M Ở ĐẦU
2.2.2Phương pháp xác định hoạt tính phytase
v Nguyên tắc:
Khi photphat tác dụng với amonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat có màu vàng. Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh molybdat. Độ đậm của màu sắc tỉ lệ với hàm lượng phospho có trong mẫu.[1]
Phản ứng:[30]
2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O "
(MoO2.4MoO3)2.H3PO4.4H2O
Các chất khử thường sử dụng là SnCl2, hydrazin, acid ascorbic, FeSO4, quinon, oxalat, sulfit. Các chất khử cũng có thể sử dụng riêng hoặc phối hợp với nhau. Trong đề tài này, acid ascorbic được sử dụng làm chất khử.[30]
Luận Văn Thạc Sĩ Trang46 Vật liệu &Phương pháp
v Cách tiến hành:
* Dựng đường chuẩn photpho
Chuẩn bị một dãy các mẫu dung dịch phosphate chuẩn có nồng độ 5,625 – 11,25 – 22,5 – 45 – 90 µM P/ml như sau:
Bảng 2.2: Nồng độ của các dung dịch photphate chuẩn: [30] Pha loãng dung dịch
phosphate 9mM/ml Nồng độ phosphate (mM/ml) 1:1600 5,625 1:800 11,25 1:400 22,5 1:200 45 1:100 90
Cho mẫu vào các ống nghiệm sạch theo thứ tự sau: Dung dịch phosphate chuẩn 0,2ml
Nước cất 1,8ml
Thuốc thử màu 2,0ml
Lắc đều và để trong bồn ổn nhiệt, ủ ở 500C trong 15 phút, đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 820nm. Đối với ống thử không, ta thay 0.2ml mẫu bằng nước cất, các bước tiếp theo làm tương tự.
Từ kết quả thu được, dựng một đường chuẩn nồng độ photpho theo OD820.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang47 Vật liệu &Phương pháp
*Xác định hoạt tính phytase
a. Thực hiện phản ứng giữa cơ chất Na-phytate và enzyme phytase
Bảng 2.3: Các bước thực hiện phản ứng enzyme
Thử thật Thử không Enzyme phytase 0,5ml 0,5ml Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 5phút Natri phytate 1% 0,5ml TCA 15% 1ml Lắc đều, ủ ở nhiệt độ 37o C trong 15phút TCA 15% 1ml
Lắc đều, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 15phút
b. Xác định hàm lượng photpho
Cho mẫu và thuốc thử màu vào ống nghiệm theo thứ tự sau Hỗn hợp phản ứng 0,2ml
Nước cất 1,8ml
Thuốc thử màu 2,0ml
Lắc đều và ủ ở 50oC trong 15phút, đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 820nm.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang48 Vật liệu &Phương pháp
Định nghĩa đơn vị hoạt độ phytase: 1 đơn vị hoạt độ phytase (UI) được định nghĩa là lượng phytase cần để giải phóng 1µmol photpho vô cơ từ acid phytic (phytate) trong thời gian 1 phút ở điều kiện thí nghiệm là 37o
C, pH 5,5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lượng photpho của mẫu:
Hàm lượng photpho của hổn hợp phản ứng:
ΔOD820nm (mẫu) = OD820nm (thử thật) – OD820nm (thử không)
Hoạt độ chung của enzyme phytase
a: Hệ số của đường chuẩn photpho. 2 : Thể tích hỗn hợp phản ứng.
v: (ml) thể tích hổn hợp phản ứng đem đi xác định lượng photpho.
n: độ pha loãng của enzyme.
V (ml): thể tích dịch enzyme đem đi phản ứng. m (g): lượng enzym đem đi pha loãng.
Công thức tính hoạt độ riêng:
2.2.3 Phương phápđiện di SDS-PAGE
ΔOD820nm 2 * a * n
UI/g =
V * v * m * 15
Hoạt độ chung (UI/g-CPE)
Hoạt độ riêng = = UI/mg protein Hàm lượng protein (mg/g-CPE)
Luận Văn Thạc Sĩ Trang49 Vật liệu &Phương pháp
v Nguyên tắc
Trong phương pháp này các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Thêm vào đó một chất khử là Mercaptomethanol hoặc dithithreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối - S-S- (disulfur) của protein (và các tiểu đơn vị của chúng). Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ.[1]
Mục đích của phương pháp điện di là để đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử của protein. Người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn, là hổn hợp protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.
Tốc độ di chuyển của protein trong phương pháp điện di phụ thuộc vào: pH của môi trường (thường dùng đệm để duy trì một pH ổn định), cường độ điện trường, nhiệt độ, tính chất của giá mang, thời gian điện di và hình dáng, kích thước, trọng lượng phân tử của mẫu protein.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử khoảng từ 10.000 – 200.000 Daltons.[11]
Luận Văn Thạc Sĩ Trang50 Vật liệu &Phương pháp
v Cách thực hiện:
Lau sạch hai tấm kính và lắp vào giá để đổ gel.
Đổ gel
Chuẩn bị đổ bảng gel polyacrylamide có kích thước 6cm x 8cm x 1mm.
- Chuẩn bị gel phân tách (Separating gel):
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml Hổn hợp: Acrylamide + bisacrylamide (30%) 3ml Dung dịch A 2,5ml Nước khử ion 4,445ml TEMED 5µl Amonium persulfate 10% 70µl Tổng thể tích 10ml
Dùng micropipette trộn đều và hút dung dịch gel phân tích cho vào khuôn. Khi mức gel cách miệng khuôn 3cm thì dừng và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Luận Văn Thạc Sĩ Trang51 Vật liệu &Phương pháp
cho nước khử ion vào đến đầy miệng khuôn. Chờ 45 – 60 phút cho gel hydrate hóa hoàn toàn rồi đổ bỏ lớp nước cất bên trên. Lấy giấy thấm, thấm hết nước trong khuôn.
- Chuẩn bị gel gom (stacking gel):
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml Hổn hợp: Acrylamide + bisacrylamide, (30%) 0,67ml Dung dịch B 1ml Nước cất 2,3ml TEMED 4µl Ammonium persulfate 10% 30µl Tổng thể tích 4ml
Dùng micropipette trộn đều các thành phần, sau đó bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào khuôn gel để tạo các giếng (đưa lược vào nhẹ, tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo khuôn gel ra khỏi giá đỡ và lắp khuôn gel vào bộ điện di. Cho dung dịch điện di vào buồng điện di.
Xử lý mẫu:
Hút 40µl mẫu và 10µl dung dịch đệm pha mẫu cho vào eppendort sạch. Đối với thang chuẩn, hút 2µl thang chuẩn protein, thêm vào 16µl nước khử ion và 4µl dung dịch đệm pha mẫu. Đối với phytase thương mại, pha loãng 20 lần và cũng chuẩn bị như các mẫu khác. Đậy nắp và trộn đều, đun sôi cách thủy trong 3-10 phút, ly tâm 13000 vòng/30giây.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang52 Vật liệu &Phương pháp
Dùng micropipette hút 20µl mẫu đã được xử lý cho vào các giếng. Cho từ từ để tránh tạo bọt khí.
Chạy điện di:
Lắp nguồn điện, điều chỉnh để đạt 150V ổn định. Chạy đến khi vạch màu di chuyển đến còn cách lề dưới của bảng gel khoảng 1cm thì rút nguồn.
Nhuộm gel:
Tháo bảng gel ra, đem gel rửa ba lần bằng nước cất. Sau đó đổ hết nước, cho khoảng 30ml thuốc nhuộm Comassie blue vào để 30phút, có lắc nhẹ. Sau đó đổ thuốc nhuộm ra, rửa lại với nước cất.
Giải nhuộm:
Sau khi rửa bằng nước cất, đổ hết nước cất và cho 60ml dung dịch giải nhuộm, để lắc nhẹ trong 60 phút. Đổ hết dung dịch giải nhuộm và rửa lại bằng nước cất đến khi gel trở nên trong suốt. Sau khi giải nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Có thể bảo quản bảng gel trong nước cất.
Xác định trọng lượng phân tử protein
Đo khoảng cách di chuyển của các vạch protein của thang chuẩn và vạch protein của enzym cần xác định.
Đo khoảng cách di chuyển của vạch màu di chuyển của thuốc nhuộm bromophenol blue
Tính giá trị Rf:[11]
Khoảng cách di chuyển của protein Khoảng cách di chuyển của phẩm màu
Luận Văn Thạc Sĩ Trang53 Vật liệu &Phương pháp
Vẽ đồ thị log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf tương ứng của chúng.
Tính kết quả
Từ giá trị Rf của enzym phytase xác định được, dựa vào đồ thị chuẩn đã vẽ, xác định trọng lượng phân tử các vạch protein trong dịch enzyme phytase. Từ điện di đồ thu được ta tính được trọng lượng phân tử của phytase tái tổ hợp thu được.
2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel (sử dụng Bio.gel P100, hệ thống sắc ký cột Biologic LP (Bio-Rad)): ký cột Biologic LP (Bio-Rad)):
v Nguyên tắc:
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách các phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ lọt vào bên trong hạt gel (pha mạng) thì bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi đó những phân tử lớn hơn nằm kẹt ở các khe hở giữa các hạt gel (pha kẽ) sẽ di chuyển nhanh hơn và được giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.[1],[6]
Những phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử càng lớn thì ra càng nhanh. Ngược lại phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử càng nhỏ thì ra càng chậm. Vì vậy, có thể ví việc tách các chất bằng gel như là một quá trình sàng lọc phân tử.[6]
Trong phần này chúng tôi sử dụng chất mang là Biogel P-100 của hãng Bio-Rad. Biogel P-100 là dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90nm, khả năng ngậm nước là 12ml/g gel khô, phạm vi phân tách là 5.000-150.000 daltons.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang54 Vật liệu &Phương pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.2: Hệ thống sắc ký lọc gelBiologic LP (Bio-Rad).
v Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5. Đuổi khí trong 90 phút, bảo quản trong tủ lạnh (4oC).
- Pha gel: cân 8g gel (Biogel P100), cho vào becher 500ml, cho nước cất vào gần đầy cốc, để 24h cho gel trương nở hoàn toàn, đổ bỏ lớp gel nổi bên trên, thêm nước cất đến 2/3 cốc, đuổi khí trong 60 phút.
- Chuẩn bị cột: cột được rữa sạch, để khô, sục khí khoảng 2-3h. - Nhồi cột: sau khi đã chuẩn bị cột xong, cho từ từ gel lên cột để tránh tạo bọt khí, cho gần đầy cột rồi để yên cho gel lắng. Sau đó cho thêm gel đến khi lượng gel được 2/3 cột. Lắp cột gel vào hệ thống và cho chạy rửa cột khoảng 30 phút với đệm Na-Acetate pH 5,5 (đã chuẩn bị ở trên).
Luận Văn Thạc Sĩ Trang55 Vật liệu &Phương pháp
- Chuẩn bị mẫu: Hòa tan enzym (đã tủa bằng cồn 96o) trong đệm Na-Acetate 0,2M, pH 5,5. Xác định hàm lượng protein và hoạt độ chung và hoạt độ riêng của mẫu.
- Chạy lọc gel: sau khi chạy rửa cột, bơm 2ml mẫu vào vị trí chứa mẫu, chọn chương trình (phân đoạn 2ml, tốc độ dòng là 0,16ml/ phút). Bắt đầu hứng dịch ra khỏi cột trong các ống nghiệm sạch, khô, có đánh số. Theo dõi màng hình của máy vi tính để biết các peak, đến khi không còn lên peak nữa thì dừng. Chuyển qua chạy rửa cột và tiếp tục chạy mẫu khác.
Đổ các ống của cùng một peak chung lại với nhau và xác định hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ riêng của phytase, tính hiệu suất chạy điện di SDS-PAGE.
Sau khi xác định hết các chi tiêu trên, lấy dung dịch enzym sau khi qua cột đem tủa lại với cồn 96o, ly tâm, hòa tan lại với một ít đệm Na-Acetate pH 5.5, để xác định hằng số Michaelis (Km).
2.2.5 Phương pháp thẩm tích (Dialyse) để loại muối
v Nguyên tắc:
Sử dụng màng bán thấm, tách các chất có trọng lượng phân tử (M) nhỏ (muối, đường, nước, amino acid,…) ra khỏi chất có M lớn (protein, enzyme, polymer khác).[6]
Dùng các màng lọc, túi lọc cellofan, colodion.
Dung dịch để dialyse có thể dùng nước, dung dịch đệm. Thực hiện dialyse ở nhiệt độ thấp (<100C)
Thay dung dịch ngoài từ 3-4 lần, thời gian Dialyse khoảng 18h.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang56 Vật liệu &Phương pháp
Túi Dialyse (màng bán thấm), cắt một đoạn vừa đủ dùng, ngâm trong nước cất, lấy ra thổi để thông hai đầu, lấy chỉ trắng cột chặt một đầu.
Enzyme phytase (dạng khô) hòa tan trong đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5.
Dùng phễu đổ dịch enzyme vào túi Dialyse, cột đầu còn lại của túi vào đũa thủy tinh và đưa túi Dialyse vào becher 500ml, sau đó đổ đệm Na-Acetate 0,2M, pH 5,5 ngập túi. Để trong tủ lạnh (4oC) khoảng 18h, thường xuyên khuấy và thay đệm bên ngoài 3-4 lần. Dùng AgNO3 để thử đến khi hết muối ở dung dịch đệm bên ngoài túi.
Lấy túi Dialyse ra để trên giấy thấm và thấm bớt đệm. Đổ dịch enzym ra và đem đi chạy sắc ký lọc gel.
Túi Dialyse được rửa với nước cất 2-3 lần và ngâm trong nước cất có một ít cồn, để dùng cho lần sau.(có thể dùng được 2-3 lần)
2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (Km)
v Nguyên tắc:
Khi một cơ chất S gắn với vị trí hoạt động của enzyme E, một phức hợp trung gian ES được hình thành. Trong quá trình chuyển đổi, cơ chất được chuyển thành sản phẩm. Sau một thời gian ngắn, thì sản phẩm tách ra khỏi enzyme. Quá trình này có thể được tóm tắt như sau:[5] Với: k1: hằng số tốc độ hình thành ES k2: hằng số tốc độ phân ly ES E + S E S E + P k1 k2 k3
Luận Văn Thạc Sĩ Trang57 Vật liệu &Phương pháp
k3: hằng số tốc độ hình thành sản phẩm và giải phóng vị trí hoạt động của enzyme
Hằng số Michaelis (Km):
Phương trình Michaelis- Menten:
Từ phương trình trên cho biết Km là hằng số đặc trưng cho phản ứng. Km phản ánh ái lực giữa enzyme và cơ chất, nghĩa là Km càng thấp thì ái lực giữa enzyme và cơ chất càng mạnh và ngược lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Km = nồng độ cơ chất [S] khi V= ½ Vmax
Đồ thị phương trình Michaelis – Menten là một Hyberbol:
Hình 2.3: Đồ thị phương trình Michaelis Menten [51]
Tuy nhiên để quá trình tính toán được chính xác hơn người ta thường sử dụng phương trình Lineweaver-Burk, là dạng nghịch đảo của phương trình Michaelis-Menten.
V = Vmax[S] [S] + Km Km = k2 + k3 k1 1/2Vmax
Luận Văn Thạc Sĩ Trang58 Vật liệu &Phương pháp
Phương trình Lineweaver-Burk:
Đồ thị là dạng đường thẳng: y = ax +b
Hình 2.4: Đồ thị phương trình Lineweaver Burk [51]
v Cách thực hiện:
Enzyme phytase tái tổ hợp sau khi qua sắc ký lọc gel, đem tủa với cồn 96o, ly tâm, hòa tan trong đệm Na-Acetate pH 5.5. Sau đó làm phản ứng với cơ chất Natri phytate có nồng độ khác nhau: 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25mM. Ứng với mỗi nồng độ cơ chất được khảo sát ở các thời gian khác nhau: 10, 15, 30, 45, 60 phút, thực hiện phản ứng ở 37o
C.
Xác định hoạt tính enzyme.
Ở mỗi nồng độ cơ chất chọn một giá trị hoạt tính cao nhất làm giá trị V. Từ đó dùng chương trình Sigma plot 10.0 để vẽ đồ thị Lineweaver – Burk theo nồng độ cơ chất [S] và giá trị hoạt tính V tương ứng, như hình2.4. Từ đó xác định được Km và Vmax.
Km Vmax 1 V = . 1 [S] + 1 Vmax [S]
Luận Văn Thạc Sĩ Trang59 Vật liệu &Phương pháp
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase: Của các chủng GS115/ phyAI và GS115/ phyB đã biến nạp của phòng Vi Sinh Ứng Dụng GS115/ phyAI và GS115/ phyB đã biến nạp của phòng Vi Sinh Ứng Dụng của Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Sử dụng môi trường MM-Canxi phytat (Minimal Methanol – Histidine-Canxi phytat).
v Nguyên tắc:
MM – canxi phytate là môi trường có nguồn cacbon duy nhất là methanol và được bổ sung một hàm lượng nhỏ canxi phytate để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase của P. pastoris biến nạp. Vì gen phyAI, phyB được tạo dòng sau promoter AOX trên vector biểu hiện nên cần cảm ứng khả năng sinh enzyme phytase của chủng nấm men biến nạp bằng methanol. Methanol được bổ sung vào môi trường 24 giờ/lần, mỗi lần bổ sung 100 µl/đĩa để cung cấp nguồn cacbon cho nấm men phát triển. Chủng nấm men biến nạp sinh tổng hợp enzyme phytase và tiết vào môi trường nuôi thông qua trình tự tín hiệu tiết trên vector biểu hiện, phytase sẽ phân giải canxi phytate và tạo vòng phân giải làm trong môi trường.
Quá trình làm:
Giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB từ môi trường thạch nghiêng, được cấy sang môi trường YPD lỏng, nuôi lắc trong 24 giờ. Sau đó lấy giống từ canh trường YPD lỏng cấy vào môi trường MM-canxi phytate. Bổ sung methanol (100 µl/đĩa) mỗi 24 giờ. Nuôi trong 4 ngày, quan sát vòng phân giải và chụp hình.