2. Mục tiêu của đề tài
3.1.3. Định danh Aspergillus niger bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Chủng A. niger CH13I được tiến hành định danh bằng giải trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA tại công ty Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh. Kết quả giải trình tự trình tự trên gen 28S rRNA được trình bày ở hình 3.7.
1 GACTCCTTGG TCCGTGTTTC AAGACGGGTC GTTTACGACC ATTATGCCAG CGTCCGTGCC 61 GAAGCGCGTT CCTCGGTCCA GGCTGGCCGC ATTGCACCCC TGGCTATAAG GTGCCCCGGA 121 GGGCACTACA TTCCAGGGGC CTTTGACCGG CCGCCCAAAC CGACGCTGGC CCGCCCACGG 181 GGAAGTACAC CGGCACGAAT GCCGGCTGAA CCCCGCGGGC GAGTCTGGTC GCAAGCGCTT 241 CCCTTTCAAC AATTTCAC
Kết quả BLAST trên GenBank cho thấy trình tự trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CH13I tương đồng 100% với trình tự trên gen 28S rRNA của chủng A. niger CBS 513.88 (chủng được giải trình tự toàn bộ genome). Trình tự này tương đồng dưới 92% so với các loài khác thuộc chi Aspergillus.
Query 1 GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGTTTACGACCATTATGCCAGCGTCCGTGCC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 96 GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGTTTACGACCATTATGCCAGCGTCCGTGCC 155 Query 61 GAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACCCCTGGCTATAAGGTGCCCCGGA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 156 GAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACCCCTGGCTATAAGGTGCCCCGGA 215 Query 121 GGGCACTACATTCCAGGGGCCTTTGACCGGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCACGG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 216 GGGCACTACATTCCAGGGGCCTTTGACCGGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCACGG 275 Query 181 GGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCCGCGGGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 276 GGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCCGCGGGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTT 335 Query 241 CCCTTTCAACAATTTCAC 258 |||||||||||||||||| Sbjct 336 CCCTTTCAACAATTTCAC 353
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA
của chủng A. niger CH13I và A. niger CBS 513.88
3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ 0,5-1 g sinh khối A. niger được hòa tan trong 100 μL dung dịch DEPC 0,1%. Nồng độ RNA tổng số được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer đạt từ 100 ng/μL đến 300 ng/μL. Độ hấp thụ quang ở bước sóng 230/260 nm của RNA tổng số đạt 1,66-1,80 cho thấy nó có độ tinh sạch tốt. Chất lượng RNA tổng số còn được kiểm tra bằng điện di agarose gel 1,2%. Kết quả điện di RNA tổng số được trình bày ở hình 3.9.
Với kết quả này chúng tôi nhận định RNA tổng số ít bị đứt gãy, tương đối sạch và nồng độ đạt yêu cầu có thể bảo quản để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA
Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA từ RNA tổng số của chủng A. niger CH13I được thực hiện bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp primer 1 và primer 2. Sản phẩm phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, nhuộm EtBr (0,5 µg/ml) trong 15 phút. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.10.
Phân tích hình ảnh điện di cho thấy với cặp primer 1 phản ứng RT-PCR có phản ứng tổng hợp cDNA và khuếch đại được một đoạn cDNA có kích thước khoảng 1100 bp. Không có phản ứng tổng hợp xảy ra với cặp primer 2.
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR
1; 2: Sản phẩm phản ứng RT-PCR với cặp primer 2
3; 4; 5; 6; 7: Sản phẩm phản ứng RT-PCR với cặp primer 1
M: Marker /Hind III (Promega)
564 bp 2027 bp ~1100 bp
3 4 5 6 7 M 1 2
Thực hiện phản ứng RT-PCR từ RNA tổng số của chủng A. niger
CH13I với cặp primer 1 trong thể tích 50 µL nhằm thu một lượng lớn cDNA để tạo dòng trong vector. Sản phẩm phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, nhuộm EtBr (0,5µg/ml) trong 15 phút, chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di lượng lớn sản phẩm phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.11.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di lượng lớn sản phẩm phản ứng RT-PCR
P: Sản phẩm RT-PCR
M: Marker /Hind III (Promega)
3.2.3. Tinh sạch sản phẩm cDNA từ phản ứng RT-PCR
Băng chứa cDNA được cắt ra khỏi gel agarose và cho vào mỗi tube eppendorf khoảng 400 mg và tiến hành tinh sạch bằng kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Sau khi tinh sạch, cDNA được hòa tan trong 50 L nuclear free water.
Nồng độ cDNA được kiểm tra bằng máy quang phổ NanoDrop ND- 1000 spectrophotometer đạt từ 35 ng/µL đến 100 ng/µL. Chất lượng cDNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V, chụp hình bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR được trình bày ở hình 3.12. Nhìn chung, sản phẩm
M P
~1100 bp 564 bp 2027 bp
cDNA sau khi tinh sạch có chất lượng tốt và có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR
P: cDNA tinh sạch từ phản ứng RT-PCR
M: Marker/Hind III (Promega)
3.2.4. Tạo dòng sản phẩm cDNA vào vector và kiểm tra sự hiện diện của nó trong vector
Sản phẩn cDNA tinh sạch được gắn vào vector pGEM®-T Easy. Hỗn hợp phản ứng gắn của cDNA và vector được biến nạp vào tế bào E. coli
DH5α khả biến. Nuôi cấy tế bào này trên môi trường chọn lọc LB + 1,5% agar + Km (50 mg/mL) + 0,1M IPTG + X-gal (20 mg/mL) ở 37oC qua đêm.
Chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn khuẩn lạc trắng xanh. Do vị trí gắn DNA ngoại lai trong vector nằm giữa gen
lacZ nênkhi vector có mang đoạn DNA ngoại lai thì gen lacZ sẽ bị bất hoạt tế bào mang loại plasmid này sẽ không sinh được enzyme phân giải cơ chất là X-gal nên có màu trắng. Trường hợp vector không mang DNA ngoại lai, vector được đóng vòng gen lacZ hoạt động sinh enzyme phân giải X-gal tạo màu xanh.
~1100 bp 564 bp
2027 bp
Kết quả nuôi cho thấy xuất hiện cả hai loại khuẩn lạc trắng, xanh chứng tỏ đã có phản ứng gắn DNA ngoại lai vào vector và quá trình biến nạp vector vào tế bào khả biến thành công (hình 3.13). Với kết quả này chúng tôi nhận định có thể tiến hành thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm cDNA cần tạo dòng trong vector.
Hình 3.13. Khuẩn lạc trắng và xanh của chủng E. coli DH5α
sau khi nuôi 16 giờ
Khuẩn lạc đơn trắng được sử dụng để PCR trực tiếp chọn lọc dòng tế bào E. coli mang vector có đoạn cDNA chèn vào mong muốn. Kết quả điện sản phẩm PCR được trình bày ở hình 3.14.
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR
P: Đối chứng (sản phẩm cDNA tinh sạch) 1; 2; 3; 4; 5; 6: Sản phẩm PCR M: Leader 123 bp (Invitrogen) M 1 2 3 4 5 6 P ~1100 bp 123 bp 1089 bp
Hình ảnh điện di cho thấy phản ứng PCR cho sản phẩm DNA có kích thước tương ứng với sản phẩm cDNA được tạo dòng. Với kết quả này có thể có thể nhận định sản phẩm cDNA đã được tạo dòng thành công trong vector. Có thể tiến hành nuôi cấy thu sinh khối E. coli để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khuẩn lạc đơn trắng gồm tế bào mang vector có chứa đoạn cDNA chèn vào sau khi kiểm tra bằng PCR được nuôi cấy lắc 200 rpm trong 50 ml môi trường LB + ampicillin (50 µg/ml) ở 37oC trong 24 giờ, ly tâm thu sinh khối tế bào để tách chiết plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System.
Nồng độ plasmid tải tổ hợp được kiểm tra bằng máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer đạt từ 150 ng/µL đến 250 ng/µL. Chất lượng plasmid còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% , 100V, chụp hình bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad). Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.15. Nhìn chung, sản phẩm plasmid tái tổ hợp sau khi tách chiết có chất lượng rất tốt và có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.15. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp
P: Plasmid tái tổ hợp
M: Marker /Hind III (Promega)
564 bp 2027 bp
Việc kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector còn được tiến hành bằng phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt hạn chế EcoRI. Kết quả phản ứng cắt hạn chế được trình bày ở hình 3.16. Trên hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 1100 bp và 3000 bp. Hai băng này có kích thước tương ứng với vector pGEM®-T Easy (3015 bp) và sản phẩm cDNA được tạo dòng (~1100 bp) . Với kết quả này có thể nhận định sản phẩm cDNA đã được tạo dòng thành công, có thể nuôi dòng tế bào này để tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp và giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng.
Hình 3.16. Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt hạn chế
P: Plasmid tái tổ hợp
V: Plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI
RT: Đối chứng (sản phẩm cDNA dùng tạo dòng)
M: Marker /Hind III (Promega)
3.3. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE SẢN PHẨM cDNA ĐƯỢC TẠO DÒNG
Sản phẩm cDNA tạo dòng trong vector pGEM®-T Easy được tiến hành giải trình tự nucleotide trên máy ABI-3130. Primer sử dụng trong quá trình giải trình tự là M13 foward và M13 reverse trên vector. Kết quả giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng trình bày ở hình 3.17.
564 bp ~1100 bp
P V RT M
~3000 bp 2027 bp
1 ATGCACTCTT ACCAGCTTCT TGGCCTGGCC GCTGTCGGCT CCCTCGTCTC TGCCGCCCCC 61 GCGCCTTCTC GCGTCTCCGA GTTCGCTAAG AAGGCCTCTA CCTGCACCTT CACCTCTGCC 121 TCTGAGGCCA GCGAGAGCAT CTCCAGCTGC TCCGATGTTG TCCTGAGCAG CATCGAGGTC 181 CCCGCTGGCG AGACCCTCGA CCTGTCCGAT GCTGCTGATG GCTCCACCAT CACCTTCGAG 241 GGCACCACTT CCTTCGGATA CAAGGAATGG AAGGGTCCCC TGATCCGCTT CGGTGGTAAG 301 GACCTGACCG TCACCATGGC CGACGGCGCT GTCATCGACG GTGACGGTTC CCGCTGGTGG 361 GACAGCAAGG GTACCAACGG TGGCAAGACC AAGCCCAAGT TCATGTACAT CCACGATGTT 421 GAGGACTCGA CCTTCAAGGG CATCAACATC AAGAACACTC CCGTCCAGGC CATCAGTGTC 481 CAGGCTACCA ACGTCCACCT GAACGACTTC ACCATCGACA ACTCCGACGG TGATGACAAC 541 GGTGGTCACA ACACCGACGG TTTCGACATC AGCGAGTCCA CCGGTGTCTA CATCAGCGGT 601 GCTACCGTCA AGAACCAGGA CGACTGCATT GCCATCAACT CTGGCGAGAG CATCTCTTTC 661 ACCGGCGGTA CCTGCTCCGG TGGCCACGGT CTCTCCATCG GCTCTGTCGG TGGCCGTGAT 721 GACAACACCG TCAAGAACGT GACCATCTCC GACTCCACTG TCAGCAACTC CGCCAACGGT 781 GTCCGCATCA AGACCATCTA CAAGGAGACC GGTGATGTCA GCGAGATCAC CTACTCTAAC 841 ATCCAGCTCT CCGGAATCAC CGACTACGGT ATCGTCATCG AGCAGGACTA CGAGAACGGC 901 TCTCCCACCG GCACCCCCTC CACCGGTATC CCCATCACTG ATGTCACCGT TGACGGTGTC 961 ACCGGTACTC TTGAGGATGA CGCCACCCAG GTCTACATTC TCTGCGGTGA CGGCTCTTGC 1021 TCTGACTGGA CCTGGTCCGG TGTTGACCTC TCTGGTGGCA AGACCAGCGA TAAATGCGAG 1081 AACGTTCCTT CCGGTGCTTC TTGCTAA
Hình 3.17. Trình tự nucleotide của sản phẩm cDNA được tạo dòng
Phân tích trình tự nucleotide sản phẩm cDNA được tạo dòng bằng công cụ BLAST. Kết quả phân tích cho thấy thấy trình một dòng cDNA của gen polygalacturonase I được tạo dòng gồm 1107 bp chứa một khung đọc mở (ORF) 1104 bp mã hóa cho 368 amino acid, vị trí bộ ba mở đầu ở nucleotide thứ 1, bộ ba kết thúc nằm ở vị trí 1105. Trình tự amino acid suy diễn của gen polygalacturonase I được dịch bằng chương trình BioEdit trình bày ở hình 3.18.
1 MHSYQLLGLA AVGSLVSAAP APSRVSEFAK KASTCTFTSA SEASESISSC SDVVLSSIEV 61 PAGETLDLSD AADGSTITFE GTTSFGYKEW KGPLIRFGGK DLTVTMADGA VIDGDGSRWW 121 DSKGTNGGKT KPKFMYIHDV EDSTFKGINI KNTPVQAISV QATNVHLNDF TIDNSDGDDN 181 GGHNTDGFDI SESTGVYISG ATVKNQDDCI AINSGESISF TGGTCSGGHG LSIGSVGGRD 241 DNTVKNVTIS DSTVSNSANG VRIKTIYKET GDVSEITYSN IQLSGITDYG IVIEQDYENG 301 SPTGTPSTGI PITDVTVDGV TGTLEDDATQ VYILCGDGSC SDWTWSGVDL SGGKTSDKCE 361 NVPSGASC
Hình 3.18. Trình tự aa suy diễn của gen polygalacturonase I
3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN POLYGALACTURONASE I ĐƯỢC TẠO DÒNG TỪ
CHỦNG Aspergillus niger CH13I
So sánh trình tự nucleotide và trình tự aa của gen polygalacturonase I (pgaI-CH) phân lập được và một số gen polygalacturonase I đã được công bố trên GenBank bằng chương trình BioEdit, kết quả cho thấy:
- Gen pgaI-CH phân lập được có trình tự nucleotide tương đồng 98,9% với gen pgaI (XM_001389525) của chủng A. niger CBS 513.88 (2007); tương đồng 99,3% với trình tự CDS của gen pgaI (X58892) của chủng A. niger
N400 (1991); tương đồng 96,6% với gen pgaI (GQ251519) của chủng A. niger M1 (2009).
- Trình tự aa suy diễn của gen pgaI-CH được tạo dòng tương đồng 100% với trình tự aa được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger CBS 513.88 và pgaI của chủng A. niger N400, và tương đồng 96% với trình tự aa được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger M1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide 4 gen pgaI được trình bày ở hình 3.19.
10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGCCTGGCCGCTGTCGGCTCCCTCGTCTCTGCCGCCCCC M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P XM_001389525 ... M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P GQ251519 ...AG...A...TT. M H S Y R L H G L A A V G S L V S A A F X58892 ... M H S Y Q L L G L A A V G S L V S A A P 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GCGCCTTCTCGCGTCTCCGAGTTCGCTAAGAAGGCCTCTACCTGCACCTTCACCTCTGCC A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A XM_001389525 ..T... A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A GQ251519 ..T...T...A... A P S R V S E F A M K A S T C T F T S A X58892 ..T... A P S R V S E F A K K A S T C T F T S A 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI TCTGAGGCCAGCGAGAGCATCTCCAGCTGCTCCGATGTTGTCCTGAGCAGCATCGAGGTC S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V XM_001389525 ... S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V GQ251519 ... S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V X58892 ... S E A S E S I S S C S D V V L S S I E V
190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI CCCGCTGGCGAGACCCTCGACCTGTCCGATGCTGCTGATGGCTCCACCATCACCTTCGAG P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E XM_001389525 ...G... P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E GQ251519 ...G... P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E X58892 ... P A G E T L D L S D A A D G S T I T F E 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GGCACCACTTCCTTCGGATACAAGGAATGGAAGGGTCCCCTGATCCGCTTCGGTGGTAAG G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K XM_001389525 ... G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K GQ251519 ...G... G T T S C G Y K E W K G P L I R F G G K X58892 ...C... G T T S F G Y K E W K G P L I R F G G K 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GACCTGACCGTCACCATGGCCGACGGCGCTGTCATCGACGGTGACGGTTCCCGCTGGTGG D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W XM_001389525 ..T... D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W GQ251519 A.T... N L T V T M A D G A V I D G D G S R W W X58892 ..T...T... D L T V T M A D G A V I D G D G S R W W 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GACAGCAAGGGTACCAACGGTGGCAAGACCAAGCCCAAGTTCATGTACATCCACGATGTT D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V XM_001389525 ...C... D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V GQ251519 ...C... D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V X58892 ... D S K G T N G G K T K P K F M Y I H D V 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GAGGACTCGACCTTCAAGGGCATCAACATCAAGAACACTCCCGTCCAGGCCATCAGTGTC E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V XM_001389525 ...T... E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V GQ251519 ...T... E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V X58892 ... E D S T F K G I N I K N T P V Q A I S V 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI CAGGCTACCAACGTCCACCTGAACGACTTCACCATCGACAACTCCGACGGTGATGACAAC Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N XM_001389525 ... Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N GQ251519 ...A... Q A T K V H L N D F T I D N S D G D D N X58892 ... Q A T N V H L N D F T I D N S D G D D N
550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GGTGGTCACAACACCGACGGTTTCGACATCAGCGAGTCCACCGGTGTCTACATCAGCGGT G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G XM_001389525 ...C... G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G GQ251519 ...C....GGT...G... G G H R S D G V D I S E S T G V Y I S G X58892 ...C...T... G G H N T D G F D I S E S T G V Y I S G 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GCTACCGTCAAGAACCAGGACGACTGCATTGCCATCAACTCTGGCGAGAGCATCTCTTTC A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F XM_001389525 ... A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F GQ251519 ... A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F X58892 ... A T V K N Q D D C I A I N S G E S I S F 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI ACCGGCGGTACCTGCTCCGGTGGCCACGGTCTCTCCATCGGCTCTGTCGGTGGCCGTGAT T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D XM_001389525 ... T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D GQ251519 ... T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D X58892 ... T G G T C S G G H G L S I G S V G G R D 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GACAACACCGTCAAGAACGTGACCATCTCCGACTCCACTGTCAGCAACTCCGCCAACGGT D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G XM_001389525 ...T... D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G GQ251519 ...T... D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G X58892 ... D N T V K N V T I S D S T V S N S A N G 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI GTCCGCATCAAGACCATCTACAAGGAGACCGGTGATGTCAGCGAGATCACCTACTCTAAC V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N XM_001389525 ...C...C... V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N GQ251519 ...AC...C... V R I K T I Y K E T D D V S E I T Y S N X58892 ... V R I K T I Y K E T G D V S E I T Y S N 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI ATCCAGCTCTCCGGAATCACCGACTACGGTATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGC I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G XM_001389525 ...C... I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G GQ251519 ...C...T I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G X58892 ... I Q L S G I T D Y G I V I E Q D Y E N G
910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI TCTCCCACCGGCACCCCCTCCACCGGTATCCCCATCACTGATGTCACCGTTGACGGTGTC S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V XM_001389525 ...T... S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V GQ251519 ....G...T... S R T G T P S T G I P I T D V T V D G V X58892 ... S P T G T P S T G I P I T D V T V D G V 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI ACCGGTACTCTTGAGGATGACGCCACCCAGGTCTACATTCTCTGCGGTGACGGCTCTTGC T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C XM_001389525 ...C... T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C GQ251519 ...C...G.TA... T G T L E D D A T Q V Y I L W V D G S C X58892 ...C... T G T L E D D A T Q V Y I L C G D G S C 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| pgaI TCTGACTGGACCTGGTCCGGTGTTGACCTCTCTGGTGGCAAGACCAGCGATAAATGCGAG S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E XM_001389525 ... S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E GQ251519 ... S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E X58892 ... S D W T W S G V D L S G G K T S D K C E 1090 1100 ....|....|....|....|....|.. pgaI AACGTTCCTTCCGGTGCTTCTTGCTAA N V P S G A S C * XM_001389525 ... N V P S G A S C * GQ251519 ... N V P S G A S X X58892 ... N V P S G A S C *
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự nucleotide và trình tự aa suy diễn
của gen pgaI-CH phân lập được với các gen pgaI khác
Kết quả so sánh cho thấy gen pgaI của các chủng nghiên cứu không có sự sai khác nhiều trình tự nucleotide. Đồng thời, có sự bảo tồn cao trình tự amio acid. Đa số các đột biến xảy ra đều là đột biến thay thế nucleotide nhưng vẫn mã hóa cho amino acid như cũ.
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
A. KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được một chủng A. niger có khả năng sinh pectinase cao. 2. Đã phân lập được gen pectinase có kích thước 1107 bp chứa một khung đọc mở mã hóa cho 368 amino acid.
3. Phân tích trên cơ sở dữ liệu của GenBank cho thấy gen pectinase phân lập được là polygalacturonase I (pgaI-CH).
4. Gen pgaI-CH có trình tự nucleotide tương đồng 98,9% với gen pgaI
(XM_001389525) của chủng A. niger CBS 513.88 (2007); tương đồng 99,3% với trình tự CDS của gen pgaI (X58892) của chủng A. niger N400 (1991); tương đồng 96,6% với gen pgaI (GQ251519) của chủng A. niger M1 (2009).
5. Trình tự amino acid suy diễn của gen pgaI-CH tương đồng 100% với trình tự amino acid được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger CBS 513.88 và pgaI của chủng A. niger N400, tương đồng 96% với trình tự amino acid được mã hóa bởi gen pgaI của chủng A. niger M1.
B. ĐỀ NGHỊ
Cần tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen polygalacturonase I phân lập được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Ngọc Chấu (1999), Nghiên cứu một số đặc tính và ứng dụng
của enzyme pectinase từ Aspergillus niger, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Thùy Châu (2007), “Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axít amin và enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp”, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước, mã số: KC.04.20.
3. Nguyễn Lân Dũng (2006), Vi Nấm, Chương trình vi sinh vật học- Vietsciences.
4. Lê Thị Thanh Hương, Nguyễn Thuỳ Châu (2005), “Phân lập tuyển chọn một số chủng nấm Aspergillus niger sinh enzym pectinaza cao từ một số phế phụ phẩm nông sản”, TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 15, tr. 37-38.
5. Hồ Xuân Hương (2002), Thu nhận và sử dụng enzyme pectinase trong sản xuất nước dứa, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Huế.
7. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung, Lê Việt Dũng (2009), Giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp, Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình
sinh học phân tử, Nxb Đại học Huế.
9. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc (1996), Công nghệ vi sinh vật, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh.