Nghiên cứu thu nhận và biểu hiện gen mã hóa cellulase

Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất tinh bột tan tương ứng với chỉ số DE .... So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh b

Trang 2

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước

Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài Thật may mắn cho em khi được Thầy hướng dẫn nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn Thầy

Em xin cám ơn chân thành chị Đặng Thị Phương Thảo Chị đã truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý giá Chị luôn quan tâm, động viên em mỗi khi gặp khó khăn

Em xin cảm ơn anh Nguyễn Trí Nhân Người đã tận tình hướng dẫn em từ lúc mới vào Lab Thời gian được nghiên cứu cùng anh không quá dài, nhưng những kiến thức và sự nhiệt tình giúp đỡ của anh đã giúp em rất nhiều

Em xin cảm ơn chị Dương Xuân Huê, anh Trần Thanh Phong, anh Võ Minh Trí và các bạn ở Phòng thí nghiệm Tin Sinh học – trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Các anh chị và các bạn đã giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình làm luận văn

Anh cảm ơn Hằng, Hiếu, Dung, Đạt, Hòa, Trinh, Đức và tất cả các bạn ở Lab A Lab A thật sự là một ngôi nhà hạnh phúc với các thành viên thật dễ thương Cám ơn các bạn thật nhiều

Và cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ Ba mẹ luôn bên con, luôn động viên con để con hoàn thành luận văn này

Trang 3

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

1.1 MỞ ĐẦU 2

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 4

1.2.1 Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase bằng phương pháp metagenomics từ đất 4

1.2.2 Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn quốc gia Nam Cát Tiên 5

1.2.3 Nghiên cứu thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn C Thermocellum 5

CHƯƠNG 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1 CELLULASE 8

2.1.1 Cellulose 8

2.1.2 Phân loại cellulase 8

2.1.3 Các nhóm vi sinh vật có cellulase trong tự nhiên 12

2.2 METAGENOMICS 13

2.2.1 Metagenome và metagenomics 13

2.2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu metagenomics 13

2.3 XẠ KHUẨN TỔNG HỢP CELLULASE 18

2.3.1 Đại cương về xạ khuẩn 18

Trang 4

2.4.2 Phức hợp cellulosome 22

2.4.3 Các nghiên cứu về gen và enzym cellulase từ C thermocellum 25

2.4.4 Các cellulase từ C thermocellum được nghiên cứu trong luận văn 26

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

3.1 VẬT LIỆU 29

3.1.1 Dụng cụ và thiết bị 29

3.1.2 Hóa chất 29

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36

3.1.4 Vật liệu sinh học 39

3.2 PHƯƠNG PHÁP 42

3.2.1 Thu nhận metagenome DNA từ đất 42

3.2.2 Nhân bản đoạn gen mã hóa cellulase từ metagenome DNA bằng phản ứng PCR 43

3.2.3 Xây dựng thư viện metagenome DNA 50

3.2.4 Sàng lọc dòng có hoạt tính cellulase từ thư viện metagenome DNA 52

3.2.5 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy cơ chất CMC 53

3.2.6 Ly trích genome DNA các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 54

3.2.7 Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC bằng phản ứng PCR 54

3.2.8 Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR 57

Trang 5

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 66 4.1 THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP

pMBD14 trong tế bào chủ E coli 75

4.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ CÁC

CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CELLULASE PHÂN LẬP TỪ

VƯỜN QUỐC GIA NAM CÁT TIÊN 79

4.2.1 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 79 4.2.2 Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân

CMC bằng phản ứng PCR 80

4.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI

KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM 87

4.3.1 Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium

thermocellum bằng phản ứng PCR 87 4.3.2 Tạo dòng các gen celA, celS trong pBluescript II SK(+) và E coli

DH5α 88

Trang 6

E.coli 98

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 101 Tài liệu tham khảo 105

Trang 7

Bảng 1.1 Bảng so sánh giá trị bổ dưỡng giữa gạo lức và bắp hạt 14

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lượng của maltose tinh thể 21

Bảng 2.1: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn glucose 29

Bảng 2.2: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn maltose 32

Bảng 2.3: Mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị OD (phương pháp Heinkel) 33

Bảng 2.4: Tiến hành phản ứng thủy phân tinh bột bởi enzyme 33

Bảng 2.5 Các bước tiến hành xác định hoạt độ enzyme GA của dung dịch mẫu 34

Bảng 3.1 Hoạt độ chung của enzyme Termamyl-LS 42

Bảng 3.2 Hoạt độ chung của enzyme Sebamyl-L 42

Bảng 3.3 Hoạt độ chung của enzyme AMG-E 43

Bảng 3.4 Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột bắp 43

Bảng 3.5 Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột gạo 44

Bảng 3.6 Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột năng 44

Bảng 3.7 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột gạo, tương ứng với chỉ số DE 45

Bảng 3.8 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột bắp, tương ứng với chỉ số DE 46

Bảng 3.9 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột năng, tương ứng với chỉ số DE 47

Bảng 3.10 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất tinh bột tan tương ứng với chỉ số DE 48

Bảng 3.11 So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50

Bảng 3.12 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột gạo và giá trị DE 51

Trang 8

phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột năng và giá trị DE 53 Bảng 3.15 Lượng dextrin thu được 54 Bảng 3.16 So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa

bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56 Bảng 3.17 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột gạo và giá trị DE 57 Bảng 3.18 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột bắp và giá trị DE 58 Bảng 3.19 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột năng và giá trị DE 59 Bảng 3.20 Lượng maltose thu được 60 Bảng 3.21 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa

bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 61 Bảng 3.22 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62 Bảng 3.23 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột bắp và giá trị DE 63 Bảng 3.24 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột năng và giá trị DE 64 Bảng 3.25 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình

dịch hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65 Bảng 3.26 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy

phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên

bột gạo và giá trị DE 66 Bảng 3.27 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl

Trang 9

trên bột năng và giá trị DE 68 Bảng 3.29 So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch

hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các

nguồn cơ chất khác nhau 69 Bảng 3.30 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl

trên bột gạo và giá trị DE 70 Bảng 3.31 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

trên bột bắp và giá trị DE 71 Bảng 3.32 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

trên bột năng và giá trị DE 72 Bảng 3.33 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình

dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên

các nguồn cơ chất khác nhau 73

Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất dextrin 18

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng

enzyme amylase 40

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng

phương pháp kết hợp axit và enzyme amylase 41

Trang 10

Hình 1.1 Các enzyme thủy phân tinh bột 4

Hình 1.2 Cấu trúc của amylose và amylopectin 11

Hình 1.3 Cấu tạo Maltose 19 Hình 1.4 Công thức cấu tạo glucose (dạng mạch hở và 2 dạng mạch

vòng α-glucose, β-glucose) 21 Hình 1.5 Máy HPLC 24 Hình 1.6 Mô hình hệ thống HPLC điển hình 24 Hình 3.1 Dung dịch thu được: trước (trái) và sau (phải) khi ly tâm

và xử lý bằng than hoạt tính (Tương ứng ống 1: bột bắp,

ống 2: bột gạo, ống 3: bột năng) 74

Biểu đồ 3.1 So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột

bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50 Biểu đồ 3.2 So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa

bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56 Biểu đồ 3.3 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình

đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 61 Biểu đồ 3.4 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình

đường hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65 Biểu đồ 3.5 So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa

bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn

cơ chất khác nhau 70 Biểu đồ 3.6 So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình

dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên

Trang 11

ĐỒ THỊ Trang

Đồ thị 3.1 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 46

thủy phân bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE 47

thủy phân bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE 48

thủy phân bằng acid HCl trên tinh bột tan và giá trị DE 49

Đồ thị 3.5 Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời

gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột gạo và giá trị DE 52

thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột bắp và giá trị DE 53

thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột năng và giá trị DE 54

thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột gạo và giá trị DE 57

thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột bắp và giá trị DE 58

thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột năng và giá trị DE 59

thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62

thủy phân bằng enzyme AMG-E bột bắp và giá trị DE 63

Trang 12

trên bột gạo và giá trị DE 67

trên bột bắp và giá trị DE 68

trên bột năng và giá trị DE 69

trên bột gạo và giá trị DE 71

trên bột bắp và giá trị DE 72

trên bột năng và giá trị DE 73

Trang 13

DE: Dextrose Equivalent

OD: Optical Density (Mật độ quang)

ΔOD: Hiệu số giữa mật độ quang của thử thật và thử không

w/v: Khối lượng/thể tích

w/w: Khối lượng/khối lượng

dd: Dung dịch

Trang 14

Ph ần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 T ổng quan về sự thủy phân tinh bột [1, 2, 6]

Tinh bột có nhiều ứng dụng thiết thực và rộng rãi trong sản xuất của các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên các đặc tính của tinh

bột không phải lúc nào cũng phù h ợp trong các quy trình chế biến; rất nhiều sản

phẩm thu được từ quá trình chuyển hóa tinh bột đem lại hiệu quả kinh tế cao, như dextrin, maltose, dung dịch xi rô nồng độ glucose cao (high glucose syrup), dung

dịch xi rô nồng độ frutose cao (HFS - high frutose syrup), tinh bột biến tính, … và các sản phẩm sau chuyển hóa này được sử dụng rất hữu ích trong y dược, có tác dụng tốt trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng như sản phẩm chuyển hóa từ tinh bột

có tác dụng prebiotic: IMO (IsoMaltose Oligosaccharide)

Vì những lí do trên, việc biến đổi các đặc tính tinh bột để cải thiện chức năng

của tinh bột và thu các sản phẩm có giá trị là một việc hết sức cần thiết Công nghệ biến đổi tinh bột thông thường được thực hiện bằng phương pháp hóa học và phương pháp sinh học, thông qua phản ứng cắt, oxy hóa hay chuyển gốc hóa học

nhằm thu các sản phẩm có giá trị theo ý muốn

1.1.1 S ự thủy phân tinh bột bằng phương pháp hóa học [2]

Dưới tác động của các tác nhân hóa học, tinh bột bị thay đổi tính chất Dựa trên bản chất những biến đổi xảy ra trong phân tử tinh bột, Kovalxkaia (1994) phân chia tinh bột bị biến tính bằng hóa chất thành hai loại: tinh bột cắt và tinh bột bị thay thế

Nhóm tinh b ột cắt thường có độ nhớt thấp, mạch tinh bột bị cắt bằng tác nhân

acid, hay chất oxy hóa, hay một vài loại muối,… Kết quả là trong phân tử tinh bột

xảy ra hiện tượng đứt gãy các liên kết glucoside và các liên kết khác, giảm trọng lượng, xuất hiện một số liên kết mới trong và giữa các phân tử Cấu trúc hạt của tinh bột có thể bị phá vỡ ít nhiều, tuy nhiên về căn bản chúng vẫn được giữ nguyên Một

sản phẩm quan trọng của nhóm tinh bột cắt là tinh bột tan dùng trong phòng thí

Trang 15

nghiệm Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột loại này dùng để tạo cấu trúc gel trong khi sản xuất bánh kẹo [2]

Dưới tác động của tác nhân oxy hóa như KMnO4 trong môi trường acid, tinh bột bị oxy hóa được sử dụng thay thế agar, pectin trong sản xuất bánh kẹo, kem, các

sản phẩm sữa và đồ hộp Các sản phẩm bị oxy hóa yếu được dùng trong sản xuất bánh mì để cải thiện tính chất cơ học, tăng khả năng giữ khí của bột nhào, giảm thời gian lên men, và tăng chất lượng bánh

Trong trường hợp khác, tinh bột được xử lý ẩm, hạt tinh bột trương nở trong nước khi có mặt các chất hóa học như muối của H3PO4, methylcellulose… làm phá

hủy một phần hay hoàn toàn cấu trúc của hạt Tinh bột loại này được sử dụng như chất giữ ẩm trong sản xuất kẹo, kem, bánh pudding, các loại mì sợi, bánh mì và nhiều loại thức ăn kiêng Trong trường hợp được xử lý ở độ ẩm cao, tinh bột sẽ bị

mất gần như hoàn toàn tính chất và cấu trúc ban đầu, tạo ra dạng tinh bột – protein mới dùng trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất các sản phẩm từ thịt, cá…

Tinh bột thay thế là nhóm tinh bột mà tính chất của chúng thay đổi do các

nhóm hydroxyl ở cacbon 2, 3 và 6 liên kết với các gốc hóa học hay do co-polymer hóa với một hợp chất cao phân tử khác, hoặc hai mạch polysaccharide có thể bị gắn vào nhau do các liên kết dạng cầu nối [1, 2]

Mức độ biến tính tinh bột được đặc trưng bởi độ thế (Degree of Substitution – DS) DS là số nhóm hyđroxyl bị thế trên một AGU (Anhydrous Glucose Unit) Như

vậy, độ thế có giá trị trong khoảng 0-3 Ví dụ các gốc rượu ở carbon thứ 2, 3, 6 của tinh bột dạng này tham gia vào phản ứng với các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ, như acid H3PO4 và muối phosphate, để tạo tinh bột phosphate Trong trường hợp này, tính chất tinh bột bị thay đổi rõ rệt kể cả khi lượng chất hóa học sử dụng rất ít Thông thường loại tinh bột này (còn gọi là đi-tinh bột) có độ nhớt và độ bền kết dính cao, kể cả trong điều kiện đông lạnh Chúng được sử dụng để sản xuất các sản

phẩm cần bảo quản lạnh như kem, majoner, các loại nước xốt và sản phẩm dành cho trẻ em

Trang 16

Ngoài ra khi xử lý tinh bột với acid acetic, ta nhận được tinh bột acetate Hàm lượng nhóm acetate có thể chiếm từ 3-6% tùy thuộc điều kiện xử lý Tinh bột acetate được dùng trong sản xuất đồ hộp, các loại thực phẩm khô, công nghiệp dệt,

và công nghiệp giấy

Việt Nam cũng như một số nước Đông Nam Á khác như Thái Lan chủ yếu sản

xuất tinh bột oxy hóa và tinh bột biến tính bằng acid dùng trong công nghiệp dệt và giấy; còn tinh bột acetate và phosphate được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

thực phẩm

 Thủy phân tinh bột bằng acid [19]

Quá trình thủy phân tinh bột tạo các sản phẩm dextrin, maltose, glucose,…thường sử dụng acid HCl và tạo ra sản phẩm có giá trị DE không cao Thông thường sản phẩm có DE thấp thường dễ bị thoái hóa, khó bảo quản do thủy phân không hoàn hảo; còn sản phẩm có DE cao hơn lại có độ ổn định màu và vị kém

 Ưu, nhược điểm của quá trình thủy phân bằng phương pháp hóa học:

Bên cạnh những lợi ích trong việc thủy phân bằng phương pháp hóa học như

thời gian nhanh, điều kiện thiết bị đơn giản Nhìn chung quá trình thủy phân bằng acid có nhiều hạn chế hơn so với thủy phân bằng enzyme, như hiệu suất thủy phân

để thu sản phẩm theo ý muốn không cao; dung dịch sau thủy phân bị nâu hóa mạnh;

và acid ảnh hưởng không tốt đến môi trường,…

1.1.2 S ự thủy phân tinh bột bằng phương pháp sinh học – Sử dụng hệ

enzyme Amylase [1, 2, 24, 30]

Amylase là một trong số những enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp; trong đó 2 enzyme được sử dụng nhiều nhất là glucoamylase (GA) chiếm 26% và α-amylase bền nhiệt chiếm 24% Cho đến nay việc nghiên cứu cấu trúc gen

mã hóa, tính chất và cấu trúc của enzyme amylase, cũng như các loại amylase khác nhau, sản xuất và tinh sạch amylase cũng đã đư ợc tiến hành nhiều Amylase thuộc nhóm hydrolase; đây là enzyme có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm

Trang 17

Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ thực

vật, động vật và vi sinh vật Ngày nay enzyme amylase dần dần thay thế acid xúc tác trong các quá trình thủy phân tinh bột ở qui mô công nghiệp Hiện nay, các nhà

sản xuất thường sử dụng α-amylase bền nhiệt của Bac licheniformis và Bac

stearothermophilus có khả năng chịu nhiệt cao 105oC để tăng hiệu suất thủy phân trong quá trình dịch hóa Ngoài ra, sử dụng amylase còn có nhiều ưu điểm hơn so

với việc sử dụng acid trong quá trình thủy phân tinh bột như năng lượng xúc tác

thấp, chi phí tinh sạch giảm và hạn chế độc hại cho công nhân và môi trường

 Dựa vào vị trí liên kết glucoside bị phân cắt, người ta phân chia amylase ra 2 nhóm:

 Endoamylase (enzyme cắt liên kết glucoside nội mạch)

 Exoamylase (enzyme cắt liên kết glucoside ở đầu mạch)

Endoamylase thủy phân các liên kết glucoside nằm bên trong của chuỗi polysaccharide Endoamylase gồm có α -amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase Các enzyme này

Exoamylase gồm có β -amylase và γ -amylase Đây là những enzyme thủy phân liên kết glucoside tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Hình 1.1 Các enzyme thủy phân tinh bột [24]

Enzymes th ủy phân tinh bột

Trang 18

 Ưu, nhược điểm của phương pháp sử dụng enzyme trong thủy phân tinh bột:

Ngoài những mặt mạnh trong hiệu suất thu được sản phẩm có giá trị kinh tế như mong muốn, không độc hại với con người và môi trường; phương pháp thủy phân bằng enzyme đòi h ỏi thời gian lâu hơn và phải có quy trình, công nghệ phù hợp, đồng nghĩa là nhà sản xuất phải tốn chi phí cao hơn so với việc thủy phân bằng phương pháp hóa học

1.2 Các enzyme Amylase quan trọng, chủ yếu trong thủy phân tinh bột 1.2.1 α – Amylase [17, 24]

α-Amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) hay còn có tên gọi khác là glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A; 1,1-α-D-glucan

glucanohydrolase, là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu nhiên Đây là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của

từng loại enzyme Nếu enzyme α-amylase khi thủy phân tinh bột tạo sản phẩm là các đường tự do được xếp vào nhóm “đường hóa”; còn nếu α-amylase khi thủy phân tinh bột không tạo ra các đường đơn được xếp vào nhóm “dịch hóa”.[24] α-Amylase có thể thu nhận từ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Tuy nhiên α-amylase từ vi khuẩn vẫn được sử dụng nhiều hơn so với α-amylase từ nấm mốc do

một số đặc điểm ưu việt của nó

α-Amylase vi khuẩn – Nhóm Bacillus là nhóm vi sinh vật quan trọng nhất

được sử dụng để sản xuất amylase trong công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy

bề mặt và nuôi cấy bề sâu Đã có nhiều nghiên cứu đề cập đến sản xuất α-amylase

bền nhiệt từ các chủng Bac amyloliquefaciens và Bac licheniformis; enzyme thu

được từ các chủng này có khả năng chịu được nhiệt độ cao 105oC [23] Phương pháp SSF (Solid State Fermentation – lên men trên môi trường rắn hay bán rắn) được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để đạt hiệu suất kinh tế cao trong sản xuất amylase Phần lớn α-amylase thu được từ vi khuẩn có nguồn gốc từ loài Bacillus α-Αmylase từ nấm mốc – Nhóm nấm mốc Aspergillus được coi là những vi

sinh vật sung mãn trong sản xuất các enzyme ngoại bào Trong đó Asp oryzae là

Trang 19

chủng nấm mốc quan trọng để sản xuất amylase Chủng nấm mốc này sinh tổng hợp

3 loại amylase: Taka amylase (TAA), glucoamylase (GA), và α-glucosidase (AGL),

được mã hóa bởi các gen tương ứng là amyB, glaA và agdA Các enzyme này được

tạo ra bằng cảm ứng với tinh bột và các oligosaccharide như maltose, maltotriose,

và isomaltose Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme amylase có thể tăng lên nhờ thay đổi điều kiện nuôi và thành phần dinh dưỡng của môi trường Phương pháp SSF cũng thường được sử dụng để sản xuất amylase từ nấm mốc Ngoài ra người ta cũng sử

dụng phương pháp lên men chìm đ ể nuôi cấy bề sâu các chủng nấm mốc sinh tổng hợp amylase Bên cạnh một số chủng truyền thống, α-amylase còn được sản xuất từ

sanguineus [1]

Phần lớn các enzyme thủy phân tinh bột đều thuộc họ α-amylase Cấu trúc cơ bản của α-amylase gồm 3 tiểu đơn vị A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trưng helix (α/β)8-barrel, được nối với tiểu đơn vị C (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β–sheet song song Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β–sheet được lồng vào giữa đoạn β–sheet thứ

3 và α –helix thứ 3 của tiểu đơn vị A Tiểu đơn vị B quyết định độ bền hoạt tính enzyme và liên kết enzyme-cơ chất; ngoài ra nó cũng ảnh hưởng tới số lượng các isoform và các tính chất đặc biệt của các isoform này [29]

α-Amylase từ nấm men – So với α-amylase từ nấm mốc và vi khuẩn thì các nghiên cứu về α-amylase từ nấm men còn rất ít ỏi α-Amylase bền nhiệt, có khả

năng thủy phân hạt tinh bột sống từ nấm men Crytococcus sp đã được tinh sạch

1.2.2 β - Amylase [17, 22]

β-Amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) các tên gọi khác

saccharogen amylase; glycogenase; 1,4-α-D-glucan maltohydrolase, là một

exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose (dạng β-anomeric) Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6-glucoside ở amylopectin nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50-60% maltose dạng β-anomeric và dextrin

giới hạn (β-limit dextrin) Nhìn chung β-amylase từ vi sinh vật có độ bền nhiệt cao

Trang 20

hơn so với β-amylase có nguồn gốc từ thực vật Một số vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp β-amylase như Bacillus sp., Pseudomonas sp (hiếu khí) và Clostridium

sp (k ỵ khí); Streptomyces sp., nấm mốc Rhizopus sp Tuy nhiên các nghiên cứu về

sản xuất β-amylase không nhiều Maltose là sản phẩm chính của quá trình thủy

1.2.3 γ - Amylase (hay Glucoamylase) [1, 17, 24]

Glucoamylase – GA (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) các tên gọi

glucoamylase; lysosomal α-glucosidase; 1,4-α-D-glucan glucohydrolase, là enzyme

thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo

ra đường glucose GA có thể nhận được từ nhiều nguồn như thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên enzyme vi sinh vật vẫn được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp Nấm mốc Aspergillus là chủng chính để thu nhận GA Kỹ thuật nuôi cấy

gồm các phương pháp nuôi cấy bề sâu, nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn hay bán

rắn, nuôi cấy trong hệ hai pha

Glucoamylase tinh khiết tồn tại ở hai dạng glucoamylase I và glucoamylase II

Penicillium oxalum, chi ếm 20% đối với glucoamylase từ Asp oryzea Các thành

phần protein và hydrate carbon gắn với nhau bằng liên kết glucoside giữa phân tử hydrate carbon và các acid amin như Treonine, Serin GA bị vô hoạt mạnh bởi ion

Hg2+, trong khi Mn2+ và Fe2+ lại có khả năng hoạt hóa Hydrate carbon không những làm bền hoạt tính GA mà còn ảnh hưởng đến hoạt độ GA một cách khá rõ rệt Khi

loại bỏ thành phần hydrate carbon bởi các chất oxy hóa, hoạt độ GA giảm tỷ lệ thuận với lượng hydrate carbon bị oxy hóa GA nói chung hoạt động trong vùng acid, pHopt 4.5-5.0, t0opt 40-600C Tuy nhiên cũng có m ột vài ngoại lệ GA I và GA

II là 2 isoform từ nấm mốc ưu nhiệt Humicola lanuginose có pHopt là 4.9 và 6.6, và

GA II có thể chịu được pH tới 11.0 GA của Corticum rolfsii có 5 isoform, giữ được

hoạt tính ở pH 9.0 và có khả năng thủy phân hạt tinh bột sống

Trang 21

Khi so sánh vận tốc thủy phân cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể, người ta nhận thấy các polysaccharide phân tử lớn thường được thủy phân nhanh hơn so với các polysaccharide phân tử nhỏ

protein-enzyme/phút Trong khi thủy phân cơ chất maltose chỉ tạo 0,6mg glucose/mg protein-enzyme/phút (Iarovenko Resinko, 1975)

Ngoài glucoamylase được phát hiện và tách chiết từ vi sinh vật, glucoamylase còn được tìm thấy ở nhiều mô động vật khác nhau như gan và cơ chuột (Toreces và Clavarria, 1965); ở gan, cơ tim và xương người (Hers, 1963) Trong đó glucoamylase ở người có hoạt tính cao nhất Ở cơ thể động vật glucoamylase làm nhiệm vụ phân giải glycogen để tạo thành glucose, nếu vắng mặt enzyme này sẽ gây

ra những rối loạn nghiêm trọng

Endomycopsis… và vi khuẩn Tuy nhiên hiện nay glucoamylase từ nấm mốc được nghiên cứu tỉ mỉ nhất

1.2.4 Vai trò của amylase trong công nghiệp thực phẩm [2, 10, 20, 21]

Amylase được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghệ chế biến thực phẩm, như công nghiệp sản xuất đường, sản xuất nước giải khát, bánh kẹo, trong lĩnh vực y dược và các ngành công nghiệp khác

Trong công nghiệp thực phẩm, amylase thủy phân tinh bột để thu các sản

phẩm có giá trị kinh tế cao như dextrin, maltodextrin, xi-rô maltose, xi-rô glucose, hay xi-rô giàu fructose (high fructose syrup – HFS)

Người ta sử dụng α-amylase trong phân tích cyclodextrin Ngoài ra, β-amylase

và GA còn đư ợc sử dụng để chuẩn bị màng chitosan dùng trong sắc ký (Pandey,

2000) [17]

Trong các công nghệ thủy giải tinh bột gần đây, để nâng cao giá trị sử dụng

như: khó loại bỏ enzyme trong dung dịch sau phản ứng, giá thành enzyme cao,

Trang 22

không tái sử dụng được,…người ta đã nghiên c ứu và sử dụng enzyme cố định Người ta cho dung dịch tinh bột 35% chảy liên tục qua cột phản ứng có chứa enzyme Amylase cố định, sau 22,6 ngày, ở 45oC, hoạt độ enzyme trong cột vẫn còn 50% Người ta nhận thấy mô hình này hầu như đã khắc phục gần như toàn bộ

những nhược điểm của enzyme hòa tan, và thời gian sản xuất cũng nhanh hơn Ngày nay, GA cố định đã được sử dụng trong các dây chuyền công nghệ hiện đại sản xuất bia có hàm lượng calori thấp Ở dây chuyền truyền thống, một lượng

lớn tinh bột được chuyển thành dextrin mà không được lên men ở giai đoạn sau, do

đó lượng lớn dextrin này sẽ đi vào sản phẩm Nhưng ở dây chuyền lên men hiện đại, quá trình lên men bia đư ợc tiến hành trong bình phản ứng có chứa GA cố định cho phép thủy phân các dextrin này thành glucose, và sau đó được lên men hoàn toàn Tính chất ưu việt hơn nữa là trong sản phẩm bia không chứa enzyme

glucoisomerase không tan để sản xuất các loại xi rô giàu fructose

Các amylase có độ tinh sạch cao và những tính chất phù hợp đã được sử dụng trong lĩnh vực y dược

1.3 Tinh bột – Cơ chất chính thủy phân của enzyme Amylase

Tinh bột đã được biết đến từ hàng nghìn năm Người La Mã gọi là amilum, từ này bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, amilon Tinh bột đầu tiên được tách ra từ bột mỳ,

thời gian sau đó tinh bột được sản xuất từ khoai tây ở Châu Âu, Nhật Bản; từ củ sắn hay lúa gạo ở phương Đông và từ ngô ở Mỹ Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ

của thực vật vì vậy nó được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên Tinh bột có nguồn

gốc từ các loại cây khác nhau thì có những tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau Tinh bột có thể được tách ra từ hạt như ngô, lúa gạo, lúa mỳ; từ rễ và củ như sắn, khoai tây, dong Đây là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp

1.3.1 Thành phần cấu tạo của tinh bột [2, 20, 24]

Tinh bột được cấu tạo từ hỗn hợp các polymer mạch thẳng là các phân tử amylose và các polymer phân nhánh là các phân tử amylopectin (Meyer, 1940) Tỷ

Trang 23

lệ hai nhóm polymer này sẽ quyết định các tính chất lý – hoá; cũng như chất lượng

của tinh bột như độ dẻo, độ nở Trong tinh bột tỷ lệ amylopectin chiếm khoảng 80%, còn amylose chiếm khoảng 20-30%; và tỷ lệ này thay đổi ở các nhóm nguyên

70-liệu có nguồn gốc khác nhau Công thức phân tử gần đúng của tinh bột là (C6H10O5)n trong đó n có giá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột

sẽ bị hồ hóa và tạo ra dung dịch gọi là hồ tinh bột

* Amylose: là polysaccarit mạch thẳng được tạo nên từ các phân tử α glucose nhờ các liên kết α-1,4-glucoside Mỗi liên kết glucoside được tạo ra sẽ loại

-D-một phân tử H2O Amylose được tạo ra từ 5000 - 1000 phân tử α-D-glucose hoặc có khi chỉ khoảng 250 - 300 phân tử Chuỗi phân tử glucose xoắn lại với nhau theo hình xoắn lò xo Sự hình thành dạng xoắn lò xo là do sự hình thành các liên kết hydro giữa các glucose tạo ra Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị glucose và được duy trì bởi liên kết hydro với các vòng xoắn kề bên Khoảng không gian giữa các vòng

xoắn có kích thước phù hợp cho một số phân tử khác có thể liên kết vào, ví dụ như iodine Khi phân tử iodine liên kết vào vòng xoắn sẽ làm cho các phân tử glucose thay đổi vị trí chút ít và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trưng Ái lực của amylose

với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer [24]

Dạng xoắn của amylose chỉ tạo thành trong dung dịch ở nhiệt độ thường Khi

ở nhiệt độ cao chuỗi xoắn sẽ bị duỗi thẳng ra và không có khả năng liên kết với các phân tử khác

* Amylopectin: Amylopectin có cấu tạo phức tạp hơn Tham gia cấu tạo amylopectin có khoảng 500.000 đến 1 triệu phân tử α-D-glucose liên kết với nhau Trong amylopectin mạch thẳng được tạo thành từ các liên kết α -1,4-glucoside; và các mạch nhánh liên kết với mạch thẳng chính bằng liên kết α-1,6-glucoside

Cứ khoảng 24 - 30 đơn vị glucose trên mạch sẽ có một liên kết α glucoside để tạo mạch nhánh Trên mạch nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh

-1,6-cấp 2, cứ như vậy phân tử amylopectin phân nhánh nhiều cấp rất phức tạp

Trang 24

Người ta có thể phân biệt được amylose và amylopectin dựa trên sự khác nhau về khối lượng phân tử; cũng như về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodine Amylopectin có phân tử lượng trong kho ảng 107 đến 108

; trong khi phân tử lượng của amylose chỉ khoảng từ 5x105đến 106

Ở nhiệt độ 20o

C, khả năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2% khối lượng; còn của amylose là 20% khối lượng.[2]

Một điểm khác nhau quan trọng giữa amylose và amylopectin là các chất có

thể liên kết với chúng Bản chất hóa học của amylose cho thấy nó có thể kết hợp với phân tử các chất kỵ nước nhỏ Nhiều nghiên cứu cho thấy, amylose (đặc biệt từ ngũ cốc) có thể kết hợp với một lượng tương đối lớn lipid Khác với amylose, amylopectin có thể có các liên kết cộng hóa trị với phosphate, đặc biệt là amylopectin từ các loại củ

Như vậy người ta có thể tách các phân đoạn amylose và amylopectin dựa trên sự khác biệt về khả năng gắn kết hoặc dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của chúng

a/ Amylose

b/ Amylopectin Hình 1.2 Cấu trúc của amylose và amylopectin [49]

Trang 25

1.3.2 Cấu trúc tinh thể của tinh bột [26]

Tinh bột có bản chất bán tinh thể với nhiều mức độ tinh thể hóa khác nhau, thường từ 15-45% khi ở dạng hạt Khả năng tạo tinh thể của tinh bột gắn liền với thành phần amylopectin Lớp tinh thể của hạt tinh bột được tạo thành từ mạch xoắn kép amylopectin, sắp xếp theo phương pháp tiếp tuyến với bề mặt hạt, đầu không

khử hướng vào bề mặt của hạt Các lớp tinh thể và vô định hình được sắp xếp với chiều dày theo chu kỳ 9-10nm Trong lớp tinh thể, các đoạn mạch thẳng liên kết với nhau thành các sợi xoắn kép, xếp thành dãy và tạo thành chùm; trong khi phần

amylopectin bao gồm các loại chuỗi có chiều dài mạch rất khác nhau

Hạt tinh bột được tạo thành từ các lớp tinh thể cứng (cấu trúc tinh thể) và mềm (cấu trúc bán tinh thể) với chiều dày khoảng vài trăm nm Các lớp tinh thể cứng được tạo thành từ các hạt hình cầu có kích thước lớn (50-500nm), các lớp bán tinh

thể mềm được tạo thành từ các hạt hình cầu có kích thước nhỏ hơn (20-50nm) Sự

lặp lại hết lớp cứng đến lớp mềm được xem như những lớp sinh trưởng và có thể quan sát được nhờ kính hiển vi thông thường Độ dày của các lớp tinh thể này càng

ở phía ngoài bề mặt của hạt thì càng trở nên mỏng hơn; và kích thước của các lớp này phụ thuộc vào rất nhiều vào điều kiện phát triển của cây

1.3.3 Ứng dụng của tinh bột trong công nghiệp thực phẩm [41, 46]

Tinh bột là nguồn nguyên liệu rẻ tiền được sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm Tinh bột có thể được sử dụng ở dạng

tự nhiên hay dạng đã hồ hóa Nó là thành phần chính, tạo độ đặc, độ chắc cho một

số sản phẩm như các loại bánh Ngoài ra, tinh bột còn là chất kết dính trong các sản

phẩm thịt chế biến, và thực phẩm ép đùn Tinh bột tạo độ đục cho nhân bánh dạng kem (cream filling), và tạo độ bóng cho các loại hạt Nó là tác nhân chảy trong các

loại bột dùng để nướng bánh, là chất làm bền bọt cho các loại kẹo dẻo và soda; là

chất tạo gel trong các loại kẹo gum và thực phẩm mềm dẻo (yieldings) Bên cạnh

đó, tinh bột cũng là tác nhân tạo hình trong các sản phẩm thịt và thức ăn cho vật nuôi trong nhà; là chất ổn định trong các sản phẩm đồ uống, dùng để trang trí các

Trang 26

món salad, làm đặc các loại nước thịt, nhân bánh và xúp Trong đó, nguồn tinh bột

từ ngũ cốc được sử dụng nhiều nhất, đặc biệt trong ngành công nghiệp sản xuất rượu bia và ngành công nghiệp sản xuất các loại đường như glucose, fructose, maltose và dextrin

1.3.4 Giới thiệu sơ lược về các loại tinh bột sử dụng trong đề tài luận văn

1.3.4.1 Bột gạo [41, 43, 48]

Lúa gạo là cây lương thực chính và lâu đời trong nền nông nghiệp lúa nước ở

gạo thế giới niên vụ 2010/11 đạt khoảng 452,5 triệu tấn, giảm 2,1 triệu tấn so với dự báo tháng 9 Dự báo sản lượng lúa gạo toàn cầu niên vụ 2010/11 tăng gần 2% so với niên vụ trước

Trong năm 2010, Thái Lan và Việt Nam đã xuất khẩu ra thị trường quốc tế lần lượt khoảng 9,03 triệu tấn và 6,9 triệu tấn gạo, tiếp tục giữ vững vị trí là hai nước xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới Tại châu Á, Thái Lan tiếp tục mất dần thị phần trước Việt Nam, chủ yếu do giá gạo Thái cao hơn gạo cùng loại của Việt Nam Còn đối với Việt Nam, giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam năm 2010 đã vượt qua mức của cả năm 2009 (hơn 6 triệu tấn gạo, trị giá 2,437 tỉ USD), mức cao nhất từ trước đến nay Hiệp hội Các nhà xuất khẩu gạo Thái Lan hồi đầu tháng 7 năm 2010 cho hay, Việt Nam có thể vượt Thái Lan trở thành nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới trước năm 2015 do giá gạo của Thái Lan cao hơn

V ề tính chất: Hạt tinh bột gạo có hình dạng đa giác Hàm lượng amylose trung

bình khoảng 17%, khả năng trương nở ở 95o

C khoảng 19 lần, nhiệt độ hồ hoá của

hạt tinh bột gạo khoảng 67 -78o

C

Hàm lượng tinh bột 62,4% Gạo là nguồn chủ yếu cung cấp calo Amylose có cấu tạo mạch thẳng và có nhiều ở gạo tẻ Amylopectin có cấu tạo mạch nhánh và có nhiều ở gạo nếp

Về hàm lượng protein, các giống lúa Việt Nam có hàm lượng protein chủ yếu trong khoảng 7- 8%, trong đó, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn lúa

tẻ

Trang 27

Hàm lượng lipit có chủ yếu ở lớp vỏ gạo Nếu ở gạo xay là 2,02% thì ở gạo đã xát chỉ còn 0,52%

Về hàm lượng vitamin: Trong lúa gạo còn có 1số vitamin quan trọng nhất là vitamin nhóm B như B1, B2, B6, PP Lượng vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt ( trong

Bảng 1.1 Bảng so sánh giá trị bổ dưỡng giữa gạo lức và bắp hạt [41]

Sau gạo, bắp là cây lương thực chiếm thị phần lớn trong nền nông nghiệp

Việt Nam Theo Cục trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, mỗi năm nước ta sản xuất từ 1,1 triệu đến 1,2 triệu tấn bắp Thêm vào đó, từ năm 2011, Việt Nam bắt đầu trồng bắp biến đổi gen đại trà trên cả nước (kết luận của ông Bùi Bá

Bổng, Thứ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tại Hội thảo đầu bờ đánh giá kết quả khảo nghiệm đồng ruộng các giống bắp (ngô) biến đổi gen tại Bà

Rịa-Vũng Tàu ngày 14/9/2010) [47], do đó sản lượng bắp thu hoạch sẽ tăng lên đáng kể, có thể đáp ứng đủ nhu cầu của người dân

Trang 28

1.3.4.3 Bột năng ( Bột sắn mì) [2, 41, 43, 44]

Tinh bột sắn có màu rất trắng Theo tiêu chuẩn Mỹ, các loại sắn tốt có pH từ 4.5 đến 6.5 và độ acid thấp Tinh bột sắn có hàm lượng amylopectin tương đối cao, hàm lượng amylose biến thiên trong khoảng 8-29% Vì chứa nhiều amylopectin nên tinh bột sắn có độ nhớt cao, độ bền gel cao, và xu hướng thoái hóa thấp Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột sắn trong khoảng 58-70oC Do có độ nở và độ hòa tan cao nên tinh

bột sắn có độ trong tốt, phù hợp trong chế biến thực phẩm, làm bánh, làm nước xốt trong các món salad, tráng miệng,…đặc biệt đối với các sản phẩm phải bảo quản trong thời gian dài

Về sản xuất, cây sắn (cây khoai mì) là một trong những cây trồng chủ yếu, lâu đời của nước ta sau lúa và bắp, mục đích được dùng làm lương thực và thức ăn gia súc Đặc biệt đối với người dân vùng trung du, miền núi xa xôi hẻo lánh, và đồng bào dân tộc cây sắn được coi là cây lương thực quan trọng

Trong những năm gần đây do yêu cầu phát triển của một số ngành công nghiệp, nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước, cây sắn đang chuyển dần thành cây có sản phẩm làm nguyên liệu không thể thiếu cho các nhà máy chế biến Cây sắn hiện nay đang được phát triển mạnh cả về diện tích, năng suất và sản lượng

Việt Nam đứng hàng thứ 11 trên thế giới về sản lượng sắn, nhưng là nước xuất khẩu tinh bột sắn đứng hàng thứ 3 trên thế giới, sau Thái Lan, và Indonesia

1.4 Các s ản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột và vai trò ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm [2, 6]

Các sản phẩm đường ngọt từ tinh bột là những sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột bằng acid hoặc enzyme Những sản phẩm có nhiều ứng dụng bao gồm dextrin, maltodextrin và cyclodextrin, đường glucose tinh thể hoặc dung dịch D-glucose, xi-rô giàu fructose (high fructose syrup – HFS) hoặc fructose tinh thể, xi-rô glucose và xi-rô maltose

Các sản phẩm tinh bột thủy phân như dextrin, xi-rô maltose, xi-rô glucose

và các sản phẩm khác thường được phân loại dựa trên chỉ số DE – Dextrose

Trang 29

equivalent DE là đại lượng chỉ khả năng khử so với chuẩn là 100% ở đường glucose (dextrose), hay là số gram tương đương D-glucose trong 100 gram chất khô của sản phẩm Chỉ số này thông thường được xác định bằng phương pháp so màu

với thuốc thử DNS (3,5-dinitro salicylic acid) hay bằng phương pháp sắc ký (Bernetti 1992) [18] Phần lớn các loại tinh bột có chỉ số DE bằng 0 do số lượng các gốc khử có mặt rất ít Theo lý thuyết, sự thủy phân hoàn toàn tinh bột sẽ tạo ra đường glucose với chỉ số DE 100 Các sản phẩm thủy phân ở mức độ trung gian sẽ

có giá trị DE nằm trong khoảng từ 0 đến 100 Tuy nhiên, đôi khi DE không hoàn toàn thể hiện đúng mức độ thủy phân, đặc biệt khi sản phẩm chứa nhiều thành phần đường oligo, do tinh bột được thủy phân bởi những nguồn enzyme và phương pháp khác nhau Trong trường hợp này, sản phẩm được đánh giá bởi thành phần và nồng

độ các đường DP1 (glucose), DP2 (maltose), DP3 (maltotriose), DP4 (maltotetraose)…

1.4.1 Dextrin [1, 33, 44, 45]

Dextrin là những phân tử polymer của đường D-glucose, có thể hoàn toàn

mạch thẳng, phân nhánh ít, nhiều hay mạch vòng Evans và Wurzburg đã phân loại dextrin thành 4 nhóm dựa trên cách sản xuất ra chúng:

enzyme từ B macerans

bằng acid

bột với acid (đây là loại dextrin thông dụng nhất và thường được gọi là pyrodextrin)

Dextrin có mặt trên thị trường dưới nhiều dạng: dạng bột có màu sắc thay đổi

từ trắng tới vàng hoặc nâu, dạng hạt và dạng hồ (paste) Thông thường dextrin được

Trang 30

chia thành dextrin trắng, Canary dextrin và gum British Các sản phẩm trên nhận được trong các điều kiện sản xuất khác nhau, có những tính chất và ứng dụng khác nhau [1]

 Dextrin trắng được sản xuất bằng cách rang tinh bột ở nhiệt

độ thấp với acid Nó có màu từ trắng tới màu kem, độ tan và độ nhớt ở trong

một giới hạn rộng, chứa các mạch polysaccharide phân tử lượng thấp, độ phân nhánh trung bình 3%

 Canary dextrin được sản xuất ở nhiệt độ cao nên có màu sẫm

hơn, độ tan cao hơn và độ nhớt cũng thấp hơn so với dextrin trắng Canary dextrin có phân tử lượng trung bình và mức độ phân nhánh cao (20%) do

hiện tượng chuyển gốc glucose (trans-glucosidation) và polymer hóa ngược

cao nhưng không có mặt acid nên các phản ứng đứt gãy, các liên kết glucosidase đều thấp, thời gian phản ứng cũng lâu hơn so với sản xuất hai

trans-loại dextrin trắng và Canary dextrin Gum British có phân tử lượng trung bình, mức độ phân nhánh tương tự Canary dextrin, và có màu nâu từ nhẹ tới

sẫm

 Quy trình sản xuất dextrin: gồm 3 bước [2]

Sấy: Tinh bột phải được sấy để đạt được độ ẩm từ 1 – 5%

Acid hóa: Quá trình acid hóa đư ợc thực hiện bằng cách phun dung dịch acid HCl loãng (0,05-0,15%) ở dạng hơi vào tinh bột có độ ẩm thấp hơn 5%

Thông thường người ta pha trộn thêm dung dịch sodium carbonate, ammonium hydroxide, urea vào tinh bột và pH được giữ ở giá trị mong muốn Các

chất này sẽ hoạt động như các dung dịch đệm (buffer) và chúng đặc biệt cần thiết khi sản xuất British gum ở nhiệt độ cao

Dextrin hóa: Khi tinh bột được gia nhiệt tới nhiệt độ 95-1200C trong điều

kiện acid phù hợp, ta thu được dextrin trắng Trong khoảng nhiệt độ từ 150 đến

180oC, một chuỗi các dextrin màu vàng nhạt được tạo ra Để sản xuất British gum

Trang 31

nhiệt độ được sử dụng là 170-1950

C và thời gian chuyển hóa là 7 giờ hoặc lâu hơn Trong quá trình chuyển hóa này, sự tăng nhiệt độ và độ ẩm phải luôn được kiểm soát chặt chẽ để có được mức độ chuyển hóa theo yêu cầu

Sau đó dextrin được đưa đến một thiết bị trộn khác để tránh sự chuyển hóa quá mức (overconversion) Sau khi làm nguội, dextrin được trung hòa bằng ammonia và đóng gói

Sơ đồ 1.1 Quy trình sản xuất dextrin [2]

• Ứng dụng của dextrin trong công nghiệp thực phẩm [1, 44, 46]

Dextrin được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Sản phẩm có DE 4-7 được sử dụng để tạo màng mỏng dễ tan và tự hủy được dùng

để bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, chống mất nước và duy trì hàm lư ợng ẩm; đưa vào kem; làm phụ gia cho các loại nước xốt; làm chất độn tạo viên trong công nghiệp dược

Dextrin cũng được biết đến như là chất thay thế chất béo, như trong món trứng đánh tráng miệng không béo; hay trong sản xuất kem, dextrin được sử dụng thay thế

chất béo và giảm hàm lượng calori

Sản phẩm có DE 9-12 được dùng chế biến đồ uống, đặc biệt cho trẻ em; làm

thức ăn cho vận động viên; làm kẹo gum mềm; làm chất trợ sấy; chất giữ hương;

Trang 32

mất nước khi đun dưới áp suất thấp, cũng như khi dùng các chất làm khan nước như

H2SO4 đậm đặc hay P2O5 Maltose cấu tạo từ hai monosaccharide là α-glucose liên

kết với nhau bằng liên kết α-1,4- glucoside

Hình 1.3 C ấu tạo Maltose

Trong sản xuất các loại đồ uống, xi-rô maltose được dùng trong công nghiệp

lên men bia để bổ sung cho malt đại mạch, cung cấp đường cho quá trình lên men,

tăng vị cho sản phẩm

Trong công nghiệp sản xuất sữa cũng như sản xuất kem, xi-rô maltose cung

cấp hương vị, độ mềm mại, cải thiện cấu trúc sản phẩm, kiểm soát hiện tượng kết tinh, điều chỉnh độ ngọt, tăng hạn sử dụng và giảm hiện tượng tan chảy của kem Trong công nghiệp bánh mì, xi-rô thường được dùng như nguồn đường lên men cho nấm men Nó cũng cung c ấp độ ngọt, tạo màu, tăng thời hạn sử dụng nhờ cung cấp chất giữ ẩm, giảm hiện tượng kết tinh và tăng độ mềm mại cho bánh Maltose tinh thể có đặc tính thấm hút dầu mỡ tốt, do đó nó cải thiện được cấu trúc

và tạo cảm giác ngon miệng với những sản phẩm chứa dầu như bánh mì hình lư ỡi

liềm

Trang 33

Vì maltose tinh thể có độ ngọt chỉ bằng 1/3 so với đường saccharose nên đối

với việc sản xuất nhân bánh ngọt, nếu pha trộn maltose tinh thể với saccharose sẽ làm giảm bớt năng lượng ngọt dư thừa, mà không mất tính cảm quan

Trong đồ hộp rau quả, xi-rô maltose tạo cấu trúc và độ nhớt, độ bóng và cảm giác ngon miệng, ngăn ngừa sự kết tinh, tăng cường hương vị, và cải thiện màu cho

sản phẩm

Trong các loại thức ăn điểm tâm làm từ ngũ cốc, xi-rô maltose ngăn cản sự thoái hóa tinh bột, do đó làm tăng thời hạn sử dụng, ổn định được màu, mùi, vị trái cây của sản phẩm Ngoài ra, xi-rô cũng được sử dụng trong nước xốt cà chua để

kiểm soát độ ngọt và cấu trúc, trong các sản phẩm thịt để tăng cường mùi vị và màu sắc [2, 43]

Maltose tinh thể có tính chịu nhiệt và acid tốt hơn saccharose nên nó ít bị biến tính hơn trong quá trình chế biến thực phẩm Maltose tinh thể có khả năng giữ được màu và mùi vị mong muốn khi điều chỉnh nhiệt độ hay các điều kiện khác trong quá trình chế biến

Hydro hóa sản phẩm xi-rô maltose sẽ tạo ra sản phẩm chứa maltitol và các rượu cao phân tử khác để sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm

Trong điều trị y khoa, sử dụng dịch maltose tinh khiết tiêm vào tĩnh m ạch không làm hàm lượng đường trong máu tăng đột ngột, nên nó thích hợp cho việc cung cấp chất dinh dưỡng cho bệnh nhân tiểu đường

Ngoài ra dịch maltose cũng đư ợc xem là nguồn carbon lý tư ởng để nuôi vi khuẩn kháng sinh so với glucose vì áp suất thấm lọc của glucose cao hơn maltose và đôi khi gây ra những ảnh hưởng thất thường

Trang 34

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lượng của maltose tinh thể [43]

Chỉ tiêu chất lượng Đơn vị

1.4.3 Glucose [1, 42, 44]

Glucose là sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột hoàn toàn Trong tự nhiên, glucose có vị ngọt của quả nho hay mật ong, và có độ ngọt bằng 60-80% so với độ ngọt của đường saccharose Do phân tử lượng chỉ bằng ½ so với đường saccharose nên glucose có áp suất thẩm thấu cao hơn so với đường saccharose ở cùng một khối lượng

mạch vòng Khi hòa tan trong nước tạo dung dịch, glucose có sự cân bằng, chuyển hóa qua lại và tồn tại cả ba dạng cấu tạo này, trong đó dạng vòng hiện diện nhiều hơn

Hình 1.4 Công thức cấu tạo glucose (dạng mạch hở và 2 dạng mạch vòng α-glucose, β-glucose) [50]

Trang 35

Đường glucose được sử dụng trong sản xuất bánh mì đ ể tăng khả năng lên men, tăng độ dai cho vỏ bánh để dễ cắt, dễ cầm bánh, cải thiện màu, mùi vị và cấu trúc của bánh Trong bánh ngọt, glucose giúp tăng thể tích, cấu trúc, và tính cân đối

của bánh Glucose kiểm soát độ ngọt và vị trong các loại bánh bích quy, nó được

phủ lên trong quá trình nướng để tạo màu cho bề mặt và làm mềm bánh

Glucose cũng mang lại cấu trúc mềm mại, vị ngọt dịu và khả năng tan chảy tốt cho các sản phẩm kem và đồ tráng miệng lạnh Trong lên men bia, glucose được

sử dụng như cơ chất có khả năng lên men bổ sung để làm giảm lượng carbohydrate

và lượng calori trong các loại bia năng lượng thấp

Trong rượu vang, glucose được sử dụng để tăng khả năng lên men, tăng vị,

và độ ngọt cho sản phẩm Trong các loại đồ uống, glucose cung cấp độ ngọt, áp suất

thẩm thấu, nó cũng là chất độn giúp tăng vị, kiểm soát khả năng di động và tăng

thời gian bảo quản cho sản phẩm đồ uống dạng bột

Trong sản xuất kẹo, glucose cung cấp độ ngọt, độ mềm mại cho sản phẩm đồng thời giúp kiểm soát hiện tượng kết tinh Kết hợp giữa glucose và saccharose giúp tăng vị, ngăn cản sự kết tinh, cải thiện màu sắc, độ bóng, tăng cảm giác mát

lạnh ở miệng đồng thời cân bằng độ ngọt, độ dai, độ cứng cho sản phẩm kẹo Glucose cũng là phụ gia lý tư ởng cho quá trình đóng viên do tính ch ảy, khả năng

kết dính cũng như tách rời tốt Glucose cũng là chất tạo độ ngọt, độ mềm dẻo, và dễ

cắt trong các sản phẩm kẹo dẻo

Trong các loại đồ hộp như nước chấm, xúp rau củ, đồ hộp trái cây, mứt, thạch quả, glucose được sử dụng để cung cấp độ ngọt và vị, tăng độ bền nhờ kiểm soát áp suất thẩm thấu, cải thiện cấu trúc và chất lượng thẩm mỹ của sản phẩm Glucose cũng tham gia vào quá trình tạo màu cho sản phẩm như xúc xích, bơ đậu phộng…

Trong công nghiệp dược, glucose được sử dụng để truyền tĩnh mạch, hay để đóng viên Nó cũng được sử dụng như nguyên liệu của các quá trình lên men sản

Trang 36

xuất các acid hữu cơ, vitamin, kháng sinh, enzyme, acid amin, polysaccharide… Nhu cầu glucose cao nhất là trong lĩnh vực sản xuất cồn ethanol nhiên liệu

1.5 Tình hình s ản xuất dextrin, maltose, glucose,… trong nước [1, 2, 44]

Trong nước cũng có một số nhà máy sản xuất các sản phẩm chuyển hóa từ tinh

bột Sản phẩm xi-rô glucose của Công ty Bánh kẹo Hải Hà, nhà máy đường Quảng

sản xuất ở một số cơ sở chế biến thủ công, trong đó enzyme được chiết từ malt thóc

Sản phẩm dextrin phân tử lượng lớn thường được tìm thấy trên thị trường mang nhãn hiệu Trung Quốc, có độ dẻo, độ nhớt cao và không tan trong nước Sản phẩm tinh bột biến tính bằng hóa chất của hãng Vedan như tinh b ột acetyl hóa, tinh bột cationic, tinh bột oxy hóa và tinh bột biến tính kép Ngoài ra còn có các sản phẩm bánh kẹo ngọt của các công ty như Bánh kẹo Hải Hà, Bánh kẹo Kinh đô, công ty

Thực phẩm Sài Gòn,

Bên cạnh đó, tác giả Hoàng Kim Anh cùng các cộng sự cũng đã có nhiều nghiên cứu tương đối chi tiết về cấu trúc cũng như các đặc tính hóa, lý của tinh bột (đặc biệt là tinh bột sắn), và quy trình công nghệ sản xuất maltodextrin từ sự thủy phân tinh bột sắn bằng enzyme [1]

1.6 Sơ lược về kỹ thuật HPLC – Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [14] 1.6.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ viết tắt của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – High Performance Liquid Chromatography

HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi bằng các hạt có kích thước dưới 10 µm Trong đó, người ta dùng một bơm có áp suất cao khoảng 300 atm

để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ khoảng 20 µg

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ và trao đổi ion

Trang 37

Hình 1.5 Máy HPLC 1.6.2 Hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC gồm các bộ phận chính:

Hình 1.6 Mô hình hệ thống HPLC điển hình [14]

1 Bình chứa dung môi pha động

2 Bơm cao áp

3 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

4 Cột sắc ký (pha tĩnh): để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt

Trang 38

Ph ần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Các lo ại tinh bột sử dụng trong đề tài:

Bột gạo, bột bắp, bột năng được mua ở chợ

2.1.4 Các loại enzyme amylase sử dụng trong luận văn:

Quá trình dịch hóa và đường hóa thực hiện trong đề tài đã sử dụng các loại enzyme amylase thương mại phù hợp:

2.1.4.1 α-amylase (EC 3.2.1.1) hay còn có tên gọi khác là glycogenase;

endoamylase; Taka-amylase A; 1,1- α-D-glucan glucanohydrolase, là enzyme dịch

hóa tinh bột phân cắt ngẫu nhiên các liên kết α-1,4-glycoside trong phân tử amylose

hoặc amylopectin của tinh bột và tạo ra hỗn hợp maltodextrin với các DP khác nhau; enzyme này không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside Enzyme sử dụng

trong đề tài là α -amylase thương mại Termamyl-LS (hãng Novo) Đây là enzyme

có hoạt tính rất mạnh, được tách chiết từ vi khuẩn Enzyme hoạt động ở điều kiện 90-95oC, pH 5,8-6,2 và hàm lượng sử dụng được công ty khuyến cáo là 0,11ml/kg tinh bột

2.1.4.2 β-amylase (EC 3.2.1.2): các tên gọi khác saccharogen amylase;

glycogenase; 1,4-α-D-glucan maltohydrolase; là một enzyme đường hóa, có khả

năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside, tạo ra dịch xi rô maltose với hàm lượng cao và một ít glucose Enzyme này cũng không có khả năng phân cắt liên kết α-1,6-glycoside và đặc biệt có khả năng tạo ra vòng cyclodextrine Enzyme đư ợc chọn

trong đề tài là enzyme thương mại Sebamyl –L (MDI Chemical), hoạt động ở nhiệt

độ 58-60o

C, pH 4,8-5,2 và hàm lượng được công ty khuyến cáo sử dụng là 0,5ml/kg

cơ chất

Trang 39

2.1.4.3 γ-amylase (EC 3.2.1.3): các tên khác Glucan 1,4-α-glucosidase;

amyloglucosidase; Exo-1,4-α-glucosidase; glucoamylase; lysosomal α-glucosidase; 1,4- α-D-glucan glucohydrolase; là một enzyme đường hóa, có khả năng thủy phân

các liên kết α-1,4-glycoside và cả liên kết α-1,6-glycoside để tạo ra sản phẩm cuối cùng là dung dịch xi rô glucose với nồng độ rất cao Đề tài sử dụng enzyme thương

mại AMG-E (hãng Novo); enzyme hoạt động ở nhiệt độ 60o

C, pH 4,4 và hàm lượng enzyme được khuyến cáo sử dụng là 0,35ml/kg cơ chất

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp xác định pH [10, 16]

• Th ực hiện: Cân 5g nguyên liệu hòa tan trong 50ml nư ớc, dùng que thủy

tinh khuấy đều Để lắng sau 1 giờ, lấy dịch trong đo với máy đo pH

2.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm [3, 10, 16]

• Nguyên t ắc:

Dựa trên nguyên lý dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong nguyên liệu (mẫu), làm khô mẫu đến trọng lượng không đổi Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy Trọng lượng mẫu mất đi khi sấy khô tuyệt đối là lượng nước có trong mẫu

Từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu

• Cách tính k ết quả

Trong đó

m1: Khối lượng mẫu + chén trước khi sấy (g)

m2: Khối lượng mẫu + chén sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

Trang 40

m: Khối lượng mẫu phân tích (g) W: Độ ẩm của mẫu (%)

2.2.3 Phương pháp định lượng đường tổng số: phương pháp Phenol [3, 8, 16]

vào becher đựng mẫu, khuấy đều, đun 2 lần tới sôi trên nồi cách thủy, lọc, rửa sạch 2-3 lần

bằng cồn 80o nóng, cho bay hơi cồn trên nồi cách thủy Cặn khô được hòa tan vào nước đến 50ml Khi làm hiện màu có thể pha loãng nếu nồng độ đường quá cao

Xây d ựng đường chuẩn

Lấy 7 bình đ ịnh mức 100ml, cho vào đó theo thứ tự: 1,2,3,4,5,6 và 7ml dung

dịch saccharose 0,1%; cho nước cất tới vạch mức Từ mỗi bình hút ra 1ml, cho thêm 1ml dung dịch phenol 5% Cẩn thận cho thêm 5ml H2SO4 đậm đặc Để 10 phút rồi lắc đều, giữ tiếp 10-15 phút ở nhiệt độ phòng để xuất hiện màu Trong mỗi ống nghiệm sẽ có lượng tương ứng 10,20,30,40,50,60 và 70 µg saccharose Đem đo

mật độ quang ở bước sóng 490nm, vẽ đồ thị chuẩn

Xác định đường trong mẫu: Hút 1ml dung dịch đường cần xác định, tiến hành tương tự như bước xây dựng đường chuẩn saccharose

V: Thể tích dịch đường ban đầu (ml)

v: Thể tích mẫu đem phân tích (ml)