2. Mục tiêu của đề tài
1.4. TẠO DÒNG GEN PECTINASE TỪ Aspergillus niger
Pectinase từ Aspergillus niger được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nên gen mã hóa pectinase rất được quan tâm nghiên cứu. Gen pectinase của Aspergillus niger là một họ gen, gồm nhiều gen mã hóa các loại pectinase thực hiện các chức năng khác nhau. Nhiều nghiên cứu khác nhau trên khắp thế giới, đặc biệt là thành tựu trong việc giải toàn bộ genome năm 2007 đã xác định được rất nhiều gen khác nhau trong genome của Aspergillus niger. Tuy nhiên, rất nhiều trình tự trong genome chỉ mới tạm thời dự đoán chức năng và cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để làm rõ chức năng cũng như điều kiện biểu hiện của chúng.
Gysler và cs (1990) đã tạo dòng gen pectin lyase D (pelD GenBank: M55657) từ chủng Aspergillus niger N756 bằng cách sàng lọc thư viện
genome của chúng với probe là gen pectin lyase I được xác định trong nghiên cứu của Houdenhoven và cs (1975). Kết quả xác định được gen pectin lyase D dài 2716 bp có 4 đoạn intron ngắn 57-65 bp, mã hóa cho 373 aa có 19 aa peptide tín hiệu [21].
Harmsen và cs (1990), Margo và cs (1991) đã nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectin lyase (pelA GenBank: X60724) của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sàng lọc thư viện genome chúng với probe dựa trên gen pectin lyase D (pelD) trong nghiên của Gysler và cs (1990). Kết quả xác định được trình tự mã hóa gen pelA gồm 1355 bp trong đó khung đọc mở (ORF) dài 1137 bp mã hóa cho 379 aa có 20 aa peptide tín hiệu. Trình tự aa của pelA
được xác định là giống 69% với gen pelD trong nghiên cứu của Gysler [22], [28].
Ruttkowski và cs (1990) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase từ chủng Aspergillus niger RH5344. Kết quả xác định được một cDNA dài 1319 bp có chứa một khung đọc mở duy nhất 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn peptide tín hiệu đầu tận cùng NH2- gồm 27 aa. Việc giải trình tự các aa từ enzyme này được tiến hành và xác định trình tự aa suy diễn từ trình tự mã hóa của gen polygalacturonase là chính xác [38].
Hendrik và cs (1992) đã tạo dòng xác định trình tự gen polygalacturonase II bằng cách sử dụng probe đặc hiệu sàng lọc thư viện genome của chủng Aspergillus nige N400. Kết quả xác định được trình tự gen polygalacturonase II gồm 1141 bp trong đó có một đoạn intron 55 bp, khung đọc mở (ORF) gồm 1089 bp mã hóa cho 362 aa trong đó đoạn petide tín hiệu gồm 27 aa [23].
Khanh và cs (1991) tạo dòng gen pectin methyl esterase (PME) từ chủng Aspergillus niger RH5344. Kết quả xác định được trình tự 1747 bp có 7 đoạn exon và 6 đoạn intron, mã hóa cho 314 aa [27].
Bussink và cs (1991) đã mô tả và so sánh hai gen polygalacturonase I (pgaI GenBank: X58892) và polygalacturonase II (pgaII GenBank: X58893) được tạo dòng từ chủng Aspergillus niger N400. Trong đó, gen pgaI có hộp TATA nằm vị trí -152 và hộp CAAT giả định nằm ở vị trí -218 so với codon mở đầu, có hai đoạn intron ngắn 52 bp và 62 bp, mã hóa cho 368 aa. Gen
pgaII có một đoạn intron ngắn 52 bp, mã hóa cho 362 aa [19].
Ruttkowski và cs (1991) đã tạo dòng gen mã hóa polygalacturonase (PG) từ chủng Aspergillus niger RH5344. Cấu trúc gen bao gồm 1141 bp mã hóa cho 362 aa, khung đọc mở bị gián đoạn bởi một đoạn intron 52 bp. Trình tự aa của PG này được so sánh với PG từ cà chua (Lycopesium esculentum) và Erwinia carotovora. Kết quả so sánh ba loại enzyme cho thấy có một vùng bảo tồn cao ở đầu tận cùng, có thể đó là vùng hình thành trung tâm xúc tác [37].
Bussink và cs (1992) đã tạo dòng gen polygalacturonases C. Kết quả xác định được gen polygalacturonases C (pgaC GenBank: X64356) dài 2034 bp, gồm 4 đoạn exon và 3 đoạn intron mã hóa cho 383 aa [20].
Suykerbuyk và cs (1997) đã tạo dòng 2 gen rhamnogalacturonan hydrolase từ thư viện genome của chủng Aspergillus niger N400 bằng cách sử dụng gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus làm probe. Kết quả xác định được 2 gen là rhamnogalacturonan hydrolase A (rhgA
GenBank: X94220) và B (rhgB GenBank: X94221). Hai gen này giống với gen rhamnogalacturonan hydrolase của Aspergillus aculeatus lần lượt là 78% và 72%. Hai gen rhgA, rhgB đều có 3 đoạn intron và 3 đoạn exon, trong đó gen rhgA mã hóa cho 446 aa và rhgB mã hóa cho 558 aa [43].
Parenicova và cs (2000) tạo dòng gen mã hóa 2 endo-polygalacturonase là endo-polygalacturonase A (pgaA GenBank: Y18804) và endo- polygalacturonase B (pgaB GenBank: Y18805). Kết quả xác định được gen
pgaA dài 1167 bp trong đó có một đoạn intron và mã hóa cho 370 aa, gen
pgaB dài 1234 bp có 2 đoạn intron và mã hóa cho 362 aa [32 ].
Mukadam và cs (2009) tạo dòng cDNA gen polygalacturonase I (pgaI
GenBank: GQ251519) từ chủng Aspergillus niger M1. Kết quả xác định được trình tự 1101 bp gồm một khung đọc mở duy nhất mã hóa cho 367 aa [30].
Đặc biệt, với công trình giải trình tự toàn bộ genome của chủng
Aspergillus niger CBS 513.88 của Pel và cs (2007) rất nhiều gen pectinase đã được xác định và công bố trên GenBank như polygalacturonase I (pgaI
XM_001389525), polygalacturonase II (pgaII XM_001397030), endo- polygalacturonase A (pgaA XM_001397963), endo-polygalacturonases B (pgaB XM_001399591), polygalacturonase C (pgaC XM_001390775), endo- polygalacturonase D (pgaD XM_001393605), polygalacturonase E (pgaE
XM_001389818), pectin lyase A (pelA XM_001401024), pectin lyase B (pelB
XM_001389889), rhamnogalacturonase A (rhgA XM_001395147), rhamnogalacturonase B (rhgB XM_001401007), pectinesterase A (pmeA
XM_001390469) [34].
Ở Việt Nam, hiện chưa có công bố nào về tạo dòng gen pectinase từ
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU