Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ nấm men pichia pastoris gs115

Bảng 1.1: Các loại thức ăn có hoạt tính phytase trên 100 đơn vị /kg 11 Bảng 1.2: Đặc tính phytase được thu nhận từ các nguồn khác nhau 14 Bảng 1.3: Kích thước phân tử của phytase từ các

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE TÁI TỔ HỢP TỪ

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60 42 031

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE TÁI TỔ HỢP TỪ

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60 42 031

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

giúp em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khóa học này

Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên cứu Phòng Vi Sinh Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, đã quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Em xin cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, phòng Các Chất Có Hoạt tính Sinh học, cùng quý thầy cô ở Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tận tính hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô

Cảm ơn các em Trinh, Vân, Phi, Linh, Lan cũng như các bạn cùng lớp

đã luôn gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ mình trong thời gian qua

Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành cảm ơn ông bà, cha mẹ hai bên đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, động viên, giúp đở và tạo điều kiện để con có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này

Cuối cùng, em xin cảm ơn ông xã, dù không phải lúc nào cũng ở gần bên, nhưng anh luôn thương yêu, động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này Anh luôn là chỗ dựa vững chắc cho em

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2009 Xin chân thành cảm ơn

Lê Thị Ngọc Sương

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình và biểu đồ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu 3

1.1 Acid phytic 4

1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4

1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic 5

1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên 6

1.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic 7

1.2 Enzym phytase và phytase của Aspergillus ficuum 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase 8

1.2.3 Phân loại 9

1.2.3.1 Phân loại dựa trên nhóm phosphate đầu tiên bị enzyme tác động 9

1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin 9

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase 10

1.2.4.1 Phytase từ động vật 10

1.2.4.2 Phytase từ thực vật 11

1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 12

1.2.5 Đặc tính sinh hóa 15

1.2.5.1 Nhiệt độ và độ pH tối ưu 15

1.2.5.2 Trọng lượng phân tử 16

1.2.5.3 Cơ chất 17

1.2.5.4 Thành phần amino acid của phyA và phyB

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 20

1.2.7.1 Ion kim loại 20

1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho 21

1.2.7.3 Nồng độ cơ chất 21

1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym phytase 21

1.2.8.1 Nguồn cacbon 21

1.2.8.2 Nguồn nitơ 22

1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng 22

1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho 23

1.2.9 Ứng dụng của enzym phytase 23

1.2.9.1 Ứng dụng trong nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm 23

1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 24

1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-inositol phosphate 25

1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam 26

1.3 Nấm men Pichia pastoris 27

1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung 27

1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 28

1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P pastoris 30

1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai 31

1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã 32

1.3.6 Các chủng biểu hiện phổ biến 33

1.3.7 Các vector biểu hiện 34

1.3.8 Pichia pastoris GS115 đã biến nạp 35

Chương 2: Vật liệu & Phương pháp 38

2.1 Vật liệu 39

2.1.1 Nguyên vật liệu 39

2.1.2.1 Hóa chất 39

2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 41

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 42

2.2 Các phương pháp sử dụng 43

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein: 43

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính phytase 45

2.2.3 Phương pháp chạy điện di SDS-PAGE 48

2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel 52

2.2.5 Phương pháp thẩm tích (Dialyse) để loại muối 54

2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (Km) 55

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 58

2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase 58

2.3.2 Khảo sát các điệu kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, lên men thu nhận phytase tái tổ hợp 59

2.3.2.1 Tỷ lệ giống 59

2.3.2.2 Thời gian nuôi cấy 60

2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy 60

2.3.2.4 Lượng methanol bổ sung trong quá trình nuôi cấy 61

2.3.2.5 Nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 61

2.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa 62

2.3.4 Xác định hiệu quả của quá trình nuôi cấy 62

2.3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 63

2.3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 63

2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH 63

2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 64

2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (topt) của enzym phytase thu nhận được 64

sắc ký lọc gel 64

2.3.7 Điện di SDS-PAGE 65

2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi qua sắc ký lọc gel 65

2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để tìm ra giá trị Km (hằng số Michaelis) của enzym 65

2.3.8.2 Xác định Km 65

2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp 66

Chương 3: Kết quả & Biện luận 67

3.1 Kiểm tra khả năng sinh phytase của các giống 68

3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy thu nhận phyase 69

3.2.1 Khảo sát tỷ lệ giống cấy 69

3.2.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy 71

3.2.3 Khảo sát môi trường nuôi cấy 73

3.2.4 Khảo sát lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ trong quá trình nuôi cấy 75

3.2.5 Khảo sát nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy 77

3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt tính phytase 80

3.4 Xác định hiệu quả nuôi cấy thu nhận phytase tái tổ hợp 82

3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 84

3.5.1 Khảo sát sự bền nhiệt của phytase tái tổ hợp 84

3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH 87

3.5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các ion kim loại 90

3.5.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 92

3.6 Tinh sạch enzyme phytase thu nhận được 94

được, chưa qua loại muối 94

3.6.2 Chạy sắc ký với enzyme phytase tái tổ hợp đã qua loại muối 96

3.6.3 Xác định hiệu suất của quá trình sắc ký lọc gel 98

3.7 Điện di SDS-PAGE 100

3.8 Hằng số Michaelis (Km) 103

Chương 4: Kết luận & Đề nghị 107

4.1 Kết luận 108

4.1.1 Các điều kiện liên quan đến quá trình nuôi cấy 108

4.1.2 Tác nhân tủa 108

4.1.3 Hiệu quả thu nhận phytase tái tổ hợp 108

4.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 109

4.2 Đề nghị 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 Chương 5: Phụ lục

BMGY : Bufferred Glycerol-comlex Medium

BMMY : Bufferred Methanol-comlex Medium

CPE : Chế phẩm phytase tái tổ hợp thu nhận được

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid

HđC : Hoạt độ chung của phytase

HđR : Hoạt độ riêng của phytase

Hđmax : Hoạt độ tối đa

Phytase-PAI : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có

mang gen phyAI

Phytase-PB : Phytase thu nhận từ giống Pichia pastoris GS115 có

mang gen phyB

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis

TCA : Tricloroacetic acid

TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylene ethylene diamine

YPD : Yeast extract Pepton Destrose

YNB : Yeast Nitrogene Base

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các loại thức ăn có hoạt tính phytase trên 100 đơn vị /kg 11 Bảng 1.2: Đặc tính phytase được thu nhận từ các nguồn khác nhau 14 Bảng 1.3: Kích thước phân tử của phytase từ các nguồn khác nhau 17 Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch Albumin chuẩn để dựng đường

Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch photphate chuẩn 46

Bảng 3.1: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB theo tỷ lệ giống 69 Bảng 3.2: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB theo thời gian nuôi cấy 71 Bảng 3.3: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB theo môi trường nuôi cấy 73

Bảng 3.4: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB theo lượng methanol bổ sung

Bảng 3.5: Sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB theo nồng độ K3PO4 bổ sung

Bảng 3.6: Sự biến đổi hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ

riêng của phytase-PAI và phytase-PB theo các tác nhân tủa 81 Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất nuôi cấy của phytase-PAI và phytase-PB 84 Bảng 3.8: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PAI 85

Bảng 3.9: Sự bền với nhiệt độ của phytase-PB 86

Bảng 3.10: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của

phytase-PAI và phytase-PB theo sự đổi pH 88 Bảng 3.11: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđ đối

chứng của phytase-PAI tương ứng với các ion kim loại

chứng của phytase-PB tương ứng với các ion kim loại 91 Bảng 3.13: Sự biến đổi hoạt độ chung và %hoạt độ chung/Hđmax của

phytase-PAI và phytase-PB tương ứng với các nhiệt độ

theo nồng độ cơ chất tương ứng với thời gian phản ứng

Bảng 3.19: Hoạt độ chung cao nhất của phytase theo nồng độ cơ

Trang

Hình 1.4: Sự thủy phân acid phytic thành inositol và acid phosphoric

Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris 27

Hình 1.6: Biểu đồ chung cho vector biểu hiện của P pastoris 31

Hình 2.2: Hệ thống sắc ký lọc gel Biologic LP (Bio-Rad) 53

Hình 2.3: Đường cong của phương trình Michaelis Menten 56

Hình 2.4: Đường cong của phương trình Lineweaver Burk 57

Hình 3.1: Khảo sát khả năng sinh phytase của các giống

GS115/phyAI và GS115/phyB cấy trên môi trường

Hình 3.2: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung của

Hình 3.3: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

Hình 3.4: Sự biến thiến hàm lượng protein và hoạt độ chung của

Hình 3.5: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ của

Hình 3.6: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB (dạng thô), trên môi trường

Hình 3.7: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI và phytase-PB (dạng tủa), trên môi trường

phytase-PAI theo lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ 76

Hình 3.9: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PB, theo lượng methanol bổ sung mỗi 24 giờ 77

Hình 3.10: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PAI, theo nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường 79

Hình 3.11: Sự biến thiên hàm lượng protein và hoạt độ chung của

phytase-PB, theo nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường 79

Hình 3.12: Sự biến thiên hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ

riêng của phytase-PAI theo các tác nhân tủa khác nhau 81

Hình 3.13: Sự biến thiên hoạt độ chung và hoạt độ riêng của

phytase-PB theo các tác nhân tủa khác nhau 81

Hình 3.14: Kết tủa phytase-PAI và phytase-PB với các tác nhân tủa

khác nhau được hòa vào đệm Natri acetate 0,2M, pH 5,5 82

Hình 3.15: Chế phẩm phytase-PAI và phytase-PB thu được sau khi tủa

Hình 3.18: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và

Hình 3.19: Sự biến thiên % hoạt độ chung/Hđmax của phytase-PAI và

phytase-PB theo các nhiệt độ khác nhau của phản ứng 93

Hình 3.22: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PAI đã loại muối 96

Hình 3.23: Sắc ký đồ của enzyme phytase-PB đã loại muối 97

Hình 3.24: SDS-PAGE của phytase-PAI và phytase-PB 100

Hình 3.25: Đường chuẩn trọng lượng phân tử của các protein chuẩn 103

Hình 3.26: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PAI 106

Hình 3.27: Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk của phytase-PB 107

MỞ ĐẦU

Photpho là nguyên tố quan trọng trong cơ thể sống Nó là một chất dinh dưỡng thiết yếu trong nhiều chu trình trao đổi chất Photpho cùng với canxi cấu tạo nên xương, răng, cùng với protein, lipid và glucid để tham gia cấu tạo tế bào đặc biệt là màng tế bào Photpho vô cơ ở dạng photphat (PO4)3-, đóng một vai trò quan trọng trong các phân tử sinh học như ADN, ARN, trong đó nó tạo thành một phần trong cấu trúc của các phân tử này Các tế bào sống cũng sử dụng photphat để vận chuyển năng lượng tế bào thông qua adenosine triphosphat (ATP) ATP còn là yếu tố quan trọng trong sự photphat hóa, một dạng điều chỉnh quan trọng trong các tế bào Photpho cũng là một nhân tố khoáng chính cần cho gia súc, gia cầm Nó tham gia trong các photpholipid, là thành phần được các động vật dùng để làm cứng xương của chúng

Khoảng 50 – 80% tổng lượng photpho tự nhiên hiện diện trong thực vật, là nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc, gia cầm Nó ở dạng liên kết với các chất khoáng, protein hình thành phức hợp không hòa tan Khoảng 2/3 lượng photpho tổng nằm trong các loại ngủ cốc, cây họ đậu, và hạt cây có dầu hiện diện như là photphophytat và chỉ 1/3 lượng photphophytate được hấp thu và cân bằng được bài tiết

Nitơ và photpho được xem là có khả năng gây hại đến chất lượng đất và nước Lượng photphophytate có trong hạt ngũ cốc và các loại đậu hay hạt cây có dầu không được các loài động vật hấp thu và đã thải ra ngoài môi trường qua phân của chúng Vì vậy đã gây nên sự ô nhiễm phytate cho môi trường đất và nước

Phytase là một enzyme có khả năng phân giải phytate photpho để phóng thích photpho vô cơ, cung cấp lượng photpho cho cơ thể động vật Do đó nó cũng có tiềm năng tác động để làm giảm sự ô nhiễm môi trường, bởi việc giảm sự bài tiết phytate

và nitơ trong phân Vì vậy, giá trị thương mại hóa của phytase vi sinh vật được ứng dụng để bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm được chú ý nhiều hơn trong những năm gần đây Tuy nhiên nguồn phytase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều khuyết điểm như hoạt độ thấp, ít có khả năng chịu nhiệt,… Do đó người ta đã bắt

đầu nghiên cứu để có thể thu nhận được nguồn phytase có hoạt độ cao hơn, có khả năng chịu nhiệt, pH, và các đặc tính khác, đó là nguồn phytase tái tổ hợp Trong

luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thu nhận và tinh sạch phytase tái tổ hợp từ

nấm men Pichia pastoris GS115 và xác định các đặc tính của enzyme này

Chương 1:

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

1.1 Acid phytic (phytin)

Acid phytic là dạng chính dự trữ photpho trong các loại hạt ngũ cốc, các loại đậu, hạt cây có dầu Nó đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý và cũng ảnh hưởng đáng kể đến chức năng, đặc tính dinh dưỡng của các loại hạt ngũ cốc, các loại đậu

và hạt cây có dầu, do sự hình thành phức hợp với protein và các chất khoáng.[23] Dạng đúng của acid phytic là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexadihydrogenphosphate (IUPAC-IUB, 1977) Muối của acid phytic là phytate Chính xác hơn, phytate là dạng phức của Natri, Magiê, Canxi với acid phytic, tồn tại như dạng gọng kìm trong các hạt ngũ cốc, các loại đậu và hạt cây có dầu.[31]

1.1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic

Cấu trúc của acid phytic được tìm ra bằng phương pháp phân tích ray (Blank và cộng sự, 1971) và 31P-NMR ( Johnson và Tate, 1969) Johnson

X-và Tate đề nghị rằng nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn các nhóm photphat còn lại nằm ở vị trí bất đối xứng Ngược lại, theo Blank và cộng sự, (1971) thì kết luận rằng các nhóm photphat 1,3,4,5 và 6 nằm ở vị trí đối xứng qua trục, còn nhóm photphat số 2 nằm ở vị trí bất đối xứng Đối với

dữ liệu của Costello và cộng sự, (1976) thì ủng hộ thông tin của Johnson và Tate, (1969) đã đề nghị

Axit phytic có công thức tổng quát của là C6H8O24P6, tồn tại ở hai dạng cấu trúc lập thể khác nhau, cấu trúc đối xứng và bất đối xứng [31]

Hình 1.1 Cấu trúc của axit phytic [51]

Hình 1.2 Phức phytate trong tự nhiên [49]

Axit phytic có ái lực mạnh với các cation đa hóa trị và các protein tích điện dương vì nó tồn tại dưới dạng phân tử tích điện âm mạnh trong phổ pH rộng Chính vì vậy mà acid phytic liên kết với các ion Mg2+, Ca2+, protein tạo thành dạng phytate trong tự nhiên.[45]

1.1.2 Chức năng sinh lý của acid phytic

Acid phytic có trong ngũ cốc, các loại đậu và hạt cây có dầu, có nhiều vai trò về sinh lý và đảm nhiệm nhiều chức năng như:[23]

- Là nguồn dự trữ photpho

- Là nguồn dự trữ năng lượng

- Như một nguồn cation

- Là nguồn myo-inositol

- Khởi đầu cho quá trình ngủ của hạt

Ngoài ra, acid phytic có lẽ còn nắm giữ nhiều chức năng khác nữa mà chưa được biết đến, trong hạt ở thực vật (Reddy và cộng sự, 1989) Vai trò của

acid phytic như một chất chống oxy hóa tự nhiên trong suốt quá trình ngủ của hạt (được đề nghị bởi Graf và cộng sự, 1987) Đặc tính chống ôxy hóa của acid phytic dựa vào sự giả định rằng acid phytic thực sự ngăn chặn sự hình thành hydroxit sắt chuyển động từ rễ Sự hiện diện của acid phytic được xem là có tác động đến việc chống lại sự tăng trưởng của tế bào ung thư trong bệnh ung thư biểu mô vú và ruột kết ở các loài động vật (Dvorakova, 1998)

Những nghiên cứu ở cuối thập niên 80 và đầu những năm thập niên 90,

đã xác định inositol photphat giữ vai trò trung gian trong sự vận chuyển của các chất khoáng vào trong tế bào Vai trò của chúng đặc biệt là inositol 3-photphat trong sự truyền tín hiệu và sự điều chỉnh chức năng của các tế bào thực vật và động vật Vấn đề này được nhiều nhà nghiên cứu chú ý đến (Wodzinski and Ullah,1996).[44]

1.1.3 Sự tạo thành, phân bố và hàm lượng của acid phytic trong tự nhiên

Acid phytic được tìm thấy đầu tiên như là các muối của các ion dương hóa trị 1 và 2 (như muối kali, magiê trong gạo và muối canxi, magiê trong đậu nành, trong những vùng riêng rẽ của các loại hạt ngũ cốc, cây họ đậu) Nó tích lũy trong các loại ngũ cốc, các loại đậu trong suốt quá trình chín của hạt, cùng với các cơ chất dự trữ khác như tinh bột và chất béo Trong các hạt ngũ cốc và hạt đậu acid phytic tích lũy trong các hạt nhỏ alơron và các tinh thể hình cầu tách biệt (Reddy và cộng sự, 1989)

Nội nhũ của phôi lúa mì và lúa thì hầu như không có phytate Nó dường như tập trung trong mầm và các lớp hạt alơron của các tế bào phôi

Ferguson và Bollard, (1976) đã tìm ra rằng 99% phytat trong đậu là nằm trong các lớp tế bào mầm

Lượng phytate lớn nhất ở ngũ cốc được tìm thấy là ở ngô (0.33-2.22) và

ở các loại đậu là ở đậu dolique (5.92-9.15), (Reddy và cộng sự, 1989)

.1.4 Tác động kháng dưỡng của acid phytic

Acid phytic được xem là có tác động kháng dưỡng mạnh (Pallanf và Rinbach, 1996) Tác động này dựa trên cấu trúc phân tử bất thường của acid phytic

Ở trường hợp sự thủy phân hoàn toàn, 6 nhóm photphat của acid phytic

sẽ mang tất cả 12 chất mang tích điện âm Vì vậy acid phytic có khả năng gắn các ion dương có hóa trị 1,2 và 3 hình thành các phức không tan (Reddy và cộng sự, 1989) Sự hình thành các phức hợp giữa acid phytic và khoáng không hòa tan trong vùng ruột đã làm ngăn chặn sự hấp thu khoáng (Davies, 1982) Điều này làm giảm lợi ích sinh học của các chất khoáng cần thiết (Davies, 1982), như kẽm hiện diện như một nguyên tố dạng vết có lợi ích sinh học thì hầu như bị ảnh hưởng bởi acid phytic Rimbach và Pallauf, 1992 cho rằng việc chia nhỏ sự bổ sung acid phytic có ảnh hưởng tiêu cực rõ ràng lên sự hấp thu ion Zn2+ và từ đó ảnh hưởng đến tỷ lệ tăng trưởng và phát triển của động vật, thực vật

Ngoài việc hình thành các phức hợp với protein và các chất khoáng, acid phytic còn tương tác với các enzyme như trypsin, pepsin, α-amylase và ß-galactosidase, kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzyme tiêu hóa quan trọng này Dẫn đến sự kém tiêu hóa, làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển ở động vật (Dehpande and Cheryan, (1984), Singh and Kricorian, (1982), Inagawa và cộng sự, 1987)

1.2 Enzyme phytase và phytase của Aspergillus ficuum

1.2.1 Định nghĩa

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC 3.1.3.8

và EC 3.1.3.26), được tìm thấy đầu tiên ở vi sinh vật và thực vật, là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết phosphoester của acid phytic (myo-inositol hexakisphosphate), nguồn dự trữ chính của photpho trong các hạt ở thực vật,

để phóng thích photpho vô cơ.[24],[45]

1.2.2 Lịch sử các nghiên cứu về phytase [45]

1903 – Posternak: mô tả về acid phytic

1907 – Suzuki và cộng sự: mô tả và tách chiết phytase từ cám gạo

1911 – Dox và Golden: tìm được phytase trong aspergilli

1913 – Plimmer và Anderson: xác định được các phức hợp photpho hữu

cơ trong nguyên liệu thực vật

1914 – Anderson: xác định được cấu trúc của acid phytic

1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính phytase

1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử nghiệm thương mại hóa phytase

1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic

1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính

phytase Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A ficuum và

đã thu nhận gen phyA và phyB có hiệu suất cao nhất so với các báo

cáo trước đó, trong chủng có biến đổi không phải do di truyền

1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A niger

NRRL3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm lượng nhất định

1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía nam, bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về phytase

1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino

acid của gen phy A thu nhận từ A niger NRRL 3135

1990 – Simons và cộng sự: chứng minh hiệu quả của phytase đối với gà

và heo

1993 – Ehrlich và cộng sự: tạo dòng gen phy B, mã hóa cho enzyme

acid phosphatase pH 6.0, từ A niger NRRL 3135

1993 – Pen và cộng sự: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào trong tobacco

1994 – Ullah và cộng sự: tạo dòng gen, từ A niger NRRL 3135, mã hóa

cho enzyme acid phosphatase pH 6.0

1993 – Beudeker và Pen: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho phytase, vào trong Canoda (Brassica napus)

- EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên theo hệ

thống là myo-inositol hexakisphosphat-3-phosphohydrolase, là enzyme thủy phân liên kết ester tại vị trí số 3 của myo-inositol hexakisphosphate thành D-myo-Ins-1,2,4,5,6-pentakisphosphate và orthophosphate.[30]

Phytase của Aspergillus ficuum thuộc nhóm enzyme này [40]

- EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên theo hệ

thống là myo-inositol hexakisphosphate-6-phosphohydrolase là enzyme thủy phân liên kết ester tại vị trí số 6 của myo-inositol hexakisphosphate thành D-myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphate và orthophosphate Các

liên kết ester còn lại trong cơ chất được thủy phân ở các tỷ lệ khác nhau.[30]

1.2.3.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin

Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin thì enzyme phytase được chia thành hai lớp:[32]

- Histidine acid phytase – HAP (phytaseA, phytaseB, phytaseC)

- Alkaline phytase (PhytaseD)

Tất cả các thành viên của nhóm HAPs đều có trung tâm hoạt động là RHGXRXP

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme phytase

hơn như chim, bò sát, cá và rùa biển (Rapoport và cộng sự, 1941) Năm

1937, Patwardhan là người đầu tiên ghi nhận có sự thủy giải phytate trong ruột chuột Hoạt động của phytase cũng được quan sát ở ruột heo, cừu và bò (Spitzer và Phillips, 1972) Động vật nhai lại có khả năng tiêu hóa phytate hoàn toàn nhờ hệ vi sinh vật có trong ruột, Photphate vô cơ giải phóng ra sẽ được vi sinh vật và cả động vật chủ sử dụng.[22]

Phytase được tìm thấy có nhiều ở động vật có dạ dày đơn (Bitar và Reinhold, 1972; Copper và Gowing, 1983, Yang và cộng sự,

1991, Chi và cộng sự, 1999) Tuy nhiên, phytase trong đường ruột là phytase nội bào nên không đóng vai trò quan trọng đối với sự tiêu hóa phytate trong thức ăn ở các loài động vật này (Williams và Taylor, 1985) Phytase trong ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase trong ruột chuột Ruột non người bình thường có khả năng tạo

ra một lượng nhỏ phytase (Igbal và cộng sự, 1994) nên không có vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa phytate Nhưng đó là yếu tố quan trọng trong sự thủy giải phytate (Frolich, 1990) [43]

Craxon và cộng sự (1997) đã tạo dòng và biểu hiện multiple inositol polyphosphate phosphatase (MIPP) gan chuột có hoạt tính phytase mRNA của MIPP có trong tất cả các mô được nghiên cứu ở chuột nhưng biểu hiện mạnh nhất là ở cật và gan Một enzyme giống

phytase cũng được tìm thấy ở Paramecium (Freund và cộng sự, 1992)

1.2.4.2 Phytase từ thực vật

Phytase được tìm thấy trong cám lúa mì, các loại hạt, trong các

cơ quan dự trữ của thực vật như khoai tây, lá cây thuốc lá, trong cây bắp (Huebel và Beck, 1996), gạo ( Hayakawa, 1989; Maugenest, 1999), lúa

mì (Nagai và Nakano Funahashi, 1962,1999), và cây đậu tương (Hamada, 1996)… Những loại hạt có hoạt tính phytase cao là lúa mì, cám lúa mì, lúa mạch, còn những loại hạt có hoạt tính phytase thấp là bắp và hạt đậu đã xử lý nhiệt (Eeckout và cộng sự, 1994, Schroder và cộng sự, 1996) Trong số 285 mẫu của 51 loại thức ăn mà Eeckout khảosát chỉ có 13 mẫu có hoạt tính phytase >100 U/kg; tất cả những mẫu khác có rất ít hoặc không thấy có phytase.[44] (xem bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các loại thức ăn có hoạt độ phytase trên 100 đơn vị /kg [44], [45]

Ngũ cốc Hoạt tính

phytase (U/kg)

Phụ phẩm lúa mì Hoạt tính

phytase (U/kg)

Lúa mì 1193 Bột mì làm thức ăn gia súc 3305

Nhiệt độ tối ưu của phytase thực vật từ 45oC – 60oC (Wodzinski và Ullah, 1996) Phytase thực vật bị bất hoạt một phần hay hoàn toàn khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao (Ravindran và cộng sự, 1995) Phillippy, (1999), cũng chứng minh rằng phytase lúa mì mất hoạt tính đáng kể khi có mặt pepsin Khả năng chịu nhiệt của phytase thực vật không tốt và đây là trở ngại đầu tiên trong chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm

1.2.4.3 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật [23],[25],[28],[43]

Trong thiên nhiên phytase có thể được tìm thấy trong động vật, thực vật, và vi sinh vật Tuy nhiên, hầu hết công trình khoa học đều làm trên phytase vi sinh vật, đặc biệt là có nguồn gốc từ nấm sợi như

Aspergillus ficuum (Gibson, 1987), A fumigatus (Pasamontes, 1997) hay Mucor piriformis (Howson và Davis, 1983), Rhizopus oligosporus (Casey và Walsh, 2004), và Cladosporium species

v Phytase nấm mốc nhìn chung được chú ý nhiều hơn do năng suất cao, khả năng chịu acid trong thực phẩm (Kim và cộng sự, 1998) Shieh và Ware, (1968), đã phân lập hơn 2000 vi sinh vật từ đất

có khả năng sinh phytase Hầu hết các vi sinh vật chỉ sản xuất phytase nội bào, chỉ có 30 vi sinh vật sinh phytase ngoại bào, tất cả đều là nấm

sợi: 28 loài thuộc Aspergillus, 2 loài thuộc Penicillium và 1 loài thuộc Mucor Trong 28 loài thuộc giống Aspergllus, có tới 21 chủng là A niger Trong khảo sát của Howson và Davis năm 1983, 84 nấm mốc

thuộc 25 loài có khả năng sinh enzyme phân hủy phytate ngoại bào,

Aspergillus ficuum NRRL 3135 có hoạt tính mạnh nhất Nấm mốc chịu nhiệt như Thermomyces lanuginosus và Sporotrichum thermophile sinh

phytase lần lượt ở 65oC và 45oC (Berka và cộng sự, (1998), Ghosh, (1997)

v Phytase cũng được tìm thấy trong một số vi khuẩn như

Aerobacter aerogenes (Greaves và cộng sự, 1967), Pseudomonas sp (Irving và Cosgrove, 1971), Bacillus subtilis (Powar và Jagannathan, 1982), Klebsiella sp (Shah và Parekh, 1990), B subtilis (Shimizu, 1992), Escherichia coli (Greiner và cộng sự, 1993), Enterobacter sp 4 (Yoon và cộng sự, 1996) và Bacillus sp DS 11 (sau đó được xác định là

B amyloliquefaciens) (Kim và cộng sự, 1998a) Trong đó, chỉ có giống Bacillus và Enterobacter sản xuất phytase ngoại bào

v Một số nấm men Saccharomyces cerevisiae, Cvàida tropicalis, Torulopsis cvàida, Debaryomyces castelii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii cũng

sinh phytase (Nayini và Markakis, 1984; Lambrechts và cộng sự, 1992,

Mochizuki và Takahashi, 1999)

So với phytase thực vật, phytase vi sinh vật có hoạt tính cao hơn Hoạt tính phytase thực vật giảm đáng kể ở pH vượt khỏi khoảng

pH từ 4,0 – 7,5, trong khi phần lớn các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật

chịu được ở pH trên 8,0 và dưới 3,0 Ví dụ như phytase từ Escherichia coli không mất hoạt tính ở pH = 2,0, pH = 10,0 và khi đặt ở nhiệt độ

4oC trong 2 giờ Phần lớn phytase thực vật bị bất hoạt không thuận nghịch khi nhiệt độ trên 70oC chỉ trong vài phút, ngược lại, hầu hết các enzyme vi sinh vật giữ được hoạt tính đáng kể khi ủ trong thời gian dài

hơn Phytase của Pichia anomala chịu được 70o

C trong 30 giờ mà hoàn toàn không bị mất hoạt tính [23]

Bảng 1.2: Đặc tính phytase được thu nhận từ các nguồn khác nhau: [41], [43]

Nguồn phytase Trọng lượng

phân tử (KDa)

Nhiệt độ tối

ưu (oC) (topt)

pH tối ưu (pHopt)

Vi khuẩn B.subtilis

E.coli Enterrobacter K.aerogenes Pseudomonas

36-38

42

- 10-13,700

-

60

55

50 60-70

-

6,0-6,5[6,25] 4,5 7,0-7,5 4,5;5,2 [3,7] 5,5 Nấm mốc A.ficuum

A.niger A.terreus A.oryzae R.oligosporus

85-100

200

214 120-140

Thực vật Hạt Canosa

Bắp Đậu nành Lúa mì Spenta Cám lúa mì

Bê Chuột

-

- 70-90

-

-

-

8,2 8,7 7,0; 7,5-7,8 (-): chưa xác định

1.2.5 Đặc tính sinh hóa

1.2.5.1 Nhiệt độ và độ pH tối ưu

Phytase thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có nhiệt độ hoạt động tối ưu khác nhau Nhìn chung, nhiệt độ thích hợp của phytase là từ 45-60oC, nhất là ở khoảng 50-55oC

Một số phytase có nhiệt độ tối ưu (topt) khá cao, như phytase

của Saccharomyces scastellii (topt =77oC) và phytase của Aspergillus

các loài này có lẽ liên quan đến cấu trúc phân tử của chúng Cả phytase

của S scastellii và của A terreus đều là enzyme đa phân và có khối

lượng phân tử cao.[44]

Năm 1998, Wyss và cộng sự, nghiên cứu về sự ổn nhiệt của

phytase từ Aspergillus fumigatus, A niger (pH tối ưu: 2.5 và 5.0), A niger (pH tối ưu 2.5) và thấy rằng:

+ Phytase của A fumigatus không chịu được nhiệt độ cao,

nhưng có khả năng phục hồi hoàn toàn cấu trúc siêu phân tử và hoạt tính sau khi bị biến tính ở 90oC

+ Phytase của A niger (pH tối ưu: 2,5 và 5,0), không chịu

nhiệt và cũng không hồi tính sau khi ủ ở nhiệt độ cao, ngay cả khi ở nhiệt độ 50-55oC ( là nhiệt độ tối ưu của những phytase khác), hoạt tính

bị mất đến 70-80%

+ Phytase của A niger (pH tối ưu 2,5) có tính ổn nhiệt cao, ở

80oC vẫn còn hoạt tính, đến 90oC thì mất hoạt tính và cũng không có khả năng hồi tính

Cũng như nhiệt độ tối ưu, phytase từ các nguồn khác nhau sẽ

có pH tối ưu rất khác nhau Đa số các phytase cho hoạt tính phân giải phytate cao nhất trong dãy pH acid và thông thường các phytase có một

độ pH tối ưu riêng Hầu hết phytase vi sinh vật, đặc biệt là phytase nấm mốc có pH tối ưu từ 4,5-5,6 Một số phytase vi khuẩn, đặc biệt là

Bacillus có pH tối ưu trong khoảng 6,5-7,5 Dãy pH tối ưu của phytase

thực vật từ 4,0-7,5, nhưng đa số nằm trong khoảng 4,0-5,6.[25]

Đối với phytase của Aspergillus ficuum, phyA có pH tối ưu là

2,5; 5,0, nhiệt độ tối ưu là 58oC và phyB có pH tối ưu là 2,5, nhiệt độ tối

ưu là 63oC.[42]

Những nghiên cứu hiện nay cho thấy, có thể dùng kỹ thuật protein để làm tăng tính ổn nhiệt của phytase như thay thể protein và tạo cầu nối disulfide, hay dùng kỹ thuật sinh học phân tử để tạo dòng

phytase từ những nấm chịu nhiệt như M thermophila

1.2.5.2 Trọng lượng phân tử

Hầu hết các phytase được biết cho tới nay đều ở dạng đơn phân bao gồm phytase nấm mốc (Wyss và cộng sự, 1999a, Ullah và Gibson,

1987, Dvorakova và cộng sự, 1997), phytase E coli và K terrigena

phytases (Greiner và cộng sự, 1993; Greiner và cộng sự, 1997), và

phytase của B subtilis (Shimizu, 1992) Tuy nhiên, một số phytase

thực vật và động vật bao gồm nhiều tiểu phần Lượng phytase hạt bắp tích trữ trong quá trình nảy mầm là một enzyme bao gồm hai tiểu phần nặng 38 kDa (Laboure và cộng sự, 1993) Phytase tinh chế từ ruột chuột điện di trên SDS-PAGE có trọng lượng phân tử khoảng 70 và 90 kDa (Yang và cộng sự, 1991b) Nhưng chỉ có phần 90 kDa có hoạt tính đối với acid phytic Như vậy, sẽ có hai enzyme khác nhau (alkaline phosphatase và phytase) Enzyme inositol hexakisphosphate dephosphorylase từ Paramecium có cấu trúc gồm sáu đơn phân (Freund

và cộng sự, 1992)

PhyA là đơn phân, PhyB là tứ phân Cả hai loại này thường được tách chiết thu nhận từ nấm sợi (Aspergillus niger) hay nấm men (Saccharomyces cerevisia, S pombe), trọng lượng phân tử từ 62 – 128 kDa PhyC thường được thu nhận từ E.coli Trọng lượng phân tử khoảng 42 – 45 kDa PhyD thường được thu nhận từ Bacillus hay thực

vật, trọng lượng phân tử khoảng 38 – 44 kDa.[40],[44]

Bảng 1.3: Trọng lượng phân tử của phytase từ các nguồn khác nhau: [42], [44]

Nguồn phytase Trọng lượng M

490 36-38 10-13, 700

Hạt ngô Hạt lúa mì Cám mì Đậu nành

Cơ ruột của chuột

76

68

47

60 70-90

Nhìn vào dữ liệu ở bảng 1.3, phytase của Aspergillus ficuum

có trong lượng phân tử từ 85-100kD, đây cũng chính là trọng lượng

phân tử của phyA từ A ficuum Còn phytase từ phyB của A ficuum thì

có trọng lượng phân tử là khoảng 64-68kD.[42]

1.2.5.3 Cơ chất

Phytase có cơ chất đặc trưng rộng: acid phytic, phytate và các chất có cấu trúc tương tự như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenylphosphate, fructose-1,6-bisphosphate, glucose-6-phosphate, α và β-glycerolphosphate, 3-phosphoglycerate Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối với acid phytic như phytase Bacillus (Powar và Jagannathan, 1982, Shimizu, 1992) và alkaline phytase từ phấn hoa lily

(Barrientos và cộng sự, 1994)

Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase phân thành hai lớp, phytase

với dãy cơ chất đặc trưng rộng (ví dụ như A fumigatus, M thermophila,

E nidulans) và phytase chỉ đặc hiệu với acid phytic (như A niger, A terrus, E coli).[24]

Phytase có cơ chất rộng có hoạt độ đối với acid phytic thấp (23 tới 43 U/mg) Ngược lại, phytase có cơ chất đặc hiệu là acid phytic có hoạt độ cao hơn, 103-811 U/mg.[26]

Phytase có cơ chất rộng phân giải acid phytic thành

myo-inositol monophosphat và myo-myo-inositol Trái lại, phytase có cơ chất hẹp

đặc hiệu với inositol phosphate, có hoạt tính thấp đối với inositol-1-monophosphate, do vậy nó chỉ tạo thành sản phẩm myo-

myo-inositol tri hay bisphosphate.[44]

1.2.5.4 Thành phần amino acid của phyA và phyB trong A ficuum:

Gen phyA có 467 acid amin, gồm một chuỗi peptid đơn có

18-19 acid amin ở đầu N 102 cặp bazơ hiện diện ở đầu 5' của gen Trọng lượng phân tử của protein trưởng thành được dự đoán là khoảng 48,8kD

và 10 vị trí N-glycosylation được tìm thấy trong chuỗi polypeptid.[44]

Gen phyB có chiều dài là 1605 cặp bazơ với 4 đoạn exon và

protein gồm 479 acid amin.[44]

1.2.6 Đặc điểm xúc tác của enzyme phytase

Trung tâm hoạt động

Các enzyme nói chung khi xúc tác phản ứng, không phải toàn bộ enzyme tham gia mà chỉ có một bộ phận nhỏ của enzyme chịu trách nhiệm tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận này là nơi tập trung của một số nhóm chức được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Hoạt tính của phytase cũng

do trung tâm hoạt động của nó quyết định

Trung tâm hoạt động của phytase (histidin acid phosphatase) là một đoạn trình tự acid amin được ký hiệu là: RHGXRXP ( gần đầu N-terminus), trong đó:[24]

R: Arginine H: Histidin G: Glycin P: Prolin

X: acid amin bất kỳ

Trình tự này được bảo tồn trong phytase của nấm mốc và vi khuẩn

E.coli Phân tử của phytase nấm mốc và E.coli còn có một vùng bảo tồn gần

đầu C, motif HD (H: histidin, D: acid aspartic) Phytase có cả hai vùng này thường có khối lượng phân tử lớn.[24]

Enzyme phytase tấn công vào nhóm phosphate đầu tiên và phân giải

liên kết monophosphoester, giải phóng photpho vô cơ và myo-inositol

pentakisphosphate Sau đó, năm nhóm photphat còn lại được tiếp tục được giải phóng khỏi phytate nhờ phytase hoặc những enzyme phosphatase không đặc hiệu khác vốn hiện diện với số lượng lớn trong đường tiêu hóa.[24]

Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của phytase [48]

Hình 1.4: Sự thủy phân acid phytic thành inositol và acid

phosphoric bằng phytase [44]

Phản ứng có thể được khái quát như sau:

phosphoric.[44]

Hầu hết các phytase được nghiên cứu đều tuân theo động học

Michaelis-Menten, ngoại trừ phytase của M.thermophia và E.nidulans

Ở điều kiện tiêu chuẩn, chỉ có một tỉ lệ phản ứng từ myo-inositol

hexakisphosphate thành pentakisphosphate được xác định

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

1.2.7.1 Ion kim loại

Ion kim loại cho thấy có khả năng điều chỉnh hoạt tính phytase Tuy nhiên, khó xác định ảnh hưởng của các kim loại, do chúng liên kết trực tiếp với enzyme hoặc liên kết với acid phytic tạo thành hợp chất khó tan, vì vậy, làm giảm độ hoạt động của cơ chất hoặc enzyme

Ảnh hưởng của các ion kim loại không giống nhau đối với mỗi

phytase Hoạt tính của phytase A fumigatus bị giảm 50% do ảnh hưởng

của EDTA Nhưng EDTA không ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase

có nguồn gốc từ A niger, A terrus, E nidulans.[26]

1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho:

Sự thủy phân của phytase tỉ lệ nghịch với lượng canxi Nói rộng ra, tỉ lệ canxi/photpho ức chế hoạt tính và làm giảm hiệu lực của phytase Trong thức ăn chế biến, phytase bổ sung vào không thúc đẩy

sự sử dụng phospho-phytate khi có canxi với nồng độ 1% Do đó, trong thức ăn có phytase, nên giảm lượng canxi còn khoảng 0.6% tới 0.75%.[26]

1.2.7.3 Nồng độ cơ chất:

Nồng độ cơ chất cao, dẫn đến nhóm photphat có thể tác động cục bộ vào trung tâm xúc tác của enzyme Điều này làm ức chế sự chuyển của phức hợp enzyme-cơ chất thành enzyme và sản phẩm (Ullah và Phillippy, 1994) Mặt khác sự ức chế còn dẫn tới sự hình thành phức hợp phytate-protein khó tan

Nồng độ cơ chất khoảng 300µmol ức chế các enzyme giống phytase có nguồn gốc từ Paramecium (Freund và cộng sự, 1992)

Phytase từ Kleibsiella sp và Rhizopus oligosus bị ức chế khi nồng độ

cơ chất cao (Shaa và Parekh, 1990; Sutardi và Buckle, 1998) Phytase nấm mốc bị ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1mM (Ullah, 1998).[43],[44]

1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase:

và cộng sự, 1998) trong khi Pseudomonas sp tăng trưởng và sản xuất

tốt trên myo-inositol (0.2%)(Irving và Cosgrove, 1971)

Sự tổng hợp phytase không tăng khi có sodium phytate trong

môi trường với nồng độ 1mM Tuy nhiên, Klebsiella aerogenes sinh phytase nhiều nhất khi nguồn cacbon là sodium phytate (2%).[40]

Đối với nấm mốc, malt và dịch chiết nấm men được dùng để sản xuất phytase (Shieh và Ware, 1968) Khi dùng cacbon đơn giản là glucose hay sucrose, các tơ nấm kết lại với nhau làm giảm năng suất

phytase của A niger NRRL 3135 Sản xuất phytase từ Aspergillus ficuum trên môi trường rắn, sử dụng cơ chất là bột Canola có bổ sung

glucose 5.2% làm gia tăng lượng phytase sinh ra.[40]

1.2.8.2 Nguồn nitơ [43]

Nguồn nitơ trong môi trường là một yếu tố cũng quan trọng không kém, nó ảnh hưởng sự tăng trưởng và quá trình sinh tổng hợp enzyme Trong sản xuất phytase, người ta thường dùng nguồn nitơ hữu

cơ như peptone Ví dụ như peptone (1%) là nguồn nitơ khi lên men

phytase từ Aerobacter aerogenes (Greaves và cộng sự, 1967), và K oxytoca dùng dịch chiết nấm men (1%) (Jareonkitmongkol và cộng sự,

1997) Nguồn nitơ vô cơ như amonium sulphate (0.1%) dùng sản xuất

phytase từ Pseudomonas sp (Irving và Cosgrove, 1971), Enterobacter

sp 4 (Yoon và cộng sự, 1996), và S castellii (Lambrechts và cộng sự, 1992) Sản xuất phytase từ B subtilis, Powar và Jagannathan (1967)

dùng N2 là nguồn nitơ Đối với A adeninivorans, nguồn nitơ là dịch

chiết nấm men (1%) và peptone (1%) (Sano và cộng sự, 1999)

1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng :

Bên cạnh nguồn cacbon và nitơ, một vài vi sinh vật cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng và vitamin cho sự tăng trưởng và sản xuất phytase Sản xuất phytase từ nấm men, môi trường sàng lọc gồm

có vitamin và các nguyên tố vi lượng (Galzy, 1964; Segueilha và cộng

sự, 1992) Đối với Bacillus subtilis (Powar và Jagannathan, 1967), Bacillus sp DS11 (Kim và cộng sự., 1998), E coli (Greiner và cộng sự,

1993), cũng như nấm mốc như A niger ATCC 9142 và A ficuum

NRRL 3135 (Shieh và Ware, 1968), sự sản xuất phytase không cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng.[28]

1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho:

Sự tổng hợp phytase chịu ảnh hưởng bởi nồng độ photphat là một hiện tượng chung, được quan sát ở các loài nấm mốc và nấm men sinh phytase Phytase được sản xuất khi photphat vô cơ bắt đầu cạn kiệt,

sự giới hạn photphat vô cơ trong môi trường sẽ cảm ứng sinh phytase, tuy nhiên, bị phụ thuộc vào tổng lượng cacbon có mặt trong môi trường

Aspergillus ficuum NRRL 3135 sản xuất phytase có hoạt tính nhiều

nhất khi nồng độ photphat vô cơ thấp hơn 0.004% (w/ V) trong môi trường chứa 8% (w/ V) bột bắp.[27]

Hàm lượng photpho trong ngũ cốc cao làm kìm hãm khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm mốc Còn khi nồng độ photpho trong môi trường ở mức thấp, sư tăng trưởng của sợi nấm tốt và sự sản xuất phytase đạt tối đa Khi tăng lượng photphat vào môi trường, nấm mốc tăng trưởng mạnh nhưng lượng phytase sinh ra giảm đáng kể

1.2.9 Ứng dụng của enzyme phytase

1.2.9.1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm [40],[41]

Phytate chiếm từ 60- 80% photpho thực vật, nhưng cơ thể không hấp thu được lượng phytate này vì không có phytase, kể cả các chất dinh dưỡng khoáng cũng không được hấp thu Phytase được bổ sung trong thức ăn dành cho gia cầm, lợn và cá có tác dụng cải thiện hiệu quả sử dụng photpho, khoáng chất, acid amin và năng lượng, giúp cho cơ thể động vật hấp thu tốt lượng phytate trong nguồn thức ăn.[40]

Có thể dùng các phytase có nguồn gốc khác nhau để bổ sung vào thức ăn động vật Tuy nhiên, phytase thực vật thì hạn chế hơn do hàm lượng biến thiên, bị bất hoạt ở nhiệt độ hơn 70°C (Pointillart,

1988) Đồng thời, hiệu quả sinh học của phytase ngũ cốc chỉ 40% so

với phytase vi sinh vật từ loài Aspergillus (Zimmermann, 2002)

Phytase sản xuất bởi vi sinh vật phân hủy phytate thực vật hầu như hoàn toàn đối với động vật nhai lại (Rodehutscord, 2001) Mặt khác, bổ sung phytase vi sinh vật thay cho photpho vô cơ, vào thức ăn còn làm giảm mạnh sự bài tiết photpho của động vật dạ dày đơn Tùy vào thực đơn, giống, và mức bổ sung phytase, sự bài tiết photpho có thể giảm từ 25 đến 50% (Kornegay, 1999)

Bổ sung phytase vi sinh vật vào thực đơn của động vật không nhai lại cũng cải thiện tính hiệu quả của các ion Ca2+, Mg2+ (Wall và cộng sự, 1991), và vài nguyên tố vi lượng như kẽm (Thiel và Weigvà, 1992), đồng (Adeola, 1999), sắt (Pallauf và cộng sự, 1992), và mangan (Mohanna và Nys, 1999)

Phytase vi sinh vật cũng có thể tăng cường tiêu hóa protein do phytase phân hủy các phức hợp phytate-protein, phytate-acid amin và phức hợp phytate-khoáng chất-protein Hơn nữa, phytate ức chế enzyme phân hủy protein (Caldwell, 1992), và ức chế amylase (Deshpvàe và Cheryan, 1984)

Ngày nay, phytase vi sinh vật được sản xuất trên qui mô lớn với chi phí thấp và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Chế biến và sản xuất thực phẩm cho con người cũng là một lĩnh vực ứng dụng của phytase Phytase làm giảm hoàn toàn acid phytic trong quá trình sản xuất các thức ăn từ bột gạo, lúa mì, bắp, yến mạch, cây lúa miến, hỗn hợp bột lúa mì-bột đậu nành (Hurrell, 2003) Thí nghiệm trên ngũ cốc porridge có mức phytate có sẵn nằm trong khoảng

từ 0.12% (lúa mì porridge) và 0.89% (lúa miến porridge) Sau khi xử lý

với Phytase, hàm lượng acid phytic giảm còn ≤ 0.002 % Đồng thời, sự hấp thu sắt tăng đáng kể.[40]

Phytase nấm được bổ sung trong sản xuất bánh mì có tác dụng giảm thời gian lên men mà không ảnh hưởng đến độ pH của bột nhồi bánh, làm tăng thể tích bánh mì và sự cải thiện kết cấu vụn bánh (Haros, 2001)

1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-inositol

phosphate[23],[28],[40]

Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay Trong nghiên cứu, Svàberg (1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5) có tác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt Thêm 10mg photpho như IP5 làm giảm sự hấp thu sắt đến 39% IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được cho cùng với IP5 và IP6 Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu, nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3

Mặt khác, các ester myo- inositol có ít Photpho (mono, bis, tris,

và tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật (Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996, Krystofova, 1994)

Các phosphate inositol có thể tổng hợp hóa học hoặc tổng hợp bằng enzyme Tuy nhiên, cơ chế tổng hợp hóa học của inositol phosphate (Billington, 1993) phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao Trái lại, tổng hợp bằng enzyme phytase thực hiện trong điều kiện ôn hòa, có hiệu quả lớn trong việc sản xuất Siren (1986) sản xuất thành

công D-myo-inositol 1,2,6 trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5

trisphosphate, L-myo-1,3,4 trisphosphate, và myo-inositol-1,2,3 trisphosphate với sự trợ giúp của phytase có nguồn gốc từ S cerevisiae Tương tự, phytase phân lập từ A niger phân giải IP6 thành các dẫn xuất có mức photpho hóa thấp từ IP5 đến IP2 phụ thuộc vào lượng enzyme (Dvorakova, 2000)

1.2.10 Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam:

Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về phytase, chỉ có một số nghiên cứu như:

- Nghiên cứu của Lê Quốc Phong, 2007, Nghiên cứu một số đặc tính và

bước đầu thử nghiệm ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp, Luận văn

thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN Trong luận văn này tác giả thu nhận phytase của

các chủng Bacillus spp, trong đó có chủng BS12, tác giả đã thu được phytase

có hoạt độ chung khoảng 60UI/ml ( đơn vị UI là lượng enzyme cần để phóng thích 1nmolP/phút ở điều kiện phản ứng)

- Nghiên cứu của Phạm Tấn Việt, 2007, Hiệu quả của chế phẩm enzyme phytase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus sp Đối với sự tăng trưởng

của chuột nhắt trắng Mus Musculus, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN

Trên thị trường hiện nay có một số các sản phẩm thương mại của phytase thu nhận từ tự nhiên như: Natuphos phytase (là sản phẩm được điều chế từ 3-phytase (EC 3.1.3.8) thu nhận từ A niger (CBS 101.672)), Ronozyme (phytase thu nhận từ E coli), …

1.3 Nấm men Pichia pastoris

1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung [13]

Theo Phaff năm 1956, Pichia pastoris được phân loại như sau:

Loài: Pichia pastoris

Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris [51]

Pichia pastoris là loài nấm men có khả năng sử dụng hợp chất 1carbon

mang tính khử như methanol, hay methane, tăng trưởng ở nhiệt độ 30-32oC,

pH 3-7