Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mã hóa endo-1,4-beta-glucanase thuộc hệ enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis.. Kết quả tạo dòng và kiểm tra plasmid t
Trang 1NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CELLULASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
RESEARCH AND CLONING A GENE ENCODING CELLULASE FROM BACILLUS
SUBTILIS
SVTH: Đặng Thị Châu Thu
Lớp 07SH, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng
GVHD: Th.S Ngô Thái Bích Vân
Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng
TÓM TẮT
Enzyme cellulase được ứng dụng nhiều trong môi nông trường, nông nghiệp, công nghiệp, y học,….Tuy nhiên tại Việt Nam việc sản xuất chế phẩm enzyme này vẫn chưa thực sự hoàn thiện Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tạo dòng đoạn gen mã hóa endo-1,4-beta-glucanase thuộc hệ enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Đoạn gen sau khi tạo dòng thành công được bước đầu biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3) cảm ứng bằng IPTG 1mM
Hoạt tính của enzyme được kiểm tra bằng phương pháp thủy phân trên môi trường thạch chứa CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% và phương pháp đường khử Bermeld Đồng thời chúng tôi kiểm tra kích thước của enzyme mục tiêu bằng điện di SDS-PAGE Kết quả này sẽ làm nền tảng cho việc sản xuất chế phẩm enzyme cellulase phục vụ trong nhiều ngành công nghiệp sau này
ABSTRACT
Cellulase enzyme plays a critical role in many fields such as agriculture, industry, medicine, etc However, production of this enzyme still haven't been completed In this study, we carried out cloning the gene endo-1,4-beta-glucanase which is coding for the biosynthesis of
cellulose on the Bacillus subtilis DNA The cloning gene is represented on the expression system
of E.coli BL21(DE3) and induced with 1mM IPTG The producing enzyme is test for activity on the
medium with CMC (carbo-metyl-cellulose) 1% and the reducing sugar Bermeld As the same time,
we check the size of the target enzyme by SDS-PAGE This result will base for the manufacturing cellulase which is using for many industry application
1 Đặt vấn đề
Enzyme cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: nông nghiệp, công nghiệp,
y học, môi trường, … Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm: enzyme này được dùng để chế biến thức ăn cho vật nuôi, cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm Trong y học: cellulase được dùng để trích ly các chất từ cây thuốc, tạo nên những bước phát triển vượt bậc cho ngành công nghiệp dược phẩm Ngoài ra, cellulase còn được ứng dụng trong quy trình tạo cồn sinh học hướng đến việc tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế dần cho nguồn dầu mỏ đang ngày càng cạn kiêt [4]
Các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis, vi nấm như Tricodeman,…có khả năng
sinh enzyme cellulase mạnh Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thu nhận và tạo dòng
gen mã hóa cho endo-1,4-betaglucanase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Đề tài nếu được khai
thác triệt để sẽ là bước tiến quan trọng, là cơ sở để hướng đến việc thu nhận và sản xuất chế phẩm enzyme cellulase thương mại với giá thành hợp lý
2 Kết quả nghiên cứu và khảo sát
Trang 22.1 Kết quả thu nhận DNA bộ gen từ Bacillus subtilis
Để thu nhận gen mã hóa cho enzyme endo-1,4-betaglucanase, chúng tôi sử dụng bộ
gen của vi khuẩn Bacillus subtilis làm mạch khuôn Theo các nghiên cứu trước được tiến
hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng chủng vi khuẩn này đã được chứng minh có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh Do vậy, đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bộ gen bằng phương pháp SDS-kiềm Kết quả thu được điện di trên gel agarose 1% như sau:
Hình 1 Kết quả tách DNA bộ gen Bacillus subtilis
Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad)
Giếng 1: DNA bộ gen Bacillus subtilis
2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen endo-1,4-betaglucanase
Trên cơ sở DNA thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng OE PCR (overlap extension PCR) để thu nhận đoạn gen mong muốn Phản ứng PCR đầu được tiến hành hai phản ứng với hai cặp mồi F1 và R1, F2 và R2 với chu trình nhiệt: 950
C trong 5 phút, 940C trong 1 phút, 520C trong 45 giây, 720C trong 1 phút 30 giây, 720C trong 10 phút (lặp lại 35 chu kì) để thu được hai đoạn gen có kích thước khoảng 900 bp, 700 bp Phản ứng PCR thứ hai sử dụng sản phẩm của hai phản ứng PCR đầu làm nguyên liệu (template) chạy với chu trình nhiệt như trên 25 chu kì sau đó bổ sung mồi F1&R2 chạy tiếp tục 30 chu kì với mục đích thu được đoạn gen có kích thước 1600 bp [2] Mồi F1, R2 được thiết kế có vị trí cắt
của enzyme BamHI và XhoI tương ứng Các kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1% như sau:
A B
Hình 2 Kết quả PCR đoạn gen endo-1,4-glucanase
Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad)
Giếng 1A: Đoạn gen thứ nhất 900 bp
Giếng 2A: Đoạn gen thứ hai 700 bp
Giếng 1B: Đoạn gen endo-1,4-betaglucanase 1600bp
Từ kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã thu được đoạn gen endo-1,4-betaglucanase hoàn chỉnh với kích thước khoảng 1600 bp Đoạn gen thu được sẽ tiếp tục thực hiện quy trình dòng hóa
vào Escherichia coli DH5α.
Từ kết quả điện di cho ta thấy chúng tôi đã thu nhận được DNA bộ
gen Bacillus subtilis nguyên vẹn DNA có thể tiếp tục sử dụng để
thực hiện nhân bản thu gen mục tiêu
1000 bp
Trang 32.3 Kết quả tạo dòng và kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase
2.3.1 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase vào Escherichia coli DH5α
Trong đề tài này chúng tôi chọn plasmid pET28a(+) làm vector mang gen mục tiêu
với hai vị trí cắt của enzyme BamHI và XhoI tại vị trí tạo dòng đa bội, đoạn gen đã được
thiết kế có mang vị trí cắt của hai enzyme này Do vậy, đầu tiên chúng tôi xử lý plasmid
pET28a(+) và đoạn gen endo-1,4-betaglucanase bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và
vector tái tổ hợp nhờ enzyme nối T4 ligase ở điều kiện nhiệt độ 40C qua đêm Sản phẩm
nối được hóa biến nạp vào tế bào E.coli DH5α sau đó được sàng lọc trên môi trường LB
có bổ sung kanamycin (30 µg/ml) ở 370
C, qua đêm
A B C
Hình 3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào Escherichia Coli DH5α (hình A)
Kết quả biến nạp plasmid pET28a(+) vào Escherichia Coli DH5α – chứng dương (hình B)
Kết quả cấy trải Escherichia coli DH5α khả nạp – chứng âm (hình C)
Kết quả hình 3 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp vào chủng DH5α Sau bước này, chúng tôi sẽ tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc tại đĩa thạch hình A để thu được chắc chắn dòng có chứa vector tái tổ hợp
2.3.1 Kết quả sàng lọc chủng Escherichia coli DH5α có mang vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4betaglucanase
Để chọn ra được khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase Chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng phương pháp tách chiết DNA tổng số
[3]
Hình 4 Kết quả sàng lọc chủng DH5α mang vector tái tổ hợp
Giếng M: Marker 100 bp (Biorad)
Giếng 1,3,4,5: Các dòng DH5α mang plasmid pET28a(+)
Giếng 2: Dòng DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase
2.3.2 Kết quả quy trình tách thu plasmid tái tổ hợp và kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ
Qua kết quả điện di ở trên, tại giếng 2 là dòng có mang plasmid tái tổ hợp vì kích thước plasmid tái tổ hợp khoảng 7 kb do vậy sẽ nằm ở trên so với vạch plasmid bình thường có kích thước 5,4 kb Từ đó chúng tôi sẽ thu nhận được dòng cần tìm tại giếng số 2 Dòng này sau đó sẽ được nuôi tăng sinh trên môi trường LB/Kanamycin để tiến hành tách thu nhận plasmid tái tổ hợp
Trang 4hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase:
Sau khi đã xác định chính xác dòng DH5α có mang vector tái tổ hợp Chúng tôi
tiến hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc và thực hiện quy trình tách thu nhận plasmid tái tổ hợp
Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp thu được bằng enzyme
plasmid và sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
Hình 5 Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp và cắt plasmid tái tổ hợp
Giếng M: Thang DNA 100bp (Biorad)
Giếng 1: Kết quả sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp
Giếng 2: Kết quả sản phẩm cắt mở vòng plamisd pET28a(+)
2.4 Kết quả thử hoạt tính enzyme endo-1,4-betaglucanase thu được
2.4.1 Kết quả định tính khả năng sinh enzyme endo-1,4-betaglucanase
Để gen mục tiêu được biểu hiện, chúng tôi tiến hành hóa biến nạp vector tái tổ hợp
trên vào chủng biểu hiện E.coli BL21(DE3) Chủng này được cảm ứng bằng IPTG 1,5mM
ở 370
C trong 4h Khả năng thủy phân enzyme được kiểm tra bằng phương pháp cấy chấm
điểm trên môi trường thạch CMC 1%
Hình 6 Kết quả định tính khả năng sinh enzyme celulase của EcoliBL21
2.4.2 Kết quả xác định hoạt độ enzyme sinh ra bằng phương pháp đường khử
Ngoài định tính khả năng sinh enzyme của chủng tái tổ hợp Chúng tôi sử dụng
phương pháp đường khử của Bermeld để định lượng hoạt tính enzyme Trước tiên chúng
tôi xây dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị OD540nm Dựa vào
phản ứng của thuốc thử DNS với các dung dịch chuẩn glucose, cường độ màu biến đổi
được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng OD540nm Từ giá trị
giữa nồng độ glucose và giá trị OD540nm
Như vậy plasmid sau khi xử lý bằng enzyme cho hai vạch tương ứng với vạch phía trên là plasmid pET28a(+) có kích thước 5,4 kb, vạch ở dưới là đoạn chèn có kích thước khoảng 1600 bp So với plasmid pET28a(+) đã được cắt mở vòng ở giếng 3 thì vạch plasmid sau khi cắt ở giếng 2 có kích thước tương đương Điều đó chứng tỏ gen mục tiêu đã được gắn chèn vào plasmid pET28a(+)
Từ kết quả thu được chúng tôi kết luận vector tái tổ hợp pET28a(+)endo-1,4-betaglucanase khi biến
nạp vào chủng E.coliBL21(DE3) có hoạt tính cellulase
Chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng chủng này để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase
Trang 5Hình 7 Đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị mật độ quang 540nm
Từ kết quả OD của mẫu thử có enzyme cellulase (OD540nm = 0,306), mẫu thử không
có enzyme (OD540nm = 0,015) và đường chuẩn, chúng tôi nhận thấy hoạt độ của enzyme
cellulase của mẫu thu được là: x = 242,5 µg/ml Điều đó chứng tỏ dịch enzyme thu được
có hàm lượng enzyme cellulase cao nên khả năng thủy phân đường tốt
2.4.3 Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu enzyme thu được
Hệ enzyme cellulase có trọng lượng khoảng 50-55 kDa, để đánh giá kết quả tạo
dòng chúng tôi tiến hành điện di dịch enzyme sau khi tủa bằng phương pháp điện di
SDS-PAGE với gel polyacrylamide 10% Kết quả cho hình ảnh sau:
Hình 8 Kết quả điện di SDS-PAGE dịch enzyme cellulose sau khi tủa bằng acetone
Giếng M: Thang chuẩn protein(Fermentas)
Giếng 1,3 : Dịch enzyme thu được từ E.coliBL21(DE3)
Giếng 2,4: Dịch enzyme cellulose thu được từ dòng E.coliBL21(DE3) biểu hiện
Từ kết quả thu được cho thấy sau khi biểu hiện chúng tôi thu được phần lớn là hệ
enzyme có kích thước nằm trong khoảng 50 – 55 kDa phù hợp với kích thước của hệ
enzyme cellulase Vậy chúng tôi đã tạo dòng và bước đầu biểu hiện thành công đoạn gen
mã hóa enzyme cellulase trong chủng E.coliBL21(DE3)
3 Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tạo dòng thành công đoạn gen mã hóa
enyme cellulase từ Bacillus subtillis trong E.coliBL21(DE3) Bằng các kỹ thuật sinh học
phân tử chúng tôi đã xác định đoạn gen tạo dòng là đoạn gen mong muốn Đồng thời,
chúng tôi tiến hành thử hoạt tính của đoạn gen được tạo dòng bằng các phương pháp cấy
chấm điểm, đường khử để bước đầu xác định hoạt tính của chủng tạo thành và kiểm tra
kích thước enzyme thu được bằng điện di SDS-PAGE
Những thử nghiệm trên là cơ sở để tiếp tục tiến hành khảo sát các yếu tố nhiệt độ,
môi trường, nồng độ chất cảm ứng,… sao cho thu được lượng enzyme cellulase là lớn
nhất Nhằm mục đích phục vụ cho việc tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme cellulase
thương mại phục vụ cho thị trường
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Trần Thị Hòa, Phạm Lê Thanh Mai, Hồng Phước Toàn, Nguyễn Quốc Bình, “Tổng
hợp các cDNA mã hóa hai enzyme endoglucanase 1,2 của Trichoderma Reesei bằng
phương pháp overlap extension PCR (OE-PCR)”, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh
[2] Heckman, K.L and L.R Pease (2007), “Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven
overlap extension”, Nat Protoc, 2(4):924-32
[3] GUO Xu-Dong, MAO Shu-Yan, HOU Dong-Xia, BOU Shorgan, “A rapid method for
Preparation of plasmid DNA for secreening recombinant clones”, Chinese jounarl of
Biotechnology, (2007) 23(1), 176-178
[4] Wang Li, Wei-Wei Zhang, Ming-Ming Zang, Yu-Lin Chen, “Cloning of
Thermostable Cellulase Gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expression
in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, (2008) 40:195-201
[5] Deliang Yang, Haibo Weng, Minge Wang, Weihua Xu, Yaozhao Li, Huiling Yang,
“Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly isolated
Bacillus subtilis strain I15”, Mol Biol Rep, (2010)37:1923-1929 DOI
10.1007/s11033-009-9635-y
