong đời sống. Từ những năm 1930, enzyme này đã được ứng dụng trong sản xuất rượu và nước ép trái cây. Tuy nhiên, đến thập niên 1960 bản chất hóa học và cấu trúc của mô thực vật được nghiên cứu đầy đủ thì enzyme này mới được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực hơn. Hiện nay, pectinase là một trong những enzyme được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nhất; trong công nghiệp sản 2 xuất nước trái cây; trong chế biến thức ăn chăn nuôi; trong y học để ly trích các dược liệu đông y; trong công nghiệp chất tẩy rửa, việc bổ sung enzyme này tăng chất lượng tẩy rửa và bảo vệ môi trường. Doanh thu ước tính của ngành công nghiệp enzyme trên toàn cầu năm 1995 đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó pectinase chiếm khoảng 75 triệu USD. Năm 2000, ước đạt 1,5 tỷ USD trong đó pectinase chiếm khoảng 100 triệu USD. Dự kiến năm 2012 doanh thu tổng số của ngành công nghiệp enzyme đạt khoảng 2,9 tỷ USD [2], [16], [25], [26]. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã áp dụng nhiều công nghệ mới về các chế phẩm sinh học. Trong đó, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp tạo ra nhiều sản phẩm có chất lượng và giá thành hạ. Nhu cầu ứng dụng pectinase ngày càng tăng trong khi việc thu nhận enzyme này thường gặp nhiều khó khăn do: Các loài mang gen mã hóa thường tổng hợp một lượng enzyme không lớn và chỉ tổng hợp khi cần thiết; thời kỳ tổng hợp có thể ngắn hay chỉ tổng hợp khi trưởng thành; thời gian nuôi trồng kéo dài và thường khó sản xuất trên quy mô công nghiệp. Việc sử dụng các vi sinh vật đặc biệt là Aspergillus niger để sản xuất pectinase tuy đã đạt được nhiều thành tựu, tuy nhiên có sự phụ thuộc nguồn cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp pectinase là pectin. Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ DNA, protein tái tổ hợp đã mở ra một triển vọng lớn để tổng hợp nên enzyme này một cách nhanh chóng thông qua một vật chủ mới như E. coli hay nấm men không có sự phụ thuộc vào nguồn cơ chất pectin, đồng thời có khả năng sản xuất trên quy mô công nghiệp với giá thành hạ [26], [35]. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger”. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger. 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Aspergillus niger Apergillus niger thuộc ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus. Apergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phân giải chất hữu cơ phân bố trên khắp thế giới. Người ta có thể phân lập chúng từ nước, đất và thường có nhiều trong xác thực vật đang phân hủy. Aspergillus niger có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng 6-47°C với nhiệt độ tối ưu ở 30-37°C. Aspergillus niger chịu được hạn cao so với các loài khác thuộc chi Aspergillus. Aspergillus niger có thể phát triển trên một phạm vi pH rất rộng từ 1,4-9,8 với pH tối ưu 4-6, đây cũng là pH tối ưu cho các enzyme do chúng sản xuất ra hoạt động. Aspergillus niger có khả năng sinh bào tử mạnh và phát tán chúng thông qua không khí, đảm bảo sự xuất hiện phổ biến với mật độ cao, đặc biệt là ở những vùng ấm và ẩm ướt [41]. Apergillus niger là một trong những vi sinh vật được sử dụng nhiều trong Công nghệ sinh học. Nó được dùng để sản xuất thực phẩm, dược phẩm, thức ăn chăn nuôi và các enzyme công nghiệp bằng phương pháp lên men rắn hoặc chìm. Nhiều enzyme do Apergillus niger sản xuất được cơ quan FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ đánh giá đạt tiêu chẩn GRAS (generally recognized as safe) và cho phép sử dụng rộng rãi. Apergillus niger là một trong những loài được quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới. Năm 2007, genome của chủng Apergillus niger CBS 513.88 đã được công bố trình tự đầy đủ trên GenBank của NCBI [18], [34], [41]. Apergillus niger là loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase tốt. Apergillus niger là nấm mốc có dạng bình tưới hoặc hoa cúc, có các tế bào chân, có phần cuối phồng lên thành một bọng, trên bọng mọc các thể 4 bình, trên thể bình là các chuỗi bào tử. Tuy nhiên, các loài khác nhau thuộc chi này cũng có những đặc điểm khác nhau [2]. Loài Apergillus niger có những đặc điểm riêng biệt sau: - Apergillus niger phát triển trên môi trường Czapeck, khi quan sát bằng mắt thường có màu đen nhánh hay màu bã cà phê. Chúng phát triển chậm hơn một số loài khác cùng chi trên môi trường này. Đường kính khuẩn lạc đạt được 2,5-3 cm sau 10-14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (24-26oC), sợi nấm mọc rất khít. - Cuống nang thẳng đứng, dài 1,5-3 mm, đường kính 15-20 µm. - Bọng có hình gần như hình cầu, đường kính 45-75 µm. - Chúng có hai hàng thể bình. Thể bình một tầng hoặc hai tầng tuỳ thuộc vào loài và độ tuổi của mũ bào tử. - Bào tử trưởng thành có hình cầu, đường kính 4-5 µm, xù xì, không đều nhau, có gai nhỏ, không sắp xếp đều đặn. Mũ phát tán bào tử có đường kính 700-800 µm. 1.2. PECTIN 1.2.1. Nguồn gốc pectin Pectin là một polymer của các axít polygalacturonic và các este methyl của chúng. Pectin có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào dưới dạng kết hợp với araban (polysaccharide ở thành tế bào), dạng hòa tan của pectin tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào. Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau vì thế người ta gọi chúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật. Khi quả còn xanh, cement là protopectin, do protopectin chiếm tỉ lệ khá cao và không hòa tan trong nước nên giúp quả có độ cứng. Khi quả chín dần, dưới tác dụng protopectinase, protopectin sẽ chuyển sang pectin hòa tan (pectin) và araban, 5 làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm hơn. Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của axít và nhiệt độ ở 60-85oC [29], [39]. Trong thực vật, các pectin thường liên kết với cellulose ở vách tế bào dưới dạng phức hợp chưa biết rõ. Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ hoặc thân của một số loài thực vật. Trong cùng một loại quả nhưng ở các phần khác nhau thì hàm lượng pectin cũng khác nhau. Ví dụ, trong quả bưởi pectin hòa tan là chất nhầy bao quanh vỏ hạt bưởi và trong cùi quả bưởi chín, bản chất của nó là một loại chất xơ hòa tan trong nước, làm tăng độ nhớt. Bảng 1.1. Hàm lượng pectin trong một số loại rau, quả [39] Loại rau, quả Trạng thái Pectin (%) Táo Tươi 0,5-1,6 Chuối Tươi 0,7-1,2 Đào Tươi 0,1-0,9 Dâu Tươi 0,6-0,7 Anh đào Tươi 0,2-0,5 Đậu hà lan Tươi 0,9-1,4 Cà rốt Khô 6,9-18,6 Bột vỏ cam Khô 12,4-28,0 Khoai tây Khô 1,8-3,3 Cà chua Khô 2,4-4,6 Bột củ cải đường Khô 10,0-30,0 1.2.2. Cấu tạo phân tử pectin Pectin là các polysaccharide, mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử axít D-galacturonic (C6H10O7) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside. Trong đó, một số gốc axít có chứa nhóm thế methoxyl 6 (-OCH3). Chiều dài của chuỗi axít polygalacturonic có thể biến đổi từ vài đơn vị tới hàng ngàn đơn vị axít galacturonic. Hình 1.1. Axít D-galacturonic Hình 1.2. Cấu tạo phân tử pectin Phân tử lượng của các loại pectin tách từ các nguồn quả khác nhau thay đổi trong giới hạn rộng tùy theo số phân tử axít galacturonic và thường thay đổi trong phạm vi từ 25-50 kDa. Trong các hợp chất dạng glucid so về chiều dài phân tử thì pectin cao hơn tinh bột nhưng thấp hơn cellulose. Ví dụ, từ nguồn lê, mận thu được pectin có phân tử lượng từ 25-35 kDa, trong khi đó pectin lấy từ cam lại có phân tử lượng đạt tới 50 kDa. Bảng 1.2. Trọng lượng phân tử pectin trong một số loại rau, quả [39] Loại rau, quả Táo và chanh Trọng lượng phân tử (kDa) 200-360 Lê và mận 25-35 Cam 40-50 Củ cải đường 40-50 7 Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl (MI) biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl có trong phân tử pectin và chỉ số este hóa (DE) thể hiện mức độ este hóa của các phân tử axít galactoronic trong phân tử pectin. Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp. Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin): DE > 50% hay MI > 7%. Chúng có thể được sử dụng làm phụ gia để làm tăng độ nhớt cho sản phẩm, muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH từ 3,1-3,4 và nồng độ đường trên 60%. Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin): DE < 50% hay MI < 7%. Chúng được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân tử pectin. Pectin methoxy thấp có thể tạo đông trong môi trường không có đường và thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm. Tên gọi pectin dùng để chỉ các chuỗi polygalacturonic được methyl hóa 100%. Tên gọi axít pectinic để chỉ chuỗi polygalacturonic được methyl hóa thấp hơn 100%. Còn tên gọi axít pectic để chỉ chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm methoxyl. Trong thực tiễn thì tên pectin dùng để chỉ cả axít pectinic và pectin. 1.1.3. Tính chất của pectin Pectin thuộc nhóm các chất làm đông tụ. Pectin được xem là một trong những phụ gia thực phẩm an toàn và được chấp nhận nhiều nhất và điều này được chứng minh bởi hàm lượng ADI (acceptable daily intake) cho phép là “không xác định” được ban hành bởi các tổ chức JECFA (Joint Food Experts Committee), SCF (Scientific Committee for Food) ở Liên minh châu Âu, và FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ [2 ], [39]. 8 Pectin có mã hiệu quốc tế là E440. Pectin tinh chế có dạng chất bột trắng màu xám nhạt, là một chất keo hút nước, rất dễ tan trong nước, không tan trong ethanol. Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt của axít và đường nó có khả năng tạo đông (tạo gel). Vì vậy, nó được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo. Dung dịch pectin có độ nhớt cao. Do đó, nếu muốn thu dịch ép trái cây có hàm lượng pectin cao sẽ gặp bất lợi. Vì vậy, người ta thường dùng pectinase để thủy phân pectin, giảm độ nhớt. Ví dụ, nước cà chua 90-92% H2O nhưng vì hàm lượng pectin cao nên sản phẩm có dạng sền sệt. Nước dứa có ít pectin nên dễ ép, dễ lọc trong quá trình sản xuất [5]. Còn đối với pectin tan thì dưới tác dụng của pectinase sẽ biến thành axít pectinic (thường dưới dạng muối Ca2+ và Mg2+) và các chất đơn giản khác như rượu methylic, axít acetic, arabinose, galactose. 1.3. PECTINASE Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin thành các hợp phần khác nhau. Trong hệ pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40 kDa. Có nhiều cách phân loại pectinase: Dựa vào tính đặc hiệu có thể phân ra enzyme phân giải pectin và phân giải axít pectinic, axít pectic; Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia thành enzyme phân giải các liên kết ở giữa mạch và enzyme phân giải các liên kết ở đầu mạch; dựa và pH tối ưu có thể chia enzyme thành enzyme pH axít và pH kiềm. 1.3.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất của pectinase 1.3.1.1. Pectinesterase Pectinesterase (PE) có gọi hệ thống là pectinhydrolase (mã số: EC 3.1.1.11), có trọng lượng phân tử khoảng 41 kDa. Pectinesterase là nhóm 9 enzyme xúc tác thuỷ phân liên kết este trong phân tử pectin hoặc axít pectinic, kết quả tạo thành là axít pectinic hoặc axít pectic và rượu metanol. Khi toàn bộ các nhóm methoxyl đều bị tách khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là metanol và axít polygalacturonic. Sự thuỷ phân chỉ xảy ra ở liên kết este kề liền với nhóm -COOH tự do. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase của vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,5-5,5. Chế phẩm này sau khi đã loại bỏ polygalacturonase thì có pH tối ưu từ 2,0-6,5. Trong khi đó pH tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao là 5,0-8,0. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 30-45oC và bị bất hoạt khi ở nhiệt độ 55-62oC, trái lại nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao là 55-60oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Na+, K+, Ca2+ và Mg2+. Trái lại các cation hoá trị 3 và 4 như Pb4+, Al3+, Fe3+ sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase. 1.3.1.2. Polygalacturonase Polygalacturonase (PG) có tên hệ thống là poly-α1,4 galacturonic glucanohydrolase (mã số: EC 3.2.1.15). Là các enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết 1-4 glucoside trong phân tử pectin. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật, enzyme này chủ yếu có ở các vi sinh vật, đặc biệt ở nấm mốc và vi khuẩn, thường có trọng lượng phân tử khoảng 65 kDa. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu đối với cơ chất. Polygalacturonase chủ yếu bền vững ở trong vùng pH từ 4,0-6,0. Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng 40-45oC, ở trong khoảng nhiệt độ đó chúng thường bền vững nhưng sẽ bị bất hoạt ở 50-60oC. 10 Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất Deuel và Stutz (1958) đã chia bốn kiểu polygalacturonase trong hai nhóm polymethygalacturonase và polygalacturonase. Polymethygalacturonase Polymethylgalacturonase có tên gọi hệ thống là poly α1,4-galacturonic methylesteglucanohydrolase (mã số EC 3.2.1.11). Polymethylgalacturonase là enzyme song tác lên axít polygalacturonic đã được methoxy hóa. Tuỳ theo vị trí liên kết glucoside bị chúng cắt đứt ở đầu mạch hay giữa mạch mà các enzyme này được chia thành 2 nhóm nhỏ: Endo-polymethylgalacturonase I Endo-polymethylgalacturonase I còn gọi là enzyme dịch hoá. Đây là enzyme xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α1,4-glucoside giữa mạch của các phân tử axít polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao. Hoạt tính của enzyme này bị giảm khi có mặt của pectinesterase trong môi trường. Endo-polymethylgalacturonase I rất phổ biến ở trong các vi sinh vật, đặc biệt là ở nấm mốc Aspergillus niger, Botrylis cinerea, Aspergillus awamori. Exo-polymethylgalacturonase III Exo-polymethylgalacturonase III còn là enzyme đường hoá. Đây là enzyme xúc tác sự thuỷ phân các kiên kết α1,4-glucoside ở đầu mạch để tách dần từng gốc axít galacturonic ra khỏi phân tử pectin hay axít pectinic, bắt đầu từ đầu không khử. Exo-polymethylgalacturonase III có ái lực với gốc axít galacturonic đã methyl hoá, nghĩa là phân cắt các liên kết α1,4- ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc axít galacturonic có nhóm -COOCH3. Polygalacturonase Là enzyme tác dụng chủ yếu lên các axít pectic và axít pectinic. Đối với nhóm enzyme này sự có mặt của pectinesterase có tác dụng thúc đẩy sự xúc 11 tác của chúng. Các enzyme này cũng được chia thành 2 nhóm theo vị trí liên kết glucoside bị chúng cắt đứt là: Exo-polymethylgalacturonase II và Exopolymethylgalacturonase IV. Exo-polymethylgalacturonase II Exo-polymethylgalacturonase II là enzyme dịch hoá. Exo-polymethylgalacturonase II thuỷ phân liên kết α1,4-glucoside ở giữa mạch của các phân tử axít pectic hay axít pectinic. Các enzyme này chỉ hoạt động khi có mặt nhóm -COOH tự do. Vị trí đứt mạch của cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesterase. Đa số nấm mốc và vi khuẩn là những vi sinh vật tổng hợp được enzyme này. Exo-polymethylgalacturonase IV Exo-polymethylgalacturonase IV xúc tác sự thuỷ phân các liên kết glucoside ở đầu mạch của phân tử axít pectic hoặc axít pectinic. Enzyme này có ái lực với các liên kết glucoside ở đầu mạch, gần với nhóm cacboxyl tự do. 1.3.2.3. Transeliminase Nhóm transeliminase xúc tác sự phân cắt phi thuỷ phân các liên kết α1,4-glucoside của các hợp chất pectin, đồng thời tạo ra nối đôi ở trong gốc axít galacturonic giữa nguyên tử cacbon thứ 4 và thứ 5. Sau khi đứt liên kết α1,4 bởi transeliminase thì hydro từ nguyên tử cacbon thứ 5 của gốc axit galacturonic này được chuyển đến nguyên tử cacbon thứ 1 của gốc axít galacturonic khác. Phản ứng này xảy ra dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Transeliminase tác dụng được trên pectin cũng như trên axít pectic. Enzyme này có tính đặc hiệu cao, dựa vào cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu đó người phân ra thành các transeliminase sau: Pectin-transeliminase: là những enzyme tác dụng trên phân tử pectin và axít pectinic. Các enzyme này có tên hệ thống là poly-α1,4 galacturonic 12 methylesteglucanase. Chúng có hai loại là endo-pectin transeliminase I và exo-pectin transeliminase III. Polygalacturonic-transeliminase: Là những enzyme tác dụng trên axít pectinic và axít pectic. Những enzyme này có tên hệ thống là poly-α1,4 Dgalacturonicglucanase. Chúng có hai loại là endo-polygalacturonictranseliminase II và exo-polygalacturonic-transeliminase IV. Transeliminase từ những nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc tính khác nhau. Transeliminase từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH là 5,2. Còn transeliminase từ vi khuẩn hoạt động tối ưu ở pH từ 7,0-8,5. 1.3.2. Nguồn nguyên liệu để thu nhận pectinase Pectinase có thể được sinh tổng hợp từ nấm mốc, vi khuẩn và nấm men. Phần lớn các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được những vi sinh vật vốn là yếm khí bắt buộc nhưng lại có khả năng sinh tổng hợp pectinase [31]. Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinase thì nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cao nhất. Các loài thuộc chi Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus niger, Aspergillus awamori đã được ứng dụng nhiều trong sản xuất pectinase. Pectinase có thể thu nhận được từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc nuôi cấy chìm sục khí. Tuy nhiên, dù nuôi cấy trên môi trường lỏng hay đặc, ngoài các thành phần dinh dưỡng chủ yếu như C, N, P thì chất cảm ứng pectin là một thành phần không thể thiếu trong môi trường để nấm mốc tổng hợp định hướng pectinase với số lượng và hoạt độ lớn [10], [12], [31], [42]. 1.3.3. Tính chất của pectinase từ Aspergillus niger Pectinase được sản xuất từ nấm mốc Apergillus niger là một chế phẩm enzyme thương mại. Dịch enzyme thô sau khi tách chiết bằng cách kết tủa với (NH4)2SO4 và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột sẽ thu được enzyme 13 đồng nhất. Chế phẩm enzyme này hoạt động ở pH tối ưu là 5, nhiệt độ tối ưu là 36oC, ổn định dưới 35oC. Kết quả phân tích trình tự aa cho thấy có 19 loại aa trong phân tử endo-polygalacturonase. Trọng lượng phân tử của enzyme này khoảng 40,4 kDa. Đây là enzyme dịch hoá, xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α1,4-glucoside giữa mạch của các phân tử axít polygalacturonic [1], [2], [12]. 1.3.4. Ứng dụng của pectinase Hầu hết các chế phẩm pectinase đều gồm các phức hệ enzyme giống nhau. Chúng chỉ khác nhau ở mức độ hoạt động và tỷ lệ các loại enzyme. Chính vì điều này, người ta sẽ có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau tuỳ theo mục đích công nghệ và tính chất của loại pectin. Các loại enzyme có mặt trong chế phẩm pectinase phụ thuộc vai trò của chúng mà được chia thành các nhóm như sau: - Enzyme quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm. - Enzyme có mặt trong chế phẩm nhưng không bắt buộc. - Enzyme không cần thiết nhưng có thể cho phép có mặt một lượng không đáng kể trong chế phẩm. Vì vậy, đối với mỗi quá trình công nghệ có thể sử dụng các nhóm pectinase khác nhau. Kashyap và cs (2001) đã có bài viết về ứng dụng của pectinase trong lĩnh vực thương mại. Tác giả đã chỉ ra những ứng dụng của enzyme này trong công nghiệp chế biến nước trái cây, dệt sợi, sản xuất giấy, lên men thịt quả cà phê, chiết tinh dầu và xử lý nước thải [25]. Theo công bố mới đây, Bai và cs (2004) đã đề cập đến một ứng dụng rất mới của pectinase. Sử dụng dịch chiết của enzyme này trong xử lý nước thải và kháng bệnh ở thực vật cho cây khoai tây non và dưa chuột. Củ cải đường được sử dụng như nguồn C, nước thải từ việc sản xuất glutamate được 14 sử dụng làm nguồn N và H2O cho quá trình lên men sinh tổng hợp pectinase bằng chủng Apergillus niger [17]. 1.3.4.1. Ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chế phẩm từ trái cây Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang. - Sản xuất các mặt hàng từ trái cây: nước trái cây cô đặc, mứt. - Sản xuất nước ép trái cây và đồ uống không cồn. - Sản xuất nước giải khát. - Sản xuất cà phê. Ví dụ: Những loại rượu được sản xuất từ lên men trái cây việc dụng pectinase có thể rút ngắn quá trình sản xuất 10-12 ngày, tăng tốc độ lọc, hiệu suất thu hồi tăng 10-15% và làm cho rượu thành phẩm còn có mùi thơm hơn, trong và ánh hơn. Ngoài các ngành nói trên, pectinase còn được dùng trong việc sản xuất các loại gel khác nhau từ quả, cà phê đặc hoặc pectin có hàm lượng methoxy thấp [1], [16], [25]. 1.3.4.2. Ứng dụng trong chăn nuôi Khẩu phần thức ăn của động vật thường có hàm lượng pectin, cellulose và hemicellulose cao. Trong khi đó, động vật lại chỉ có khả năng tổng hợp rất hạn chế các enzyme nhóm cacbonhydrolase phân giải được tinh bột và disaccharide. Trong dịch tiêu hoá động vật không có hemicellulase phân giải xilan (một loại hemicellulose), pectinase phân giải pectin, ligninase phân giải lignin và các hợp chất phức tạp khác. Vì vậy để giúp cho động vật sử dụng triệt để thức ăn, người ta thêm vào khẩu phần của chúng liều lượng thích hợp các chế phẩm enzyme nguồn gốc vi sinh vật có hoạt tính pectinase cao cùng với cellulase và hemicellulase [2], [25]. 15 1.3.4.3. Ứng dụng trong ngành công nghiệp bông sợi Trong ngành công nghiệp bông sợi, việc sử dụng enzyme có tác động rất lớn đến công nghiệp dệt cả về chất lượng sản phẩm và bảo vệ môi trường. Trước khi sợi được mắc vào khung để dệt thành vải nó sẽ được bôi một lớp tác nhân làm trơn để chống xơ xước trong quá trình dệt. Tác nhân thường được sử dụng là tinh bột bởi vì nó có khả năng tạo ra lớp màng mỏng rất tốt mà lại có giá thành rẻ. Tuy nhiên, việc loại bỏ những thành phần không phải là cellulose để nhuộm vải là việc bắt buộc phải làm. Trước khi tìm ra amylase, người ta chỉ có con đường duy nhất để loại bỏ các chất này là sử dụng dung dịch soda (Na2CO3) nóng. Xử lý hoá học không có hiệu quả cao trong việc loại bỏ tinh bột (chúng ảnh hưởng tới sự bắt màu than chì) và tất nhiên kết quả là ở một số sợi vải bị mất đi tính xốp tự nhiên của nó. Việc sử dụng pectinase kết hợp với amylase, cellulase hay các enzyme nhóm hemicellulase khác sẽ loại bỏ các tác nhân trên một cách hiệu quả và làm giảm đáng kể việc sử dụng chất hoá học trong công nghiệp dệt. Kết quả là làm giảm lượng nước thải vào môi trường, giảm công lao động và tăng chất lượng sản phẩm. Sợi cotton có các thành phần như chất béo, sáp, protein, chất màu tự nhiên. Các chất này làm giảm mạnh sự hấp thụ nước của sợi làm giảm độ trắng của sợi. Trong đó, pectin đóng vai trò như một loại keo sinh học, phần lớn nước bao quanh muối của pectin liên kết với sáp, protein tạo ra một màng chắn bảo vệ sợi cotton. Màng chắn này sẽ làm cho sợi bắt màu đồng bộ nhưng lại phải dùng một lượng nước lớn để rửa, tốn năng lượng và tạo ra lượng lớn các chất thải đe doạ môi trường sống. Do vậy, người ta rất quan tâm đến việc giảm giá thành sản phẩm và giảm tác động đến môi trường. Thuỷ phân bằng pectinase phân cắt các chất bám vào làm cho sợi được rửa sạch bằng nước mà không làm vỡ hệ sợi cellulose. Quá trình này gọi là “con đường sinh học”. Con 16 đường sinh học là một con đường mới dựa trên loại bỏ các chất bẩn bằng cách sử dụng các enzyme. Ví dụ như pectinase cắt các liên kết pectin, protease phân cắt protein và một số chất màu cũng sẽ được giải phóng ra. Quá trình này tốn ít năng lượng và ít gây ô nhiễm môi trường. Enzyme trên không làm ảnh hưởng đến sức bền của sợi do hệ sợi không bị phá vỡ. Pectinase sử dụng trong con đường sinh học dựa trên sự lựa chọn về pH, nhiệt độ, nhu cầu năng lượng và thời gian xử lý [25], [36]. 1.3.4.4. Ứng dụng trong lên men chè và cà phê Sử dụng pectinase trong quá trình chế biến chè sẽ làm tăng tốc độ lên men của chè và pectinase cũng làm phá bọt trong bột chè vì nó có khả năng phân huỷ pectin. Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo trên bề mặt của hạt cà phê. Trước đây, người ta dùng ngay vi sinh vật để làm công việc này nhưng quá trình thường xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra. Hiện nay, người ta thường dùng các chế phẩm pectinase để cải thiện chất lượng cà phê [24]. 1.4. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger Pectinase từ Aspergillus niger được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nên gen mã hóa pectinase rất được quan tâm nghiên cứu. Gen pectinase của Aspergillus niger là một họ gen, gồm nhiều gen mã hóa các loại pectinase thực hiện các chức năng khác nhau. Nhiều nghiên cứu khác nhau trên khắp thế giới, đặc biệt là thành tựu trong việc giải toàn bộ genome năm 2007 đã xác định được rất nhiều gen khác nhau trong genome của Aspergillus niger. Tuy nhiên, rất nhiều trình tự trong genome chỉ mới tạm thời dự đoán chức năng và cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để làm rõ chức năng cũng như điều kiện biểu hiện của chúng. Gysler và cs (1990) đã tạo dòng gen pectin lyase D (pelD GenBank: M55657) từ chủng Aspergillus niger N756 bằng cách sàng lọc thư viện 17 genome của chúng với probe là gen pectin lyase I được xác định trong nghiên cứu của Houdenhoven và cs (1975). Kết quả xác định được gen pectin lyase D dài 2716 bp có 4 đoạn intron ngắn 57-65 bp, mã hóa cho 373 aa có 19 aa peptide tín hiệu [21]. Harmsen và cs (1990), Margo và cs (1991) đã nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectin lyase (pelA GenBank: X60724) của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sàng lọc thư viện genome chúng với probe dựa trên gen pectin lyase D (pelD) trong nghiên của Gysler và cs (1990). Kết quả xác định được trình tự mã hóa gen pelA gồm 1355 bp trong đó khung đọc mở (ORF) dài 1137 bp mã hóa cho 379 aa có 20 aa peptide tín hiệu. Trình tự aa của pelA được xác định là giống 69% với gen pelD trong nghiên cứu của Gysler [22], [28]. Ruttkowski và cs (1990) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase từ chủng Aspergillus niger RH5344. Kết quả xác định được một cDNA dài 1319 bp có chứa một khung đọc mở duy nhất 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn peptide tín hiệu đầu tận cùng NH2- gồm 27 aa. Việc giải trình tự các aa từ enzyme này được tiến hành và xác định trình tự aa suy diễn từ trình tự mã hóa của gen polygalacturonase là chính xác [38]. Hendrik và cs (1992) đã tạo dòng xác định trình tự gen polygalacturonase II bằng cách sử dụng probe đặc hiệu sàng lọc thư viện genome của chủng Aspergillus nige N400. Kết quả xác định được trình tự gen polygalacturonase II gồm 1141 bp trong đó có một đoạn intron 55 bp, khung đọc mở (ORF) gồm 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn petide tín hiệu gồm 27 aa [23]. Khanh và cs (1991) tạo dòng gen pectin methyl esterase (PME) từ chủng Aspergillus niger RH5344. Kết quả xác định được trình tự 1747 bp có 7 đoạn exon và 6 đoạn intron, mã hóa cho 314 aa [27]. 18 Bussink và cs (1991) đã mô tả và so sánh hai gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: X58892) và polygalacturonase II (pgaII GenBank: X58893) được tạo dòng từ chủng Aspergillus niger N400. Trong đó, gen pgaI có hộp TATA nằm vị trí -152 và hộp CAAT giả định nằm ở vị trí -218 so với codon mở đầu, có hai đoạn intron ngắn 52 bp và 62 bp, mã hóa cho 368 aa. Gen pgaII có một đoạn intron ngắn 52 bp, mã hóa cho 362 aa [19]. Ruttkowski và cs (1991) đã tạo dòng gen mã hóa polygalacturonase (PG) từ chủng Aspergillus niger RH5344. Cấu trúc gen bao gồm 1141 bp mã hóa cho 362 aa, khung đọc mở bị gián đoạn bởi một đoạn intron 52 bp. Trình tự aa của PG này được so sánh với PG từ cà chua (Lycopesium esculentum) và Erwinia carotovora. Kết quả so sánh ba loại enzyme cho thấy có một vùng bảo tồn cao ở đầu tận cùng, có thể đó là vùng hình thành trung tâm xúc tác [37]. Bussink và cs (1992) đã tạo dòng gen polygalacturonases C. Kết quả xác định được gen polygalacturonases C (pgaC GenBank: X64356) dài 2034 bp, gồm 4 đoạn exon và 3 đoạn intron mã hóa cho 383 aa [20]. Suykerbuyk và cs (1997) đã tạo dòng 2 gen rhamnogalacturonan hydrolase từ thư viện genome của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sử dụng gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus làm probe. Kết quả xác định được 2 gen là rhamnogalacturonan hydrolase A (rhgA GenBank: X94220) và B (rhgB GenBank: X94221). Hai gen này giống với gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus lần lượt là 78% và 72%. Hai gen rhgA, rhgB đều có 3 đoạn intron và 3 đoạn exon, trong đó gen rhgA mã hóa cho 446 aa và rhgB mã hóa cho 558 aa [43]. Parenicova và cs (2000) tạo dòng gen mã hóa 2 endo-polygalacturonase là endo-polygalacturonase A (pgaA GenBank: Y18804) và endo- polygalacturonase B (pgaB GenBank: Y18805). Kết quả xác định được gen 19 pgaA dài 1167 bp trong đó có một đoạn intron và mã hóa cho 370 aa, gen pgaB dài 1234 bp có 2 đoạn intron và mã hóa cho 362 aa [32 ]. Mukadam và cs (2009) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: GQ251519) từ chủng Aspergillus niger M1. Kết quả xác định được trình tự 1101 bp gồm một khung đọc mở duy nhất mã hóa cho 367 aa [30]. Đặc biệt, với công trình giải trình tự toàn bộ genome của chủng Aspergillus niger CBS 513.88 của Pel và cs (2007) rất nhiều gen pectinase đã được xác định và công bố trên GenBank như polygalacturonase I (pgaI XM_001389525), polygalacturonase II (pgaII XM_001397030), endopolygalacturonase A (pgaA XM_001397963), endo-polygalacturonases B (pgaB XM_001399591), polygalacturonase C (pgaC XM_001390775), endopolygalacturonase D (pgaD XM_001393605), polygalacturonase E (pgaE XM_001389818), pectin lyase A (pelA XM_001401024), pectin lyase B (pelB XM_001389889), rhamnogalacturonase A (rhgA XM_001395147), rhamnogalacturonase B (rhgB XM_001401007), pectinesterase A (pmeA XM_001390469) [34]. Ở Việt Nam, hiện chưa có công bố nào về tạo dòng gen pectinase từ Aspergillus niger. 20 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là Aspergillus niger. 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế. 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Luận văn được tiến hành trong thời gian 8 tháng (4-11/2010). 2.3. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nguyên liệu -Vỏ cam, chanh, bưởi được thu thập ngoài tự nhiên tại Thành phố Huế - Chủng E. coli DH5α do Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế cung cấp. - Primer Cặp primer 1: Forward primer 5' ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGCC 3' Reverse primer 5' TTAGCAAGAAGCACCGGAAGGAACG 3' Cặp primer 2: Forward primer 5' ATGCACTCGTTTGCTTCTCTTCTCG 3' Reverse primer 5' CTAACAAGAGGCCACCGAAGGGA 3' - Vector pGEM®-T Easy (Promega). 21 Hình 2.1. Sơ đồ vector pGEM®-T Easy 2.3.2. Hóa chất - Dung dịch DEPC-treated (Ambion) - TRI-reagent (Invitrogen) - Ethanol 100% - Isopropyl alcohol - MOPS (3-(N-morpholino)propan sulfonic acid) 1M (Bio-rad) - EDTA 0,5M, pH 8 - NaOAc 3M - Formaldehyde 37% - Agarose (Bio-Rad) - Ethidium Bromide (1µg/µL) (Bio-Rad) - Ampicillin - Pectin (Nacalai) - Kit RT-PCR: Access RT-PCRSystem (A1250-Promega) - Kit PCR: Green GoTaq (M7122-Promega) 22 - Kit tinh sạch DNA: Wizard® SVGel and PCR Clean-Up System (A9281-Promega) - Kit tách chiết plasmid: GeneJET™ Plasmid Miniprep (K0503Fermentas) 2.3.3. Môi trường - S.O.C (Invitrogen) - LB lỏng: 1% tryptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7. Môi trường LB đặc có bổ sung thêm 1,5% agar. - PDA (Potato Dextroga Agar): Nước chiết khoai tây 1000 ml; agar 2%, glucose 2%; pH 5,5. - Czapeck Dox (môi trường lên men sinh pectinase): K2HPO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; NaNO3 0,3%; KCl 0,05%; FeSO4.7H2O 0,001%; pectin 1,5%; pH 5,5. - Môi trường tuyển chọn chủng Apergillus niger sinh tổng hợp pectinase cao: Pectin 0,5%; agar 2% g; pH 5,5. - Czapeck (môi trường giữ giống Aspergillus niger): K2HPO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; NaNO3 0,3%; KCl 0,05%; FeSO4.7H2O 0,001%; saccarose 3%; agar 2%; pH 5,5. 2.3.4. Trang thiết bị - Máy ly tâm lạnh (Eppendorf) - Máy Vortex (Eppendorf) - Máy Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.) - Hệ thống điện di (Bio-Rad) - Máy PCR (Bio-Rad) - Máy gia nhiệt (Bio-Rad) - Máy đọc gel (Bio-Rad) - Buồng cắt gel (Labnet) 23 - Máy đo quang phổ (Bio-Rad) - Tủ ấm 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus niger 2.4.1.1. Phân lập Aspergillus niger Để các mẫu lên mốc. Chuẩn bị các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml dung dịch agar 0,1% vô trùng. Dùng panh cắt mẫu thành miếng nhỏ cho vào mỗi ống nghiệm chứa dung dịch agar vô trùng, lắc mẫu trên máy vortex để hoà tan. Thanh trùng mẫu dịch ở 80oC trong 10 phút để diệt những nhiễm tạp không có bào tử, sau đó để nguội rồi đem phân lập. Hút 200 µl hỗn dịch cho vào mỗi đĩa petri; đổ môi trường PDA ở nhiệt độ 35-40oC vào đĩa petri và lắc đều đĩa cho hỗn dịch và môi trường hoà đều; để đông môi trường rồi tiến hành nuôi mẫu ở 30oC trong tủ ấm từ 48-72 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát mốc trên đĩa petri. Chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ có hình thái khuẩn lạc giống A. niger theo mô tả trong khóa phân loại của Robert A. Samson. Cấy các khuẩn lạc này vào các ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PDA. Nuôi mẫu ở 30oC trong tủ ấm từ 48-72 giờ sau đó tiến hành sàng lọc chủng A. niger bằng khóa phân loại Robert A. Samson (1984) và của Katsuhiko Ando (2002). 2.4.1.2. Tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả năng sinh pectinase cao Các chủng giống sau khi đã phân lập được đem lên men trong 30 ml môi trường Cezapek Dox. Thực hiện việc lên men trên máy lắc 150 rpm ở 30oC trong 3 ngày. Môi trường thạch pectin được phân phối vào các hộp petri, dùng khoan nút đục lỗ trên đĩa thạch. Lấy 1 ml dịch nuôi ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi chứa pectinase. Hút 100 µL dịch lên men cho vào lỗ thạch, ủ các hộp peptri này ở 37oC, sau 24 giờ lấy ra nhỏ dung dịch chỉ thị lugol 1% trên mặt thạch. Xác định hoạt tính pectinase bằng 24 cách đo vòng phân giải pectin trên môi trường. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng được đánh giá thông qua độ lớn của vòng phân giải pectin. 2.4.1.3. Định danh loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử Chọn chủng có vòng phân giải lớn nhất, định danh đến loài chủng được lựa chọn bằng phương pháp giải trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA. Kết quả giải trình tự được BLAST trên GenBank của NCBI để so sánh với trình tự gen 28S rRNA của các loài thuộc chi Aspergillus. 2.4.2. Phương pháp tạo dòng gen 2.4.2.1. Tách chiết RNA tổng số của Aspergillus niger Tách chiết RNA tổng số của A. niger bằng acid Phenol-Guanidinium Thiocyanate-Chloroform (Tri-reagent) theo Sambrook và cs (2001) [40]. A. niger được nuôi trong bình tam giác có chứa 200 ml môi trường cảm ứng lên men sinh pectin (Cezapek Dox) trong 3 ngày. Sinh khối tế bào được làm sạch bằng cách rửa 2 lần với nước cất khử trùng sau đó rửa lại bằng dung dịch DEPC 0,1%. Tiến hành nghiền mẫu bằng nitơ lỏng hoặc cho vào tủ 40oC cho đông lại rồi nghiền lạnh. Sau đó cho vào tube eppendorf khoảng 50100 mg (khoảng 1/3 thể tích của tube) mẫu đã được nghiền; thêm 1 ml Trireagent và vào tube; ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 phút. Bổ sung thêm 200 µL chloroform lạnh votex nhẹ ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút; ly tâm mẫu với tốc độ 15.000 rpm trong 10 phút ở 4oC. Chuyển dịch nổi sau khi ly tâm sang một tube khác và bổ sung thêm 500 µL isopropanol lắc nhẹ trộn đều; ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; ly tâm mẫu với tốc độ 15.000 rpm trong 10 phút ở 40C loại bỏ dịch nổi thu kết tủa RNA. Cho vào 1 ml ethanol 75%; ly tâm ở 10.000 rpm trong 5 phút; loại bỏ dịch nổi (chú ý không để kết tủa màu trắng thoát ra khi loại bỏ ethanol). Để khô kết tủa ở nhiệt độ phòng 25 trong khoảng 15-20 phút; thêm 50-100 µL dung dịch DEPC 0,1% để hòa tan mẫu. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -70oC để sử dụng cho các thí nghiệm sau. RNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo scientific, USA) ở bước sóng 230 nm. Độ tinh sạch được đánh giá thông qua độ hấp thụ ở bước sóng 230/260 nm. Chất lượng RNA tổng số còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% ở 60V theo phương pháp điện di RNA tổng số có sử dụng formaldehyde để biến tính của Sambrook và cs [40]. Trong 50 ml gel bao gồm: 0,6 g agarose được pha trong 31,1 ml dung dịch DEPC 0,1%, đun nóng cho đến khi agarose tan hết; để nguội đến 65oC cho thêm 10 ml MEA 5× và 8,9 ml formaldehyde 37%. Đệm điện di được sử dụng là MEA 1×. Nhuộm gel trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) 0,5 µg/ml 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa trong dung dịch DEPC 0,1% trong 3 giờ. Hình ảnh điện di được chụp bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). 2.4.2.2. Thiết kế primers Hai cặp primer để tạo dòng gen pectinase được thiết kế dựa theo gen pectinase trên GenBank có mã XM_001389525 và XM_001397030. 2.4.2.3. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA Thực hiện phản ứng RT-PCR từ RNA tổng số sử dụng kit Access RTPCR System (Promega). Phản ứng RT-PCR được thực hiện trong 50 µL dung dịch phản ứng gồm: 100 ng RNA tổng số; 20 pmol mỗi loại primer; 1 µL (10 mM/µL mỗi loại) dNTPs; 2 µL (25 mM/µL) MgSO4; 10 µL AMV/Tfl 5× Buffer; 1 µL (5 U/µL) AMV Reverse Transciptase; 1 µL (5 U/µL) Tfl DNA Polymerase. Phản ứng RT-PCR được tiến hành trong máy luân nhiệt MJ Mini Cyler (Bio-Rad) theo quy trình sau: 45oC trong 45 phút: 1 chu kỳ; 94oC trong 2 26 phút: 1 chu kỳ; 94oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút, 68oC trong 2 phút: 40 chu kỳ; 68oC trong 7 phút: 1 chu kỳ; 4oC: 1 chu kỳ để bảo quản. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1×. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5 g/ml), chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). 2.4.2.4. Tinh sạch cDNA từ sản phẩm phản ứng RT-PCR Thực hiện phản ứng RT-PCR sản xuất cDNA lượng lớn sau đó tinh sạch bằng kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR, chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad) sau đó cắt băng mong muốn. Gel sau khi được cắt cho vào tube eppendorf; thêm dung dịch membrane binding theo tỷ lệ 1 μL membrane minding cho 1 mg gel; vortex và ủ ở nhiệt độ 50-65oC cho đến khi gel hòa tan hết. Chuyển gel đã hòa tan vào cột tinh sạch ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; sau đó ly tâm cột tinh sạch ở 14.000 rpm trong 1 phút; loại bỏ dịch thu được. Thêm 700 μL dung dịch membrane mash; ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút loại bỏ dịch thu được; lặp lại bước trên với 500 μL dung dịch membrane wash ly tâm ở 14.000 rpm trong 5 phút. Chuyển cột tinh sạch sang tube eppendorf và cho 50 μL nuclear free water ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; ly tâm ở 14.000 rpm trong 1 phút thu dịch có chứa cDNA. Sản phẩm cDNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2.5. PCR PCR được thực hiện bằng kit GoTaq® Green Master Mix (Promega). Trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm: 150 ng sản phẩm DNA khuôn mẫu hoặc một ít tế bào E. coli; 20 pmol mỗi loại primer; 25 µL GoTaq® Green Master Mix 2×. Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt MJ Mini Cyler (Bio-Rad) theo quy trình sau: 95oC trong 5 phút: 1 27 chu kỳ; 95oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút 30 giây: 35 chu kỳ; 72oC trong 10 phút: 1 chu kỳ. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1×. Nhuộm gel agarose 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5 g/ml). Hình ảnh điện di được chụp bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad). 2.4.2.6. Gắn sản phẩm cDNA vào vector Sản phẩm cDNA sau khi tinh sạch được gắn vào vector pGEM®-T Easy, trong 10 μL thể tích phản ứng gồm: 50 ng sản phẩm cDNA; 50 ng vector; 1 μL T4 ligase (3 U/μL); 5 μL 2× T4 ligase buffer. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ sau đó ủ 4oC qua đêm. Hình 2.2. Vị trí gắn sản phẩm cDNA vào vector 2.4.2.7. Chuẩn bị tế bào E. coli khả biến Tế bào khả biến sử dụng trong thí nghiệm này là chủng E. coli DH5α được chúng tôi sản xuất theo phương pháp CaCl2 (2001) [40]. Nuôi dòng E. coli DH5α trong 5 ml môi trường LB ở 37oC, 200 rpm qua đêm. Lấy 1 ml dịch nuôi qua đêm cho vào bình có chứa 50 ml môi trường 28 LB nuôi ở 37oC, 200 rpm trong khoảng 1,5-3 giờ cho đến khi mật độ tế bào đo ở OD600 bằng khoảng 0,5. Lấy 50 ml dịch nuôi ly tâm 4.000 rpm ở 4oC loại bỏ dịch nổi sau đó úp ngược tube ly tâm trên giấy thấm khoảng 1 phút loại bỏ hết dịch nuôi thu cặn tế bào. Làm huyền phù lại tế bào trong 12,5 ml CaCl2 0,1M lạnh sau đó ủ trong đá 15 phút; ly tâm 4.000 rpm ở 4oC loại bỏ dịch nổi thấm khô tube bằng cách úp ngược trên giấy thấm khoảng 1 phút. Làm huyền phù lại tế bào với 2 ml CaCl2 0,1M lạnh và 300 µL glycerol lạnh ủ trong đá 2 giờ. Sau đó cho vào mỗi tube efpendoft 100 hoặc 200 µL; làm lạnh nhanh bằng ni tơ lỏng và bảo quản ở -80oC. 2.4.2.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Hỗn hợp phản ứng gắn của sản phẩm cDNA và vector pGEM®-T Easy được biến nạp vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt [40]. Lấy 5 µl hỗn hợp phản ứng gắn cho vào 100 µl tế bào E. coli DH5α khả biến, trộn nhẹ ủ trong đá 1 giờ. Sau đó sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút và làm lạnh nhanh trong đá 5 phút. Thêm vào 0,9 ml môi trường S.O.C nuôi ở 37oC, 150 rpm trong 2 giờ. Sau đó tế bào khả biến này được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường chọn lọc Luria Bertani (LB) + 1,5% agar + ampicilin (50 µg/ml) + 0,1M IPTG + X-gal (20 mg/ml) ở 37oC 16-20 giờ. Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp có chứa sản phẩm cDNA bằng cách chọn khuẩn lạc màu trắng đánh dấu và lấy một ít tế bào thực hiện phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR. Chọn khuẩn lạc nào mà kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR có băng DNA kích thước tương ứng sản phẩm cDNA được tạo dòng, tiến hành nuôi tế bào E. coli từ khuẩn lạc đó trong môi trường LB lỏng + ampicilin (50 µg/ml) ở 37oC, 200 rpm trong khoảng 15-20 giờ, thu sinh khối tế bào để tách chiết plasmid tái tổ hợp. 29 2.4.2.9. Tách chiết plasmid tái tổ hợp Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Fermentas). Ly tâm dịch nuôi sau đó loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào; thêm vào 250 μl resuspension rolution vortex làm huyền phù lại tế bào; thêm 250 μl lysis solution trộn nhẹ bằng cách đảo ống 4-6 lần; thêm 350 μl neutralization solution trộn nhẹ bằng cách đảo ống 4-6 lần; ly tâm hỗn hợp trên 11.000 rpm trong 5 phút. Hút dịch nổi qua cột GeneJET™ spin rồi ly tâm 10.000 rpm 1 phút sau đó loại bỏ dịch thu được. Thêm 500 μl wash solution ly tâm 11.000 rpm 1 phút loại bỏ dịch, lặp lại bước trên thêm một lần; ly tâm lại cột 11.000 rpm trong 1 phút. Chuyển cột qua tube efpendoft, cho thêm 50 μl elution buffer vào cột ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 11.000 rpm trong 2 phút thu plasmid. 2.4.2.10. Kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector Để kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector thực hiện phản ứng cắt bằng bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI. Thành phần phản ứng cắt trong 20 μL dung dịch bao gồm: 1 μg lasmid tái tổ hợp, 2 μL 10 EcoRI buffer, và 1,5U enzyme EcoRI. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 2 giờ. Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1. Nhuộm gel agarose 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5 g/mL) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). 2.4.3. Giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng Các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm cDNA được gửi đến công ty Nam Khoa giải trình tự nucleotide. Primer sử dụng trong quá trình giải trình tự là M13 Foward Primer và M13 Reverse Primer. 30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Aspergillus niger CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PECTINASE CAO 3.1.1. Phân lập Aspergillus niger Mẫu vỏ cam, chanh, bưởi sau khi được xử lý tiến hành phân lập chủng nấm trên môi trường PDA. Sau 3 ngày nuôi trong tủ ấm ở 30oC trên mỗi đĩa petri xuất hiện khoảng 2-30 khuẩn lạc (hình 3.1). Tiến hành quan sát hình thái màu sắc khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm, màu sắc bào tử. Kết quả quan sát cho thấy nhiều khuẩn lạc có đặc điểm của A. niger theo mô tả Robert A. Samson (1984). Đồng thời, trên đĩa cũng không thấy xuất hiện khuẩn lạc nhóm loài khác ngoài nấm mốc. Có thể nhận định sơ bộ là loài thuộc chi Aspergillus. Mật độ khuẩn lạc đáp ứng yêu cầu chọn khuẩn lạc đơn cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này tương tự kết quả của Lê Thanh Hương và Nguyễn Thùy Châu [2], [4]. Hình 3.1. Khuẩn lạc A. niger sau 3 ngày nuôi cấy 31 Chọn khuẩn lạc đơn tiến hành nuôi trên môi trường PDA ở 30oC trong ống nghiệm 48 giờ. Quan sát và phân loại A. niger theo mô tả trong khóa phân loại của Robert A. Samson (1984) [3]. Hình ảnh hiển vi của thể sinh bào tử, sợi nấm và bào tử được trình bày ở hình 3.2; hình 3.3; hình 3.4. Kết quả quan sát hình thái hiển vi phù hợp kết quả của tác giả Nguyễn Thùy Châu (2007) [2]. Kết quả tuyển chọn được 20 chủng được cho là A. niger để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.2. Thể sinh bào tử (bên trái) và sợi nấm (bên phải) của A. niger Hình 3.3. Thể sinh bào tử của A. niger 32 Hình 3.4. Bào tử của A. niger 3.1.2. Tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao bằng phương pháp đo vòng phân giải Lên men các chủng A. niger tuyển chọn được trong môi trường cảm ứng sinh pectinase (Czapeck Dox) ở 30oC, 150 rpm trong 3 ngày. Sau 3 ngày nuôi có thể thấy hệ sợi phát triển tốt. Qua đó có thể nhận định tất cả các chủng được lên men đều có khả năng sinh pectinase vì pectin là nguồn cacbon duy nhất được bổ sung vào môi trường, kết quả nuôi cấy sau 3 ngày được trình bày ở hình 3.5. Với kết quả này có thể thu dịch nuôi cấy để xác định hoạt độ chung bằng phương pháp đo vòng phân giải pectin. Hình 3.5. Sinh khối A. niger sau 72 giờ nuôi cấy 33 Thu dịch nuôi ly tâm 12.000 rpm loại bỏ xác tế bào thu dịch có chứa pectinase. Hút 100 µL dịch nuôi cho vào đĩa petri chứa môi trường thạch pectin (agar 2% + pectin 0,5%) ủ 37oC 24 giờ. Quan sát và đo vòng phân giải nhận thấy 20 chủng được lên men đều sinh pectinase, tuy nhiên mỗi chủng có khả năng sinh pectinase và hoạt độ chung khác nhau. Kích thước vòng phân giải đo được đạt từ 0,5-3 cm. Trong đó kích thước vòng phân giải của chủng CH13I là lớn nhất (hình 3.6). Kết quả đó cho thấy chủng A. niger CH13I sinh pectinase tốt nhất và có thể sử dụng môi trường này nuôi cấy thu sinh khối để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.6. Vòng phân giải pectin của chủng A. niger CH13I 3.1.3. Định danh Aspergillus niger bằng kỹ thuật sinh học phân tử Chủng A. niger CH13I được tiến hành định danh bằng giải trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA tại công ty Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh. Kết quả giải trình tự trình tự trên gen 28S rRNA được trình bày ở hình 3.7. 1 GACTCCTTGG TCCGTGTTTC AAGACGGGTC GTTTACGACC ATTATGCCAG CGTCCGTGCC 61 GAAGCGCGTT CCTCGGTCCA GGCTGGCCGC ATTGCACCCC TGGCTATAAG GTGCCCCGGA 121 GGGCACTACA TTCCAGGGGC CTTTGACCGG CCGCCCAAAC CGACGCTGGC CCGCCCACGG 181 GGAAGTACAC CGGCACGAAT GCCGGCTGAA CCCCGCGGGC GAGTCTGGTC GCAAGCGCTT 241 CCCTTTCAAC AATTTCAC Hình 3.7. Trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CH13I 34 Kết quả BLAST trên GenBank cho thấy trình tự trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CH13I tương đồng 100% với trình tự trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CBS 513.88 (chủng được giải trình tự toàn bộ genome). Trình tự này tương đồng dưới 92% so với các loài khác thuộc chi Aspergillus. Query 1 Sbjct 96 Query 61 Sbjct 156 Query 121 Sbjct 216 Query 181 Sbjct 276 Query 241 Sbjct 336 GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGTTTACGACCATTATGCCAGCGTCCGTGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGTTTACGACCATTATGCCAGCGTCCGTGCC 60 GAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACCCCTGGCTATAAGGTGCCCCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACCCCTGGCTATAAGGTGCCCCGGA 120 GGGCACTACATTCCAGGGGCCTTTGACCGGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGCACTACATTCCAGGGGCCTTTGACCGGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCACGG 180 GGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCCGCGGGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCCGCGGGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTT CCCTTTCAACAATTTCAC |||||||||||||||||| CCCTTTCAACAATTTCAC 155 215 275 240 335 258 353 Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CH13I và A. niger CBS 513.88 3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số RNA tổng số được tách chiết từ 0,5-1 g sinh khối A. niger được hòa tan trong 100 μL dung dịch DEPC 0,1%. Nồng độ RNA tổng số được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer đạt từ 100 ng/μL đến 300 ng/μL. Độ hấp thụ quang ở bước sóng 230/260 nm của RNA tổng số đạt 1,66-1,80 cho thấy nó có độ tinh sạch tốt. Chất lượng RNA tổng số còn được kiểm tra bằng điện di agarose gel 1,2%. Kết quả điện di RNA tổng số được trình bày ở hình 3.9. Hình 3.9. Hình ảnh điện di RNA tổng số của A. niger 35 Với kết quả này chúng tôi nhận định RNA tổng số ít bị đứt gãy, tương đối sạch và nồng độ đạt yêu cầu có thể bảo quản để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA từ RNA tổng số của chủng A. niger CH13I được thực hiện bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp primer 1 và primer 2. Sản phẩm phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, nhuộm EtBr (0,5 µg/ml) trong 15 phút. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.10. Phân tích hình ảnh điện di cho thấy với cặp primer 1 phản ứng RT-PCR có phản ứng tổng hợp cDNA và khuếch đại được một đoạn cDNA có kích thước khoảng 1100 bp. Không có phản ứng tổng hợp xảy ra với cặp primer 2. 1 2 3 4 5 6 7 M 2027 bp ~1100 bp 564 bp Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR 1; 2: Sản phẩm phản ứng RT-PCR với cặp primer 2 3; 4; 5; 6; 7: Sản phẩm phản ứng RT-PCR với cặp primer 1 M: Marker /Hind III (Promega) 36 Thực hiện phản ứng RT-PCR từ RNA tổng số của chủng A. niger CH13I với cặp primer 1 trong thể tích 50 µL nhằm thu một lượng lớn cDNA để tạo dòng trong vector. Sản phẩm phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, nhuộm EtBr (0,5µg/ml) trong 15 phút, chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di lượng lớn sản phẩm phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.11. M P 2027 bp ~1100 bp 564 bp Hình 3.11. Hình ảnh điện di lượng lớn sản phẩm phản ứng RT-PCR P: Sản phẩm RT-PCR M: Marker /Hind III (Promega) 3.2.3. Tinh sạch sản phẩm cDNA từ phản ứng RT-PCR Băng chứa cDNA được cắt ra khỏi gel agarose và cho vào mỗi tube eppendorf khoảng 400 mg và tiến hành tinh sạch bằng kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Sau khi tinh sạch, cDNA được hòa tan trong 50 L nuclear free water. Nồng độ cDNA được kiểm tra bằng máy quang phổ NanoDrop ND1000 spectrophotometer đạt từ 35 ng/µL đến 100 ng/µL. Chất lượng cDNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, chụp hình bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.12. Nhìn chung, sản phẩm 37 cDNA sau khi tinh sạch có chất lượng tốt và có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. M P 2027 bp ~1100 bp 564 bp Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR P: cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR M: Marker /Hind III (Promega) 3.2.4. Tạo dòng sản phẩm cDNA vào vector và kiểm tra sự hiện diện của nó trong vector Sản phẩn cDNA tinh sạch được gắn vào vector pGEM®-T Easy. Hỗn hợp phản ứng gắn của cDNA và vector được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến. Nuôi cấy tế bào này trên môi trường chọn lọc LB + 1,5% agar + Km (50 mg/mL) + 0,1M IPTG + X-gal (20 mg/mL) ở 37oC qua đêm. Chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn khuẩn lạc trắng xanh. Do vị trí gắn DNA ngoại lai trong vector nằm giữa gen lacZ nên khi vector có mang đoạn DNA ngoại lai thì gen lacZ sẽ bị bất hoạt tế bào mang loại plasmid này sẽ không sinh được enzyme phân giải cơ chất là X-gal nên có màu trắng. Trường hợp vector không mang DNA ngoại lai, vector được đóng vòng gen lacZ hoạt động sinh enzyme phân giải X-gal tạo màu xanh. 38 Kết quả nuôi cho thấy xuất hiện cả hai loại khuẩn lạc trắng, xanh chứng tỏ đã có phản ứng gắn DNA ngoại lai vào vector và quá trình biến nạp vector vào tế bào khả biến thành công (hình 3.13). Với kết quả này chúng tôi nhận định có thể tiến hành thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm cDNA cần tạo dòng trong vector. Hình 3.13. Khuẩn lạc trắng và xanh của chủng E. coli DH5α sau khi nuôi 16 giờ Khuẩn lạc đơn trắng được sử dụng để PCR trực tiếp chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector có đoạn cDNA chèn vào mong muốn. Kết quả điện sản phẩm PCR được trình bày ở hình 3.14. M 1 2 3 4 5 6 P ~1100 bp 1089 bp 123 bp Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR P: Đối chứng (sản phẩm cDNA tinh sạch) 1; 2; 3; 4; 5; 6: Sản phẩm PCR M: Leader 123 bp (Invitrogen) 39 Hình ảnh điện di cho thấy phản ứng PCR cho sản phẩm DNA có kích thước tương ứng với sản phẩm cDNA được tạo dòng. Với kết quả này có thể có thể nhận định sản phẩm cDNA đã được tạo dòng thành công trong vector. Có thể tiến hành nuôi cấy thu sinh khối E. coli để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Khuẩn lạc đơn trắng gồm tế bào mang vector có chứa đoạn cDNA chèn vào sau khi kiểm tra bằng PCR được nuôi cấy lắc 200 rpm trong 50 ml môi trường LB + ampicillin (50 µg/ml) ở 37oC trong 24 giờ, ly tâm thu sinh khối tế bào để tách chiết plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System. Nồng độ plasmid tải tổ hợp được kiểm tra bằng máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer đạt từ 150 ng/µL đến 250 ng/µL. Chất lượng plasmid còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% , 100V, chụp hình bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.15. Nhìn chung, sản phẩm plasmid tái tổ hợp sau khi tách chiết có chất lượng rất tốt và có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. M P P 2027 bp 564 bp Hình 3.15. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp P: Plasmid tái tổ hợp M: Marker /Hind III (Promega) 40 Việc kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector còn được tiến hành bằng phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt hạn chế EcoRI. Kết quả phản ứng cắt hạn chế được trình bày ở hình 3.16. Trên hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 1100 bp và 3000 bp. Hai băng này có kích thước tương ứng với vector pGEM®-T Easy (3015 bp) và sản phẩm cDNA được tạo dòng (~1100 bp) . Với kết quả này có thể nhận định sản phẩm cDNA đã được tạo dòng thành công, có thể nuôi dòng tế bào này để tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp và giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng. P V RT M ~3000 bp 2027 bp ~1100 bp 564 bp Hình 3.16. Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt hạn chế P: Plasmid tái tổ hợp V: Plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI RT: Đối chứng (sản phẩm cDNA dùng tạo dòng) M: Marker /Hind III (Promega) 3.3. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE SẢN PHẨM cDNA ĐƯỢC TẠO DÒNG Sản phẩm cDNA tạo dòng trong vector pGEM®-T Easy được tiến hành giải trình tự nucleotide trên máy ABI-3130. Primer sử dụng trong quá trình giải trình tự là M13 foward và M13 reverse trên vector. Kết quả giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng trình bày ở hình 3.17. 41 1 ATGCACTCTT ACCAGCTTCT TGGCCTGGCC GCTGTCGGCT CCCTCGTCTC TGCCGCCCCC 61 GCGCCTTCTC GCGTCTCCGA GTTCGCTAAG AAGGCCTCTA CCTGCACCTT CACCTCTGCC 121 TCTGAGGCCA GCGAGAGCAT CTCCAGCTGC TCCGATGTTG TCCTGAGCAG CATCGAGGTC 181 CCCGCTGGCG AGACCCTCGA CCTGTCCGAT GCTGCTGATG GCTCCACCAT CACCTTCGAG 241 GGCACCACTT CCTTCGGATA CAAGGAATGG AAGGGTCCCC TGATCCGCTT CGGTGGTAAG 301 GACCTGACCG TCACCATGGC CGACGGCGCT GTCATCGACG GTGACGGTTC CCGCTGGTGG 361 GACAGCAAGG GTACCAACGG TGGCAAGACC AAGCCCAAGT TCATGTACAT CCACGATGTT 421 GAGGACTCGA CCTTCAAGGG CATCAACATC AAGAACACTC CCGTCCAGGC CATCAGTGTC 481 CAGGCTACCA ACGTCCACCT GAACGACTTC ACCATCGACA ACTCCGACGG TGATGACAAC 541 GGTGGTCACA ACACCGACGG TTTCGACATC AGCGAGTCCA CCGGTGTCTA CATCAGCGGT 601 GCTACCGTCA AGAACCAGGA CGACTGCATT GCCATCAACT CTGGCGAGAG CATCTCTTTC 661 ACCGGCGGTA CCTGCTCCGG TGGCCACGGT CTCTCCATCG GCTCTGTCGG TGGCCGTGAT 721 GACAACACCG TCAAGAACGT GACCATCTCC GACTCCACTG TCAGCAACTC CGCCAACGGT 781 GTCCGCATCA AGACCATCTA CAAGGAGACC GGTGATGTCA GCGAGATCAC CTACTCTAAC 841 901 961 1021 1081 ATCCAGCTCT TCTCCCACCG ACCGGTACTC TCTGACTGGA AACGTTCCTT CCGGAATCAC GCACCCCCTC TTGAGGATGA CCTGGTCCGG CCGGTGCTTC CGACTACGGT CACCGGTATC CGCCACCCAG TGTTGACCTC TTGCTAA ATCGTCATCG CCCATCACTG GTCTACATTC TCTGGTGGCA AGCAGGACTA ATGTCACCGT TCTGCGGTGA AGACCAGCGA CGAGAACGGC TGACGGTGTC CGGCTCTTGC TAAATGCGAG Hình 3.17. Trình tự nucleotide của sản phẩm cDNA được tạo dòng Phân tích trình tự nucleotide sản phẩm cDNA được tạo dòng bằng công cụ BLAST. Kết quả phân tích cho thấy thấy trình một dòng cDNA của gen polygalacturonase I được tạo dòng gồm 1107 bp chứa một khung đọc mở (ORF) 1104 bp mã hóa cho 368 amino acid, vị trí bộ ba mở đầu ở nucleotide thứ 1, bộ ba kết thúc nằm ở vị trí 1105. Trình tự amino acid suy diễn của gen polygalacturonase I được dịch bằng chương trình BioEdit trình bày ở hình 3.18. 1 MHSYQLLGLA AVGSLVSAAP APSRVSEFAK KASTCTFTSA SEASESISSC SDVVLSSIEV 61 PAGETLDLSD AADGSTITFE GTTSFGYKEW KGPLIRFGGK DLTVTMADGA VIDGDGSRWW 121 DSKGTNGGKT KPKFMYIHDV EDSTFKGINI KNTPVQAISV QATNVHLNDF TIDNSDGDDN 181 GGHNTDGFDI SESTGVYISG ATVKNQDDCI AINSGESISF TGGTCSGGHG LSIGSVGGRD 241 DNTVKNVTIS DSTVSNSANG VRIKTIYKET GDVSEITYSN IQLSGITDYG IVIEQDYENG 301 SPTGTPSTGI PITDVTVDGV TGTLEDDATQ VYILCGDGSC SDWTWSGVDL SGGKTSDKCE 361 NVPSGASC Hình 3.18. Trình tự aa suy diễn của gen polygalacturonase I được tạo dòng từ chủng A. niger CH13I 42 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN POLYGALACTURONASE I ĐƯỢC TẠO DÒNG TỪ CHỦNG Aspergillus niger CH13I So sánh trình tự nucleotide và trình tự aa của gen polygalacturonase I (pgaI-CH) phân lập được và một số gen polygalacturonase I đã được công bố trên GenBank bằng chương trình BioEdit, kết quả cho thấy: - Gen pgaI-CH phân lập được có trình tự nucleotide tương đồng 98,9% với gen pgaI (XM_001389525) của chủng A. niger CBS 513.88 (2007); tương đồng 99,3% với trình tự CDS của gen pgaI (X58892) của chủng A. niger N400 (1991); tương đồng 96,6% với gen pgaI (GQ251519) của chủng A. niger M1 (2009). - Trình tự aa suy diễn của gen pgaI-CH được tạo dòng tương đồng 100% với trình tự aa được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger CBS 513.88 và pgaI của chủng A. niger N400, và tương đồng 96% với trình tự aa được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger M1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide 4 gen pgaI được trình bày ở hình 3.19. pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGCCTGGCCGCTGTCGGCTCCCTCGTCTCTGCCGCCCCC M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P ............................................................ M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P ............AG.....A.....................................TT. M H S Y R L H G L A A V G S L V S A A F ............................................................ M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCGCCTTCTCGCGTCTCCGAGTTCGCTAAGAAGGCCTCTACCTGCACCTTCACCTCTGCC A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A ..T......................................................... A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A ..T.........................T..................A............ A P S R V S E F A M K A S T C T F T S A ..T......................................................... A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCTGAGGCCAGCGAGAGCATCTCCAGCTGCTCCGATGTTGTCCTGAGCAGCATCGAGGTC S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V ............................................................ S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V ............................................................ S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V ............................................................ S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V 43 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CCCGCTGGCGAGACCCTCGACCTGTCCGATGCTGCTGATGGCTCCACCATCACCTTCGAG P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E .................G.......................................... P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E .................G.......................................... P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E ............................................................ P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGCACCACTTCCTTCGGATACAAGGAATGGAAGGGTCCCCTGATCCGCTTCGGTGGTAAG G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K ............................................................ G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K .............G.............................................. G T T S C G Y K E W K G P L I R F G G K ...................................C........................ G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GACCTGACCGTCACCATGGCCGACGGCGCTGTCATCGACGGTGACGGTTCCCGCTGGTGG D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W ..T......................................................... D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W A.T......................................................... N L T V T M A D G A V I D G D G S R W W ..T.....T................................................... D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GACAGCAAGGGTACCAACGGTGGCAAGACCAAGCCCAAGTTCATGTACATCCACGATGTT D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V ........................................................C... D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V ........................................................C... D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V ............................................................ D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGGACTCGACCTTCAAGGGCATCAACATCAAGAACACTCCCGTCCAGGCCATCAGTGTC E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V ...................................T........................ E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V ...................................T........................ E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V ............................................................ E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| CAGGCTACCAACGTCCACCTGAACGACTTCACCATCGACAACTCCGACGGTGATGACAAC Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N ............................................................ Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N ...........A................................................ Q A T K V H L N D F T I D N S D G D D N ............................................................ Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N 44 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGTGGTCACAACACCGACGGTTTCGACATCAGCGAGTCCACCGGTGTCTACATCAGCGGT G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G .....C...................................................... G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G .....C....GGT........G...................................... G G H R S D G V D I S E S T G V Y I S G .....C................................T..................... G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GCTACCGTCAAGAACCAGGACGACTGCATTGCCATCAACTCTGGCGAGAGCATCTCTTTC A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F ............................................................ A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F ............................................................ A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F ............................................................ A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACCGGCGGTACCTGCTCCGGTGGCCACGGTCTCTCCATCGGCTCTGTCGGTGGCCGTGAT T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D ............................................................ T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D ............................................................ T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D ............................................................ T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GACAACACCGTCAAGAACGTGACCATCTCCGACTCCACTGTCAGCAACTCCGCCAACGGT D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G ........................................................T... D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G ........................................................T... D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G ............................................................ D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GTCCGCATCAAGACCATCTACAAGGAGACCGGTGATGTCAGCGAGATCACCTACTCTAAC V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N ................................C.......................C... V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N ...............................AC.......................C... V R I K T I Y K E T D D V S E I T Y S N ............................................................ V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATCCAGCTCTCCGGAATCACCGACTACGGTATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGC I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G ..............C............................................. I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G ..............C............................................T I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G ............................................................ I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G 45 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 pgaI XM_001389525 GQ251519 X58892 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCTCCCACCGGCACCCCCTCCACCGGTATCCCCATCACTGATGTCACCGTTGACGGTGTC S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V ...............................................T............ S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V ....G..........................................T............ S R T G T P S T G I P I T D V T V D G V ............................................................ S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ACCGGTACTCTTGAGGATGACGCCACCCAGGTCTACATTCTCTGCGGTGACGGCTCTTGC T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C .....C...................................................... T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C .....C......................................G.TA............ T G T L E D D A T Q V Y I L W V D G S C ...........C................................................ T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TCTGACTGGACCTGGTCCGGTGTTGACCTCTCTGGTGGCAAGACCAGCGATAAATGCGAG S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E ............................................................ S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E ............................................................ S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E ............................................................ S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E 1090 1100 ....|....|....|....|....|.. AACGTTCCTTCCGGTGCTTCTTGCTAA N V P S G A S C * ........................... N V P S G A S C * ..................... N V P S G A S X ........................... N V P S G A S C * Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự nucleotide và trình tự aa suy diễn của gen pgaI-CH phân lập được với các gen pgaI khác Kết quả so sánh cho thấy gen pgaI của các chủng nghiên cứu không có sự sai khác nhiều trình tự nucleotide. Đồng thời, có sự bảo tồn cao trình tự amio acid. Đa số các đột biến xảy ra đều là đột biến thay thế nucleotide nhưng vẫn mã hóa cho amino acid như cũ. 46 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A. KẾT LUẬN 1. Đã phân lập được một chủng A. niger có khả năng sinh pectinase cao. 2. Đã phân lập được gen pectinase có kích thước 1107 bp chứa một khung đọc mở mã hóa cho 368 amino acid. 3. Phân tích trên cơ sở dữ liệu của GenBank cho thấy gen pectinase phân lập được là polygalacturonase I (pgaI-CH). 4. Gen pgaI-CH có trình tự nucleotide tương đồng 98,9% với gen pgaI (XM_001389525) của chủng A. niger CBS 513.88 (2007); tương đồng 99,3% với trình tự CDS của gen pgaI (X58892) của chủng A. niger N400 (1991); tương đồng 96,6% với gen pgaI (GQ251519) của chủng A. niger M1 (2009). 5. Trình tự amino acid suy diễn của gen pgaI-CH tương đồng 100% với trình tự amino acid được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger CBS 513.88 và pgaI của chủng A. niger N400, tương đồng 96% với trình tự amino acid được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger M1. B. ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen polygalacturonase I phân lập được. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Ngọc Chấu (1999), Nghiên cứu một số đặc tính và ứng dụng của enzyme pectinase từ Aspergillus niger, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Thùy Châu (2007), “Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axít amin và enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp”, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước, mã số: KC.04.20. 3. Nguyễn Lân Dũng (2006), Vi Nấm, Chương trình vi sinh vật họcVietsciences. 4. Lê Thị Thanh Hương, Nguyễn Thuỳ Châu (2005), “Phân lập tuyển chọn một số chủng nấm Aspergillus niger sinh enzym pectinaza cao từ một số phế phụ phẩm nông sản”, TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 15, tr. 37-38. 5. Hồ Xuân Hương (2002), Thu nhận và sử dụng enzyme pectinase trong sản xuất nước dứa, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Huế. 7. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, Lê Việt Dũng (2009), Giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp, Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình sinh học phân tử, Nxb Đại học Huế. 9. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc (1996), Công nghệ vi sinh vật, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh. 48 10. Lê Hồng Phú, Nguyễn Ðức Lượng (2007), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sỹ, Trường Ðại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 11. Lê Hồng Phú, Nguyễn Ðức Lượng (2008), “Nghiên cứu chế tạo chế phẩm biocoffee-1 từ Aspergillus niger và ứng dụng lên men các loại cà phê”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 12 (11), tr. 53-60. 12. Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng (2008), “Thu nhận enzyme pectinase từ A. niger - tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 8 (11), tr. 46-50. 13. Nguyễn Quang Tâm, Lê Thị Hồng Nga, Đồng Thị Thanh Thu, Nguyễn Thị Tuyết Thanh (2002), “Tinh sạch và cố định enzyme pectinase thu nhận từ một số chủng nấm mốc”, Báo cáo Hội nghị Khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 187193. 14. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học tập 1: Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 15. Quyền Đình Thi. Nông Văn Hải (2008), Công nghệ sinh học tập 2: Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội. Tiếng Anh 16. Alkorta I., Garbisu C, Llama M. J., Serra J. L. (1998), “Industrial applications of pectic enzymes: a review”, Process Biochemistry 33(I), pp. 21-28. 17. Bai Z. H., Zhang H. X., Qi H. Y., Peng X. W., Li B. J. (2004), “Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid 49 state fermentation for eliciting plant disease resistance”, Bioresource Technology, 95, pp 49-52. 18. Berka R. M., Dunn-Coleman N., Ward M. (1992), “Industrial enzymes from Aspergillus species”, Biotechnology , 23, pp. 155-202. 19. Bussink H. J. D., Brouwer K. B., Graaff de L. H., Kester H. C. M.,Visser J. (1991), “Identification and characterization of a second polygalacturonase gene of Aspergillus niger”, Current Genetics, 20. pp. 301-307. 20. Bussink H. J. D., Buxton F. P., Fraaye B. A., Graaff L. H., Visser J. (1992), “The polygalacturonases of Aspergillus niger are encoded by a family of diverged genes”, European Journal of Biochemistry, 208, pp. 83-90. 21. Gysler C., Harmsen J. A. M.,Kester H. C. M., Visser J., Heim J. (1990), “Isolation and structure of the pectin lyase D-encoding gene from Aspergillus niger”, Gene, 89, pp. 101-108. 22. Harmsen J. A. M., Kusters-van S. M. A., Visser J. (1990), “Cloning and expression of a second Aspergillus niger pectin lyase gene (pelA): Indications of a pectin lyase gene family in A. niger”, Current Genetics, 18, pp. 161-166. 23. Hendrik J. D., Bussink, Buxton F. P., Fraaye B. A., Graaff L. H., Visser J. (1992), “The polygalacturonases of Aspergillus niger are encoded by a family of diverged genes”, European Journal of Biochemistry, 208 pp. 83-90. 24. Jayaraman A., Muthusamy P., Subbaiyan M., Krishnasamy S. (2002), “Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinase”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 94 (4), pp. 299-303. 50 25. Kashyap D. R. , Vohra S. P. K., Chopra , Tewari R. (2001), “Applications of pectinases in the commercial sector”. Bioresource Technology, 77, pp. 215-227. 26. Kirk O., Borchert T. V., Fuglsang C. C. (2002), “Industrial enzyme applications”, Current Opinion in Biotechnology, 13 (4), pp.345-351. 27. Khanh N. Q., Ruttkowski E., Leidinger K., Albrecht H., Gottschalk M. (1991), “Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger”, Gene, 106, pp. 71-77. 28. Margo A., Kusters-van S., Jan A. M., Harmsen, Harry C. M., Kester, Visser J. (1991), “Structure of the Aspergillus niger pelA gene and its expression in Aspergillus niger and Aspergillus nidulans”, Current Genetics, 20, pp. 293-299. 29. Miller B. J. N. (1986), “An Introduction to Pectins: Structure and Properties”, ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC. 30. Mukadam D. S., Chavan A. M., Taware A. S., Taware S. D. (2009), “Isolation cloning and molecular characterization of polygalacturonase I (pgaI) gene from Aspergillus niger isolate from mango”, Indian Journal of Biotechnology, 9, pp. 153-159. 31. Naidu G. S. N., Panda T. (1998), “Production of pectolytic enzymes - a review”, Bioprocess Engineering, 19, pp. 355-361. 32. Parenicova L., Benen J. A. E., Kester H. C. M., Visser J. (2000), “pgaA and pgaB encode two constitutively expressed endopolygalacturonases of Aspergillus niger” Biochemical Journal, 345, pp. 637-644. 33. Pandey A., Selvakumar P., Soccol C. R., Nigam P. (1999), “Solid state fermentation for the production of industrial enzymes”, Current Sciences, 77, pp. 149-162. 51 34. Pel et al (2007), “Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88”, Nature Biotechnology, 25, pp. 221-231. 35. Ranveer S. J., Shivalika S., Reena G. (2005), “Microbial pectinolytic enzymes: A review”, Process Biochemistry, 40 pp. 2931-2944. 36. Reid I., Ricard M. (2000), “Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide” Enzyme and Microbial Technology, 26, pp. 115-123. 37. Ruttkowski E, Khanh N. Q., Wientjens F. J., Gottschalk M. (1991), “Characterization of a polygalacturonase gene of Aspergillus niger RH5344”, Molecular Microbiology, 5 (6), pp.1353-1361. 38. Ruttkowski D., Labitzke R., Khanh N. Q., Lofffler F., Gottschalk M., Klaus-D. J., (1990), “Cloning and DNA sequence analysis of a polygalacturonase cDNA from Aspergillus niger RH5344”, Biochimica et Biophysica Acta, 1087, pp. 104-106. 39. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert J., Vandamme E.J. (1993), “Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties and applications”, Advances in Applied Microbiology, 39, pp. 213-294. 40. Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning a laboratory manua, CSHL Press, Vol 1,2,3. 41. Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J. C., P. Dijck van W. M., (2002), “On the safety of Aspergillus niger - a review”, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, pp. 426-435. 42. Solis-Pereira S., Favela-Torres E., Viniegra-Gonzfilez G., GutirrezRojas M. (1993), Effects of different carbon sources on the synthesis of pectinase by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentations, Applied Microbiol Biotechnol, 39, pp. 36-41. 52 43. Suykerbuyk M. E. G., Kester H. C. M., Peter J., Schaap, Stam H., Musters W., Visser J. (1997), “Cloning and characterization of two rhamnogalacturonan hydrolase genes from Aspergillus niger” Applied and Environmental Microbiology, (63), pp. 2507-2515. [...]... thường dùng các chế phẩm pectinase để cải thiện chất lượng cà phê [24] 1.4 TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger Pectinase từ Aspergillus niger được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nên gen mã hóa pectinase rất được quan tâm nghiên cứu Gen pectinase của Aspergillus niger là một họ gen, gồm nhiều gen mã hóa các loại pectinase thực hiện các chức năng khác nhau Nhiều nghiên cứu khác nhau trên khắp... Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger 2 Mục tiêu của đề tài Phân lập gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Aspergillus niger Apergillus niger thuộc ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus Apergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phân giải chất... Nam, hiện chưa có công bố nào về tạo dòng gen pectinase từ Aspergillus niger 20 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu là Aspergillus niger 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Luận văn được tiến hành trong... Kết quả xác định được 2 gen là rhamnogalacturonan hydrolase A (rhgA GenBank: X94220) và B (rhgB GenBank: X94221) Hai gen này giống với gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus lần lượt là 78% và 72% Hai gen rhgA, rhgB đều có 3 đoạn intron và 3 đoạn exon, trong đó gen rhgA mã hóa cho 446 aa và rhgB mã hóa cho 558 aa [43] Parenicova và cs (2000) tạo dòng gen mã hóa 2 endo-polygalacturonase... [37] Bussink và cs (1992) đã tạo dòng gen polygalacturonases C Kết quả xác định được gen polygalacturonases C (pgaC GenBank: X64356) dài 2034 bp, gồm 4 đoạn exon và 3 đoạn intron mã hóa cho 383 aa [20] Suykerbuyk và cs (1997) đã tạo dòng 2 gen rhamnogalacturonan hydrolase từ thư viện genome của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sử dụng gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus làm... bộ genome năm 2007 đã xác định được rất nhiều gen khác nhau trong genome của Aspergillus niger Tuy nhiên, rất nhiều trình tự trong genome chỉ mới tạm thời dự đoán chức năng và cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để làm rõ chức năng cũng như điều kiện biểu hiện của chúng Gysler và cs (1990) đã tạo dòng gen pectin lyase D (pelD GenBank: M55657) từ chủng Aspergillus niger N756 bằng cách sàng lọc thư viện 17 genome... dựa trên gen pectin lyase D (pelD) trong nghiên của Gysler và cs (1990) Kết quả xác định được trình tự mã hóa gen pelA gồm 1355 bp trong đó khung đọc mở (ORF) dài 1137 bp mã hóa cho 379 aa có 20 aa peptide tín hiệu Trình tự aa của pelA được xác định là giống 69% với gen pelD trong nghiên cứu của Gysler [22], [28] Ruttkowski và cs (1990) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase từ chủng Aspergillus niger RH5344... hai gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: X58892) và polygalacturonase II (pgaII GenBank: X58893) được tạo dòng từ chủng Aspergillus niger N400 Trong đó, gen pgaI có hộp TATA nằm vị trí -152 và hộp CAAT giả định nằm ở vị trí -218 so với codon mở đầu, có hai đoạn intron ngắn 52 bp và 62 bp, mã hóa cho 368 aa Gen pgaII có một đoạn intron ngắn 52 bp, mã hóa cho 362 aa [19] Ruttkowski và cs (1991) đã tạo. .. là endo-polygalacturonase A (pgaA GenBank: Y18804) và endo- polygalacturonase B (pgaB GenBank: Y18805) Kết quả xác định được gen 19 pgaA dài 1167 bp trong đó có một đoạn intron và mã hóa cho 370 aa, gen pgaB dài 1234 bp có 2 đoạn intron và mã hóa cho 362 aa [32 ] Mukadam và cs (2009) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: GQ251519) từ chủng Aspergillus niger M1 Kết quả xác định được trình... probe là gen pectin lyase I được xác định trong nghiên cứu của Houdenhoven và cs (1975) Kết quả xác định được gen pectin lyase D dài 2716 bp có 4 đoạn intron ngắn 57-65 bp, mã hóa cho 373 aa có 19 aa peptide tín hiệu [21] Harmsen và cs (1990), Margo và cs (1991) đã nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectin lyase (pelA GenBank: X60724) của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sàng lọc thư viện genome ... phát từ lý trên, chọn đề tài Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger Mục tiêu đề tài Phân lập gen mã hóa pectinase từ Aspergillus niger 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Aspergillus. .. bố tạo dòng gen pectinase từ Aspergillus niger 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Aspergillus niger 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU... chế phẩm pectinase để cải thiện chất lượng cà phê [24] 1.4 TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger Pectinase từ Aspergillus niger ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nên gen mã hóa pectinase