2. Mục tiêu của đề tài
2.3. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nguyên liệu
-Vỏ cam, chanh, bưởi được thu thập ngoài tự nhiên tại Thành phố Huế - Chủng E. coli DH5α do Viện Tài nguyên - Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế cung cấp.
- Primer Cặp primer 1:
Forward primer 5' ATGCACTCTTACCAGCTTCTTGGCC 3' Reverse primer 5' TTAGCAAGAAGCACCGGAAGGAACG 3' Cặp primer 2:
Forward primer 5' ATGCACTCGTTTGCTTCTCTTCTCG 3' Reverse primer 5' CTAACAAGAGGCCACCGAAGGGA 3' - Vector pGEM®-T Easy (Promega).
Hình 2.1. Sơ đồ vector pGEM®-T Easy
2.3.2. Hóa chất
- Dung dịch DEPC-treated (Ambion) - TRI-reagent (Invitrogen)
- Ethanol 100% - Isopropyl alcohol
- MOPS (3-(N-morpholino)propan sulfonic acid) 1M (Bio-rad) - EDTA 0,5M, pH 8
- NaOAc 3M
- Formaldehyde 37% - Agarose (Bio-Rad)
- Ethidium Bromide (1µg/µL) (Bio-Rad) - Ampicillin
- Pectin (Nacalai)
- Kit RT-PCR: Access RT-PCRSystem (A1250-Promega) - Kit PCR: Green GoTaq (M7122-Promega)
- Kit tinh sạch DNA: Wizard® SVGel and PCR Clean-Up System (A9281-Promega)
- Kit tách chiết plasmid: GeneJET™ Plasmid Miniprep (K0503- Fermentas)
2.3.3. Môi trường
- S.O.C (Invitrogen)
- LB lỏng: 1% tryptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7. Môi trường LB đặc có bổ sung thêm 1,5% agar.
- PDA (Potato Dextroga Agar): Nước chiết khoai tây 1000 ml; agar 2%, glucose 2%; pH 5,5.
- Czapeck Dox (môi trường lên men sinh pectinase): K2HPO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; NaNO3 0,3%; KCl 0,05%; FeSO4.7H2O 0,001%; pectin 1,5%; pH 5,5.
- Môi trường tuyển chọn chủng Apergillus niger sinh tổng hợp pectinase cao: Pectin 0,5%; agar 2% g; pH 5,5.
- Czapeck (môi trường giữ giống Aspergillus niger): K2HPO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; NaNO3 0,3%; KCl 0,05%; FeSO4.7H2O 0,001%; saccarose 3%; agar 2%; pH 5,5.
2.3.4. Trang thiết bị
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf) - Máy Vortex (Eppendorf)
- Máy Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.) - Hệ thống điện di (Bio-Rad)
- Máy PCR (Bio-Rad) - Máy gia nhiệt (Bio-Rad) - Máy đọc gel (Bio-Rad) - Buồng cắt gel (Labnet)
- Máy đo quang phổ (Bio-Rad) - Tủ ấm
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus niger
2.4.1.1. Phân lập Aspergillus niger
Để các mẫu lên mốc. Chuẩn bị các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml dung dịch agar 0,1% vô trùng. Dùng panh cắt mẫu thành miếng nhỏ cho vào mỗi ống nghiệm chứa dung dịch agar vô trùng, lắc mẫu trên máy vortex để hoà tan. Thanh trùng mẫu dịch ở 80oC trong 10 phút để diệt những nhiễm tạp không có bào tử, sau đó để nguội rồi đem phân lập.
Hút 200 µl hỗn dịch cho vào mỗi đĩa petri; đổ môi trường PDA ở nhiệt độ 35-40oC vào đĩa petri và lắc đều đĩa cho hỗn dịch và môi trường hoà đều; để đông môi trường rồi tiến hành nuôi mẫu ở 30oC trong tủ ấm từ 48-72 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành quan sát mốc trên đĩa petri. Chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ có hình thái khuẩn lạc giống A. niger theo mô tả trong khóa phân loại của Robert A. Samson. Cấy các khuẩn lạc này vào các ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PDA. Nuôi mẫu ở 30oC trong tủ ấm từ 48-72 giờ sau đó tiến hành sàng lọc chủng A. niger bằng khóa phân loại Robert A. Samson (1984) và của Katsuhiko Ando (2002).
2.4.1.2. Tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả năng sinh pectinase cao
Các chủng giống sau khi đã phân lập được đem lên men trong 30 ml môi trường Cezapek Dox. Thực hiện việc lên men trên máy lắc 150 rpm ở 30oC trong 3 ngày. Môi trường thạch pectin được phân phối vào các hộp petri, dùng khoan nút đục lỗ trên đĩa thạch. Lấy 1 ml dịch nuôi ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi chứa pectinase. Hút 100 µL dịch lên men cho vào lỗ thạch, ủ các hộp peptri này ở 37oC, sau 24 giờ lấy ra nhỏ dung dịch chỉ thị lugol 1% trên mặt thạch. Xác định hoạt tính pectinase bằng
cách đo vòng phân giải pectin trên môi trường. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng được đánh giá thông qua độ lớn của vòng phân giải pectin.
2.4.1.3. Định danh loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Chọn chủng có vòng phân giải lớn nhất, định danh đến loài chủng được lựa chọn bằng phương pháp giải trình tự bảo thủ trên gen 28S rRNA. Kết quả giải trình tự được BLAST trên GenBank của NCBI để so sánh với trình tự gen 28S rRNA của các loài thuộc chi Aspergillus.
2.4.2. Phương pháp tạo dòng gen
2.4.2.1. Tách chiết RNA tổng số của Aspergillus niger
Tách chiết RNA tổng số của A. niger bằng acid Phenol-Guanidinium Thiocyanate-Chloroform (Tri-reagent) theo Sambrook và cs (2001) [40].
A. niger được nuôi trong bình tam giác có chứa 200 ml môi trường cảm ứng lên men sinh pectin (Cezapek Dox) trong 3 ngày. Sinh khối tế bào được làm sạch bằng cách rửa 2 lần với nước cất khử trùng sau đó rửa lại bằng dung dịch DEPC 0,1%. Tiến hành nghiền mẫu bằng nitơ lỏng hoặc cho vào tủ - 40oC cho đông lại rồi nghiền lạnh. Sau đó cho vào tube eppendorf khoảng 50- 100 mg (khoảng 1/3 thể tích của tube) mẫu đã được nghiền; thêm 1 ml Tri- reagent và vào tube; ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 phút. Bổ sung thêm 200 µL chloroform lạnh votex nhẹ ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút; ly tâm mẫu với tốc độ 15.000 rpm trong 10 phút ở 4oC. Chuyển dịch nổi sau khi ly tâm sang một tube khác và bổ sung thêm 500 µL isopropanol lắc nhẹ trộn đều; ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; ly tâm mẫu với tốc độ 15.000 rpm trong 10 phút ở 40C loại bỏ dịch nổi thu kết tủa RNA. Cho vào 1 ml ethanol 75%; ly tâm ở 10.000 rpm trong 5 phút; loại bỏ dịch nổi (chú ý không để kết tủa màu trắng thoát ra khi loại bỏ ethanol). Để khô kết tủa ở nhiệt độ phòng
trong khoảng 15-20 phút; thêm 50-100 µL dung dịch DEPC 0,1% để hòa tan mẫu. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -70oC để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
RNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo scientific, USA) ở bước sóng 230 nm. Độ tinh sạch được đánh giá thông qua độ hấp thụ ở bước sóng 230/260 nm.
Chất lượng RNA tổng số còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% ở 60V theo phương pháp điện di RNA tổng số có sử dụng formaldehyde để biến tính của Sambrook và cs [40]. Trong 50 ml gel bao gồm: 0,6 g agarose được pha trong 31,1 ml dung dịch DEPC 0,1%, đun nóng cho đến khi agarose tan hết; để nguội đến 65oC cho thêm 10 ml MEA 5× và 8,9 ml formaldehyde 37%. Đệm điện di được sử dụng là MEA 1×. Nhuộm gel trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) 0,5 µg/ml 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa trong dung dịch DEPC 0,1% trong 3 giờ. Hình ảnh điện di được chụp bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad).
2.4.2.2. Thiết kế primers
Hai cặp primer để tạo dòng gen pectinase được thiết kế dựa theo gen pectinase trên GenBank có mã XM_001389525 và XM_001397030.
2.4.2.3. Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA
Thực hiện phản ứng RT-PCR từ RNA tổng số sử dụng kit Access RT- PCR System (Promega). Phản ứng RT-PCR được thực hiện trong 50 µL dung dịch phản ứng gồm: 100 ng RNA tổng số; 20 pmol mỗi loại primer; 1 µL (10 mM/µL mỗi loại) dNTPs; 2 µL (25 mM/µL) MgSO4; 10 µL AMV/Tfl 5×
Buffer; 1 µL (5 U/µL) AMV Reverse Transciptase; 1 µL (5 U/µL) Tfl DNA
Polymerase.
Phản ứng RT-PCR được tiến hành trong máy luân nhiệt MJ Mini Cyler (Bio-Rad) theo quy trình sau: 45oC trong 45 phút: 1 chu kỳ; 94oC trong 2
phút: 1 chu kỳ; 94oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút, 68oC trong 2 phút: 40 chu kỳ; 68oC trong 7 phút: 1 chu kỳ; 4oC: 1 chu kỳ để bảo quản.
Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1×. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5 g/ml), chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad).
2.4.2.4. Tinh sạch cDNA từ sản phẩm phản ứng RT-PCR
Thực hiện phản ứng RT-PCR sản xuất cDNA lượng lớn sau đó tinh sạch bằng kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR, chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad) sau đó cắt băng mong muốn. Gel sau khi được cắt cho vào tube eppendorf; thêm dung dịch membrane binding theo tỷ lệ 1 μL membrane minding cho 1 mg gel; vortex và ủ ở nhiệt độ 50-65oC cho đến khi gel hòa tan hết. Chuyển gel đã hòa tan vào cột tinh sạch ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; sau đó ly tâm cột tinh sạch ở 14.000 rpm trong 1 phút; loại bỏ dịch thu được. Thêm 700 μL dung dịch membrane mash; ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút loại bỏ dịch thu được; lặp lại bước trên với 500 μL dung dịch membrane wash ly tâm ở 14.000 rpm trong 5 phút. Chuyển cột tinh sạch sang tube eppendorf và cho 50 μL nuclear free water ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; ly tâm ở 14.000 rpm trong 1 phút thu dịch có chứa cDNA. Sản phẩm cDNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.2.5. PCR
PCR được thực hiện bằng kit GoTaq® Green Master Mix (Promega). Trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm: 150 ng sản phẩm DNA khuôn mẫu hoặc một ít tế bào E. coli; 20 pmol mỗi loại primer; 25 µL GoTaq® Green Master Mix 2×. Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt MJ Mini Cyler (Bio-Rad) theo quy trình sau: 95oC trong 5 phút: 1
chu kỳ; 95oC trong 30 giây, 55oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút 30 giây: 35 chu kỳ; 72oC trong 10 phút: 1 chu kỳ.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1×. Nhuộm gel agarose 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5
g/ml). Hình ảnh điện di được chụp bằng hệ thống Gel Documentation (Bio- Rad).
2.4.2.6. Gắn sản phẩm cDNA vào vector
Sản phẩm cDNA sau khi tinh sạch được gắn vào vector pGEM®-T Easy, trong 10 μL thể tích phản ứng gồm: 50 ng sản phẩm cDNA; 50 ng vector; 1 μL T4 ligase (3 U/μL); 5 μL 2× T4 ligase buffer. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ sau đó ủ 4oC qua đêm.
Hình 2.2. Vị trí gắn sản phẩm cDNA vào vector
2.4.2.7. Chuẩn bị tế bào E. coli khả biến
Tế bào khả biến sử dụng trong thí nghiệm này là chủng E. coli DH5α được chúng tôi sản xuất theo phương pháp CaCl2 (2001) [40].
Nuôi dòng E. coli DH5α trong 5 ml môi trường LB ở 37oC, 200 rpm qua đêm. Lấy 1 ml dịch nuôi qua đêm cho vào bình có chứa 50 ml môi trường
LB nuôi ở 37oC, 200 rpm trong khoảng 1,5-3 giờ cho đến khi mật độ tế bào đo ở OD600 bằng khoảng 0,5. Lấy 50 ml dịch nuôi ly tâm 4.000 rpm ở 4oC loại bỏ dịch nổi sau đó úp ngược tube ly tâm trên giấy thấm khoảng 1 phút loại bỏ hết dịch nuôi thu cặn tế bào. Làm huyền phù lại tế bào trong 12,5 ml CaCl2 0,1M lạnh sau đó ủ trong đá 15 phút; ly tâm 4.000 rpm ở 4oC loại bỏ dịch nổi thấm khô tube bằng cách úp ngược trên giấy thấm khoảng 1 phút. Làm huyền phù lại tế bào với 2 ml CaCl2 0,1M lạnh và 300 µL glycerol lạnh ủ trong đá 2 giờ. Sau đó cho vào mỗi tube efpendoft 100 hoặc 200 µL; làm lạnh nhanh bằng ni tơ lỏng và bảo quản ở -80oC.
2.4.2.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Hỗn hợp phản ứng gắn của sản phẩm cDNA và vector pGEM®-T Easy được biến nạp vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt [40]. Lấy 5 µl hỗn hợp phản ứng gắn cho vào 100 µl tế bào E. coli DH5α khả biến, trộn nhẹ ủ trong đá 1 giờ. Sau đó sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút và làm lạnh nhanh trong đá 5 phút. Thêm vào 0,9 ml môi trường S.O.C nuôi ở 37oC, 150 rpm trong 2 giờ. Sau đó tế bào khả biến này được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường chọn lọc Luria Bertani (LB) + 1,5% agar + ampicilin (50 µg/ml) + 0,1M IPTG + X-gal (20 mg/ml) ở 37oC 16-20 giờ.
Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp có chứa sản phẩm cDNA bằng cách chọn khuẩn lạc màu trắng đánh dấu và lấy một ít tế bào thực hiện phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR. Chọn khuẩn lạc nào mà kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR có băng DNA kích thước tương ứng sản phẩm cDNA được tạo dòng, tiến hành nuôi tế bào E. coli từ khuẩn lạc đó trong môi trường LB lỏng + ampicilin (50 µg/ml) ở 37oC, 200 rpm trong khoảng 15-20 giờ, thu sinh khối tế bào để tách chiết plasmid tái tổ hợp.
2.4.2.9. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Fermentas).
Ly tâm dịch nuôi sau đó loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào; thêm vào 250 μl resuspension rolution vortex làm huyền phù lại tế bào; thêm 250 μl lysis solution trộn nhẹ bằng cách đảo ống 4-6 lần; thêm 350 μl neutralization solution trộn nhẹ bằng cách đảo ống 4-6 lần; ly tâm hỗn hợp trên 11.000 rpm trong 5 phút.
Hút dịch nổi qua cột GeneJET™ spin rồi ly tâm 10.000 rpm 1 phút sau đó loại bỏ dịch thu được. Thêm 500 μl wash solution ly tâm 11.000 rpm 1 phút loại bỏ dịch, lặp lại bước trên thêm một lần; ly tâm lại cột 11.000 rpm trong 1 phút.
Chuyển cột qua tube efpendoft, cho thêm 50 μl elution buffer vào cột ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 11.000 rpm trong 2 phút thu plasmid.
2.4.2.10. Kiểm tra sự hiện diện sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector
Để kiểm tra sự hiện diện của sản phẩm cDNA được tạo dòng trong vector thực hiện phản ứng cắt bằng bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI. Thành phần phản ứng cắt trong 20 μL dung dịch bao gồm: 1 μg lasmid tái tổ hợp, 2 μL 10 EcoRI buffer, và 1,5U enzyme EcoRI. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 2 giờ. Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 80V trong đệm TAE 1. Nhuộm gel agarose 15 phút trong dung dịch EtBr (0,5 g/mL) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Documentation (Bio-Rad).
2.4.3. Giải trình tự sản phẩm cDNA được tạo dòng
Các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm cDNA được gửi đến công ty Nam Khoa giải trình tự nucleotide. Primer sử dụng trong quá trình giải trình tự là M13 Foward Primer và M13 Reverse Primer.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Aspergillus niger CÓ KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP PECTINASE CAO
3.1.1. Phân lập Aspergillus niger
Mẫu vỏ cam, chanh, bưởi sau khi được xử lý tiến hành phân lập chủng nấm trên môi trường PDA. Sau 3 ngày nuôi trong tủ ấm ở 30oC trên mỗi đĩa petri xuất hiện khoảng 2-30 khuẩn lạc (hình 3.1). Tiến hành quan sát hình thái màu sắc khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm, màu sắc bào tử. Kết quả quan sát cho thấy nhiều khuẩn lạc có đặc điểm của A. niger theo mô tả Robert A. Samson (1984). Đồng thời, trên đĩa cũng không thấy xuất hiện khuẩn lạc nhóm loài khác ngoài nấm mốc. Có thể nhận định sơ bộ là loài thuộc chi Aspergillus. Mật độ khuẩn lạc đáp ứng yêu cầu chọn khuẩn lạc đơn cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này tương tự kết quả của Lê Thanh Hương và Nguyễn Thùy Châu [2], [4].
Chọn khuẩn lạc đơn tiến hành nuôi trên môi trường PDA ở 30oC trong ống nghiệm 48 giờ. Quan sát và phân loại A. niger theo mô tả trong khóa phân loại của Robert A. Samson (1984) [3]. Hình ảnh hiển vi của thể sinh bào tử, sợi nấm và bào tử được trình bày ở hình 3.2; hình 3.3; hình 3.4.
Kết quả quan sát hình thái hiển vi phù hợp kết quả của tác giả Nguyễn Thùy Châu (2007) [2]. Kết quả tuyển chọn được 20 chủng được cho là A. niger để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.2. Thể sinh bào tử (bên trái) và sợi nấm (bên phải) của A. niger
Hình 3.4. Bào tử của A. niger
3.1.2. Tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao
bằng phương pháp đo vòng phân giải
Lên men các chủng A. niger tuyển chọn được trong môi trường cảm ứng sinh pectinase (Czapeck Dox) ở 30oC, 150 rpm trong 3 ngày. Sau 3 ngày nuôi có thể thấy hệ sợi phát triển tốt. Qua đó có thể nhận định tất cả các chủng