M Ở ĐẦU
1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho
Sự tổng hợp phytase chịu ảnh hưởng bởi nồng độ photphat là một hiện tượng chung, được quan sát ở các loài nấm mốc và nấm men sinh phytase. Phytase được sản xuất khi photphat vô cơ bắt đầu cạn kiệt, sự giới hạn photphat vô cơ trong môi trường sẽ cảm ứng sinh phytase, tuy nhiên, bị phụ thuộc vào tổng lượng cacbon có mặt trong môi trường.
Aspergillus ficuum NRRL 3135 sản xuất phytase có hoạt tính nhiều nhất khi nồng độ photphat vô cơ thấp hơn 0.004% (w/ V) trong môi trường chứa 8% (w/ V) bột bắp.[27]
Hàm lượng photpho trong ngũ cốc cao làm kìm hãm khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm mốc. Còn khi nồng độ photpho trong môi trường ở mức thấp, sư tăng trưởng của sợi nấm tốt và sự sản xuất phytase đạt tối đa. Khi tăng lượng photphat vào môi trường, nấm mốc tăng trưởng mạnh nhưng lượng phytase sinh ra giảm đáng kể.
1.2.9 Ứng dụng của enzyme phytase
1.2.9.1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm [40],[41]
Phytate chiếm từ 60- 80% photpho thực vật, nhưng cơ thể không hấp thu được lượng phytate này vì không có phytase, kể cả các chất dinh dưỡng khoáng cũng không được hấp thu. Phytase được bổ sung trong thức ăn dành cho gia cầm, lợn và cá có tác dụng cải thiện hiệu quả sử dụng photpho, khoáng chất, acid amin và năng lượng, giúp cho cơ thể động vật hấp thu tốt lượng phytate trong nguồn thức ăn.[40]
Có thể dùng các phytase có nguồn gốc khác nhau để bổ sung vào thức ăn động vật. Tuy nhiên, phytase thực vật thì hạn chế hơn do hàm lượng biến thiên, bị bất hoạt ở nhiệt độ hơn 70°C (Pointillart,
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 24 Tổng quan tài liệu
1988). Đồng thời, hiệu quả sinh học của phytase ngũ cốc chỉ 40% so với phytase vi sinh vật từ loài Aspergillus (Zimmermann, 2002).
Phytase sản xuất bởi vi sinh vật phân hủy phytate thực vật hầu như hoàn toàn đối với động vật nhai lại (Rodehutscord, 2001). Mặt khác, bổ sung phytase vi sinh vật thay cho photpho vô cơ, vào thức ăn còn làm giảm mạnh sự bài tiết photpho của động vật dạ dày đơn. Tùy vào thực đơn, giống, và mức bổ sung phytase, sự bài tiết photpho có thể giảm từ 25 đến 50% (Kornegay, 1999).
Bổ sung phytase vi sinh vật vào thực đơn của động vật không nhai lại cũng cải thiện tính hiệu quả của các ion Ca2+, Mg2+ (Wall và cộng sự, 1991), và vài nguyên tố vi lượng như kẽm (Thiel và Weigvà, 1992), đồng (Adeola, 1999), sắt (Pallauf và cộng sự, 1992), và mangan (Mohanna và Nys, 1999).
Phytase vi sinh vật cũng có thể tăng cường tiêu hóa protein do phytase phân hủy các phức hợp phytate-protein, phytate-acid amin và phức hợp phytate-khoáng chất-protein. Hơn nữa, phytate ức chế enzyme phân hủy protein (Caldwell, 1992), và ức chế amylase (Deshpvàe và Cheryan, 1984)
Ngày nay, phytase vi sinh vật được sản xuất trên qui mô lớn với chi phí thấp và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thức ăn chăn nuôi.
1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Chế biến và sản xuất thực phẩm cho con người cũng là một lĩnh vực ứng dụng của phytase. Phytase làm giảm hoàn toàn acid phytic trong quá trình sản xuất các thức ăn từ bột gạo, lúa mì, bắp, yến mạch, cây lúa miến, hỗn hợp bột lúa mì-bột đậu nành (Hurrell, 2003). Thí nghiệm trên ngũ cốc porridge có mức phytate có sẵn nằm trong khoảng từ 0.12% (lúa mì porridge) và 0.89% (lúa miến porridge). Sau khi xử lý
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 25 Tổng quan tài liệu
với Phytase, hàm lượng acid phytic giảm còn ≤ 0.002 %. Đồng thời, sự hấp thu sắt tăng đáng kể.[40]
Phytase nấm được bổ sung trong sản xuất bánh mì có tác dụng giảm thời gian lên men mà không ảnh hưởng đến độ pH của bột nhồi bánh, làm tăng thể tích bánh mì và sự cải thiện kết cấu vụn bánh (Haros, 2001)
1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-inositol
phosphate[23],[28],[40]
Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay. Trong nghiên cứu, Svàberg (1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5) có tác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt. Thêm 10mg photpho như IP5 làm giảm sự hấp thu sắt đến 39%. IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được cho cùng với IP5 và IP6. Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu, nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3.
Mặt khác, các ester myo- inositol có ít Photpho (mono, bis, tris, và tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật (Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996, Krystofova, 1994).
Các phosphate inositol có thể tổng hợp hóa học hoặc tổng hợp bằng enzyme. Tuy nhiên, cơ chế tổng hợp hóa học của inositol phosphate (Billington, 1993) phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao. Trái lại, tổng hợp bằng enzyme phytase thực hiện trong điều kiện ôn hòa, có hiệu quả lớn trong việc sản xuất. Siren (1986) sản xuất thành công D-myo-inositol 1,2,6 trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 26 Tổng quan tài liệu
trisphosphate, L-myo-1,3,4 trisphosphate, và myo-inositol-1,2,3 trisphosphate với sự trợ giúp của phytase có nguồn gốc từ S. cerevisiae. Tương tự, phytase phân lập từ A. niger phân giải IP6 thành các dẫn xuất có mức photpho hóa thấp từ IP5 đến IP2 phụ thuộc vào lượng enzyme (Dvorakova, 2000)
1.2.10Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam:
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về phytase, chỉ có một số nghiên cứu như:
- Nghiên cứu của Lê Quốc Phong, 2007, Nghiên cứu một số đặc tính và bước đầu thử nghiệm ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN. Trong luận văn này tác giả thu nhận phytase của các chủng Bacillus spp, trong đó có chủng BS12, tác giả đã thu được phytase có hoạt độ chung khoảng 60UI/ml ( đơn vị UI là lượng enzyme cần để phóng thích 1nmolP/phút ở điều kiện phản ứng).
- Nghiên cứu của Phạm Tấn Việt, 2007, Hiệu quả của chế phẩm enzyme phytase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus sp. Đối với sự tăng trưởng của chuột nhắt trắng Mus Musculus, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN.
Trên thị trường hiện nay có một số các sản phẩm thương mại của phytase thu nhận từ tự nhiên như: Natuphos phytase (là sản phẩm được điều chế từ 3-phytase (EC 3.1.3.8) thu nhận từ A. niger (CBS 101.672)), Ronozyme (phytase thu nhận từ E. coli), …
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 27 Tổng quan tài liệu
1.3 Nấm men Pichia pastoris
1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung [13]
Theo Phaff năm 1956, Pichia pastoris được phân loại như sau: Giới: Fungi Ngành : Ascomycota Dưới ngành: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Pichia
Loài: Pichia pastoris.
Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris [51].
Pichia pastoris là loài nấm men có khả năng sử dụng hợp chất 1carbon mang tính khử như methanol, hay methane, tăng trưởng ở nhiệt độ 30-32o
C, pH 3-7.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 28 Tổng quan tài liệu
Koichi Ogata là người đầu tiên mô tả khả năng của những loài nấm men có thể sử dụng methanol như một nguồn carbon và năng lượng duy nhất vào 30 năm trước đây.
Trong suốt những năm 1970, công ty Phillips Petrolenum đã phát triển môi trường và qui trình để nuôi Pichia pastoris nhằm sản xuất protein đơn bào trên môi trường chứa methanol trong nuôi cấy liên tục ở mật độ cao. Tuy nhiên, cuộc khủng hoảng dầu mỏ trong thập niên 70 của thể kỷ trước làm giá methanol tăng cao, vì thế giá trị kinh tế của những protein đơn bào sản xuất từ methanol không đáp ứng về mặt kinh tế.[21]
Trong những thập niên sau, Phillips Petroleum đã hợp tác với Viện kỹ thuật sinh học (hay công nghệ sinh học) Salk, Inc. (SIBIA, La Jdla, CA) để phát triển p. pastoris thành hệ thống biểu hiện protein ngoại lai. Những nhà nghiên cứu ở SIBIA đã tách chiết gen, promoter alcohol oxidase và tạo những véctơ, chủng, cũng như qui trình thao tác gen của P. pastoris. Sự kết hợp của qui trình lên men để sản xuất protein đơn bào và promoter AOX mạnh được điều hòa chặt chẽ đã làm tăng mức biểu hiện protein ngoại lai một cách đáng kinh ngạc. Năm 1993, Phillips Petroleum cấp giấy phép cho Invitrogen để thương mại hóa những thành phần của hệ thống biểu hiện dựa trên P. pastoris.[13]
1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
Pichia pastoris được xem là một hệ thống biểu hiện có nhiều ưu điểm vượt trội. Hệ thống biểu hiện này đã được nghiên cứu sâu và dễ thao tác, ngoài ra còn cho phép sản xuất các protein tái tổ hợp với năng suất cao. Những yếu tố góp phần giúp cho hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris ngày càng được ứng dụng rộng rãi gồm có:
· Pichia pastoris là nấm men đơn bào nên dễ thao tác và nuôi cấy. P. pastoris có khả năng tăng trưởng hiếu khí mạnh, nhờ đó đơn giản hóa việc nuôi cấy, mật độ tế bào cao. Mật độ tế bào có thể lên đến gấp 10 lần của
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 29 Tổng quan tài liệu
· Bên cạnh đó các kĩ thuật cần cho thao tác di truyền phân tử cũng tương tự với các kĩ thuật của Saccharomyces cerevisiae, một trong những hệ thống được nghiên cứu kĩ nhất.[12]
· Ngoài ra hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris còn có các promotor mạnh như là AOX1 hoặc GAPDH. Gen được điều khiển bởi các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen của Pichia pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao với hàm lượng lên đến vài gram/L. Trong đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì khả năng cảm ứng bằng methanol đem đến những thuận lợi trong việc kiểm soát biểu hiện của gen quan tâm.[47]
· Pichia pastoris còn là một loài eukaryote, do đó nó có khả năng thực hiện các biến đổi hậu dịch mã như xử lý phân cắt protein, gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide và gắn gốc đường để tạo protein hoạt động. Đây là một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện của các loài prokaryote không có được.[47]
· Việc gắn chèn thêm trình tự tiết vào trước gen quan tâm sẽ giúp protein được tiết vào môi trường, nhờ đó đơn giản hóa việc tinh sạch.
· Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú.
· Thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản không đòi hỏi các yếu tố tăng trưởng hoặc các chất bổ sung vốn đắt tiền và làm việc tinh sạch trở nên khó khăn. Quá trình lên men có thể được thực hiện nhanh chóng đáp ứng các yêu cầu lên men, các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất cũng như hoạt tính protein như pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm soát.
Hiện đã có hơn 300 protein từ rất nhiều nguồn khác nhau được biểu hiện thành công ở Pichia pastoris. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ hợp khác bằng hệ thống Pichia pastoris cũng tăng lên từng ngày.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 30 Tổng quan tài liệu
Với những lý do trên, hệ thống biểu hiện Pichia pastoris được lựa chọn cho việc tạo dòng gen mã hóa cho phytase.
Để hiểu rõ hơn về cơ chế cảm ứng bằng methanol, hoạt động của các promoter, bằng cách nào protein được tiết ra môi trường nuôi cấy cũng như việc lựa chọn chủng chủ Pichia pastoris và vector cho biểu hiện protein, ta sẽ đi sâu vào tìm hiểu các đặc điểm liên quan đến hệ thống Pichia pastoris.
1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris
Pichia pastoris là một trong khoảng 12 loài nấm men thuộc 4 giống có khả năng chuyển hóa methanol. Các giống khác gồm Candida, Hansenual, Torulopsis
P. pastoris có khả năng sử dụng methanol như một nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Những nghiên cứu sinh hóa cho thấy việc sử dụng methanol cần một con đường chuyển hóa liên quan đến một vài enzyme. Alcohol oxidase (AOX) là enzyme đầu tiên và là enzyme chính trong con đường biến dưỡng methanol, có vai trò xúc tác sự oxy hóa methnol tạo formaldehyde và hydrogen peroxide (H2O2). Catalase hiện diện trong peroxisome cùng với AOX sẽ chuyển hóa hydrogen peroxide thành O2 và H2O. Một phần formaldehyde sinh ra bởi AOX rời peroxisome vào tế bào chất và bị oxy hóa thành formate và CO2 nhờ formaldehyde dehydrogenase và formate hydrogenase. Những phản ứng này là cơ sở sinh hóa biến dưỡng methanol tạo năng lượng cho tế bào phát triển.[9]
Theo con đường đồng hóa, formaldehyde còn lại trong peroxisome sẽ phản ứng với xylulose-5-phosphate, được xúc tác bởi dihydroxyacetone synthase (DHAS), tạo ra hai phân tử C3 dihydroxyacetone và glyceraldehyde- 3-phosphat. Những hợp chất này sau đó được chuyển hóa trong tế bào chất, tái tạo xylulose-5-phosphate. Trong số này, 1/3 số phân tử glyceraldehyde-3- phosphate sinh ra được chuyển hóa và tạo sinh khối tế bào.[27]
Pichia có 2 gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, trong đó gen AOX1 chịu trách nhiệm cho phần lớn hoạt tính alcohol oxidase trong tế
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 31 Tổng quan tài liệu
bào. Việc biểu hiện gen AOX1 được điều hòa chặt chẽ và cảm ứng bởi methanol. Trong nuôi cấy lắc có cảm ứng methanol gen AOX1 được biểu hiện chiếm 5% và có thể lên hơn 30% tổng số protein được tế bào sản xuất, trong giai đoạn này tế bào tăng trưởng với tốc độ giới hạn.[47]
Sự kiểm soát gen AOX1 được điều khiển bằng 2 cơ chế: “cơ chế ức chế - giải ức chế ” và “cơ chế cảm ứng”. Việc giải ức chế (khi không có nguồn cacbon gây ức chế trong môi trường) không đưa đến sự phiên mã đủ mức của gen AOX1. Sự hiện diện của methanol là một nhân tố cần thiết cho việc cảm ứng cho sự phiên mã với mức độ cao.[45]
Hình 1.6:Biểu đồ chung cho vector biểu hiện của P. pastoris.[47] YFG (your favorite gene), là vị trí cho sự ghi nhận sự khuyếch đại
1.3.4 Sự tiết các protein ngoại lai
Protein tái tổ hợp được sản xuất bởi Pichia có thể tồn tại nội bào hoặc tiết ra ngoài môi trường. Pichia chỉ tiết một lượng ít protein nội sinh của chính nó, môi trường nuôi cấy không chứa thêm protein nào khác. Đây là một thuận lợi cho việc tinh sạch protein sau này vì phần lớn protein được tiết ra môi trường là protein tái tổ hợp.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 32 Tổng quan tài liệu
Việc tiết protein là bước quan trọng trong tinh sạch protein nhằm tách biệt nó ra khỏi các protein khác. Việc tiết yêu cầu sự hiện diện một trình tự tín hiệu tiết trên protein tái tổ hợp nhằm hướng protein đi vào con đường tiết.
Mặc dù nhiều trình tự tín hiệu tiết khác nhau đã được sử dụng thành công, trình tự tín hiệu tiết prepropeptide α-factor của S. cerevisiae được xem là thành công nhất.[47]
1.3.5 Biến đổi hậu dịch mã :
Hơn ba thập niên trước, E.coli được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện protein. Tuy nhiên đối với các protein có nguồn gốc từ prokaryote, E.coli lại không thể thực hiện các biến đổi sau dịch mã như tạo cầu nối disulfide, gắn các gốc đường cũng như thực hiện gấp cuộn chính xác các protein ngoại lai. Do đó các protein nguồn gốc từ eukaryote khi được biểu hiện bởi E.coli
thường trở nên mất hoạt tính. Ngoài ra E.coli còn có khuynh hướng giữ lại đuôi methionin ở protein, đuôi acid amin này có thể ảnh hưởng đến sự ổn định của protein và gây nên tính miễn dịch. Trong trường hợp đó thì những hệ thống biểu hiện eukaryote như Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris… được ưu tiên.[47]
Đối với Saccharomyces cereviasiae tuy có khả năng thực hiện các biến đổi hậu dịch mã của eukaryote nhưng thường có sự glycosyl hóa quá mức với chiều dài chuỗi carbonhydrate gắn vào protein rất lớn, từ 50-100 phân tử mannose. Điều này làm tăng cao khối lượng phân tử của protein và đồng thời gây nên tính kháng nguyên ở các protein tái tổ hợp. Ngoài ra, quá trình N- glycosyl hóa ở S.cerevisiae luôn có chứa các liên kết α-1,3 glycan ở các đầu kết thúc. Các liên kết này có tính kháng nguyên cao nên cũng góp phần làm