M Ở ĐẦU
1.3.3Biến dưỡng methanol ở P pastoris
Pichia pastoris là một trong khoảng 12 loài nấm men thuộc 4 giống có khả năng chuyển hóa methanol. Các giống khác gồm Candida, Hansenual, Torulopsis
P. pastoris có khả năng sử dụng methanol như một nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Những nghiên cứu sinh hóa cho thấy việc sử dụng methanol cần một con đường chuyển hóa liên quan đến một vài enzyme. Alcohol oxidase (AOX) là enzyme đầu tiên và là enzyme chính trong con đường biến dưỡng methanol, có vai trò xúc tác sự oxy hóa methnol tạo formaldehyde và hydrogen peroxide (H2O2). Catalase hiện diện trong peroxisome cùng với AOX sẽ chuyển hóa hydrogen peroxide thành O2 và H2O. Một phần formaldehyde sinh ra bởi AOX rời peroxisome vào tế bào chất và bị oxy hóa thành formate và CO2 nhờ formaldehyde dehydrogenase và formate hydrogenase. Những phản ứng này là cơ sở sinh hóa biến dưỡng methanol tạo năng lượng cho tế bào phát triển.[9]
Theo con đường đồng hóa, formaldehyde còn lại trong peroxisome sẽ phản ứng với xylulose-5-phosphate, được xúc tác bởi dihydroxyacetone synthase (DHAS), tạo ra hai phân tử C3 dihydroxyacetone và glyceraldehyde- 3-phosphat. Những hợp chất này sau đó được chuyển hóa trong tế bào chất, tái tạo xylulose-5-phosphate. Trong số này, 1/3 số phân tử glyceraldehyde-3- phosphate sinh ra được chuyển hóa và tạo sinh khối tế bào.[27]
Pichia có 2 gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, trong đó gen AOX1 chịu trách nhiệm cho phần lớn hoạt tính alcohol oxidase trong tế
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 31 Tổng quan tài liệu
bào. Việc biểu hiện gen AOX1 được điều hòa chặt chẽ và cảm ứng bởi methanol. Trong nuôi cấy lắc có cảm ứng methanol gen AOX1 được biểu hiện chiếm 5% và có thể lên hơn 30% tổng số protein được tế bào sản xuất, trong giai đoạn này tế bào tăng trưởng với tốc độ giới hạn.[47]
Sự kiểm soát gen AOX1 được điều khiển bằng 2 cơ chế: “cơ chế ức chế - giải ức chế ” và “cơ chế cảm ứng”. Việc giải ức chế (khi không có nguồn cacbon gây ức chế trong môi trường) không đưa đến sự phiên mã đủ mức của gen AOX1. Sự hiện diện của methanol là một nhân tố cần thiết cho việc cảm ứng cho sự phiên mã với mức độ cao.[45]
Hình 1.6:Biểu đồ chung cho vector biểu hiện của P. pastoris.[47] YFG (your favorite gene), là vị trí cho sự ghi nhận sự khuyếch đại