M Ở ĐẦU
2.2.6 Phương pháp xác định hằng số Michaelis (Km)
v Nguyên tắc:
Khi một cơ chất S gắn với vị trí hoạt động của enzyme E, một phức hợp trung gian ES được hình thành. Trong quá trình chuyển đổi, cơ chất được chuyển thành sản phẩm. Sau một thời gian ngắn, thì sản phẩm tách ra khỏi enzyme. Quá trình này có thể được tóm tắt như sau:[5] Với: k1: hằng số tốc độ hình thành ES k2: hằng số tốc độ phân ly ES E + S E S E + P k1 k2 k3
Luận Văn Thạc Sĩ Trang57 Vật liệu &Phương pháp
k3: hằng số tốc độ hình thành sản phẩm và giải phóng vị trí hoạt động của enzyme
Hằng số Michaelis (Km):
Phương trình Michaelis- Menten:
Từ phương trình trên cho biết Km là hằng số đặc trưng cho phản ứng. Km phản ánh ái lực giữa enzyme và cơ chất, nghĩa là Km càng thấp thì ái lực giữa enzyme và cơ chất càng mạnh và ngược lại.
Km = nồng độ cơ chất [S] khi V= ½ Vmax
Đồ thị phương trình Michaelis – Menten là một Hyberbol:
Hình 2.3: Đồ thị phương trình Michaelis Menten [51]
Tuy nhiên để quá trình tính toán được chính xác hơn người ta thường sử dụng phương trình Lineweaver-Burk, là dạng nghịch đảo của phương trình Michaelis-Menten.
V = Vmax[S] [S] + Km Km = k2 + k3 k1 1/2Vmax
Luận Văn Thạc Sĩ Trang58 Vật liệu &Phương pháp
Phương trình Lineweaver-Burk:
Đồ thị là dạng đường thẳng: y = ax +b
Hình 2.4: Đồ thị phương trình Lineweaver Burk [51]
v Cách thực hiện:
Enzyme phytase tái tổ hợp sau khi qua sắc ký lọc gel, đem tủa với cồn 96o, ly tâm, hòa tan trong đệm Na-Acetate pH 5.5. Sau đó làm phản ứng với cơ chất Natri phytate có nồng độ khác nhau: 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25mM. Ứng với mỗi nồng độ cơ chất được khảo sát ở các thời gian khác nhau: 10, 15, 30, 45, 60 phút, thực hiện phản ứng ở 37o
C.
Xác định hoạt tính enzyme.
Ở mỗi nồng độ cơ chất chọn một giá trị hoạt tính cao nhất làm giá trị V. Từ đó dùng chương trình Sigma plot 10.0 để vẽ đồ thị Lineweaver – Burk theo nồng độ cơ chất [S] và giá trị hoạt tính V tương ứng, như hình2.4. Từ đó xác định được Km và Vmax.
Km Vmax 1 V = . 1 [S] + 1 Vmax [S]
Luận Văn Thạc Sĩ Trang59 Vật liệu &Phương pháp
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase: Của các chủng GS115/ phyAI và GS115/ phyB đã biến nạp của phòng Vi Sinh Ứng Dụng GS115/ phyAI và GS115/ phyB đã biến nạp của phòng Vi Sinh Ứng Dụng của Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Sử dụng môi trường MM-Canxi phytat (Minimal Methanol – Histidine-Canxi phytat).
v Nguyên tắc:
MM – canxi phytate là môi trường có nguồn cacbon duy nhất là methanol và được bổ sung một hàm lượng nhỏ canxi phytate để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase của P. pastoris biến nạp. Vì gen phyAI, phyB được tạo dòng sau promoter AOX trên vector biểu hiện nên cần cảm ứng khả năng sinh enzyme phytase của chủng nấm men biến nạp bằng methanol. Methanol được bổ sung vào môi trường 24 giờ/lần, mỗi lần bổ sung 100 µl/đĩa để cung cấp nguồn cacbon cho nấm men phát triển. Chủng nấm men biến nạp sinh tổng hợp enzyme phytase và tiết vào môi trường nuôi thông qua trình tự tín hiệu tiết trên vector biểu hiện, phytase sẽ phân giải canxi phytate và tạo vòng phân giải làm trong môi trường.
Quá trình làm:
Giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB từ môi trường thạch nghiêng, được cấy sang môi trường YPD lỏng, nuôi lắc trong 24 giờ. Sau đó lấy giống từ canh trường YPD lỏng cấy vào môi trường MM-canxi phytate. Bổ sung methanol (100 µl/đĩa) mỗi 24 giờ. Nuôi trong 4 ngày, quan sát vòng phân giải và chụp hình.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang60 Vật liệu &Phương pháp
2.3.2 Khảo sát các điệu kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, lên men thu nhận phytase tái tổ hợp men thu nhận phytase tái tổ hợp
2.3.2.1 Tỷ lệ giống
- Giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB được hoạt hóa trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi hoạt hóa, hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng với tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%(v/v), cấy vào môi trường BMGY, nuôi lắc trong 24 giờ.
- Xác định tế bào trong 1ml dịch môi trường tăng sinh Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 101
, 102, 103, 104, 105 trong các eppendof. Dùng phòng đếm hồng cầu để đếm số tế bào nấm men.
Hút 50ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào phòng đếm hồng cầu. Quan sát trên kính hiển vi và đếm số tế bào nấm men có trong 5 ô lớn.
Công thức tính số lượng tế bào nấm men có trong 1ml môi trường
Số tế bào = a x 5 x 104 x n(CFU/ml) Với:
a : Số tế bào trung bình trong một ô lớn n : Độ pha loãng
104 : thể tích của một ô nhỏ (mm3 ) 5 : Số ô lớn được chọn để đếm tế bào
- Giống sau khi được nuôi trong môi trường BMGY, ly tâm và chuyển vào môi trường BMMY, nuôi lắc trong 4 ngày. Có bổ sung methanol với lượng 2%(v/v) mỗi 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy trong môi trường BMMY, dịch nuôi cấy được ly tâm, lọc. Lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng
Luận Văn Thạc Sĩ Trang61 Vật liệu &Phương pháp
protein và hoạt độ chung. Xác định tỷ lệ giống nào cho hoạt độ phytase cao nhất.
2.3.2.2 Thời gian nuôi cấy
- Hoạt hóa giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng cấy vào môi trường BMGY (với tỷ lệ giống như đã được khảo sát ở mục 3.2.1), nuôi lắc trong 24h.
- Giống sau khi được nuôi trong môi trường BMGY, ly tâm và chuyển vào môi trường BMMY, nuôi lắc trong 5 ngày. Có bổ sung methanol với lượng 2%(v/v) mỗi 24giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy trong môi trường BMMY, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ đều lấy dịch nuôi cấy đi ly tâm và lọc. Lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng protein và hoạt độ chung của phytase. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp nhất, cho hoạt độ phytase cao nhất.
2.3.2.3 Môi trường nuôi cấy
- Hoạt hóa giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng, cấy vào môi trường BMGY và môi trường Nước giá-Glycerol, nuôi lắc trong 24 giờ.
- Giống sau khi được nuôi trong môi trường BMGY và môi trường Nước giá-Glycerol, ly tâm và chuyển môi trường BMMY và môi trường Nước giá-Methanol, nuôi lắc trong 4 ngày. Có bổ sung methanol với lượng 2%(v/v) mỗi 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy trong môi trường BMMYvà môi trường Nước giá-Methanol, dịch nuôi cấy được ly tâm, lọc. Lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng protein và hoạt độ chung
Luận Văn Thạc Sĩ Trang62 Vật liệu &Phương pháp
phytase. Vẽ đồ thị tương quan giữa hai loại môi trường và hoạt độ chung phytase để xác định môi trường nào sẽ cho hoạt độ phytase cao.
2.3.2.4 Lượng methanol bổ sung trong quá trình nuôi cấy
- Hoạt hóa giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng cấy vào môi trường BMGY, nuôi lắc trong 24 giờ.
- Giống sau khi được nuôi trong môi trường BMGY, ly tâm và chuyển vào môi trường BMMY, nuôi lắc trong 4 ngày. Có bổ sung methanol với các lượng khảo sát là 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%(v/v) mỗi 24giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy trong môi trường BMMY, dịch nuôi cấy được ly tâm, lọc. Lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng protein và hoạt độ chung phytase. Từ đó kết luận lượng methanol tối ưu bổ sung trong quá trình nuôi cấy để cho hoạt độ phytase cao.
2.3.2.5 Nồng độ K3PO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy
- Hoạt hóa Giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng cấy vào môi trường BMGY có nồng độ K3PO4 lần lượt là 50mM, 75mM, 100mM, 125mM và 150mM, nuôi lắc trong 24 giờ.
- Giống sau khi nuôi trong môi trường BMGY, ly tâm và chuyển vào môi trường BMMY cũng có nồng độ phosphate lần lượt là 50mM, 75mM, 100mM, 125mM và 150mM, nuôi lắc trong 4 ngày. Có bổ sung methanol với lượng 2%(v/v) mỗi 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy trong môi trường BMMY, dịch nuôi cấy được ly tâm, lọc. Lấy dịch lọc đem đi xác định hàm lượng
Luận Văn Thạc Sĩ Trang63 Vật liệu &Phương pháp
protein và hoạt độ chung phytase. Từ đó kết luận được nồng độ photphat thích hợp để bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
2.3.3 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa
- Các giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB cũng được hoạt hóa trong môi trường YPD trong 24 giờ, sau đó cấy sang môi trường BMGY nuôi 24 giờ, ly tâm chuyển qua môi trường BMMY, nuôi lắc trong 4 ngày có bổ sung 2%(v/v) methanol mỗi 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, lọc, thu nhận dịch lọc chứa phytase, tiến hành tủa với cồn 960 tỷ lệ 1:2, 1:3, 1:4, aceton tỷ lệ 1:2, muối ammonium sulfate 23.6g/50ml dịch lọc.
- Sau khi tủa, để ở tủ lạnh trong 3h, ly tâm thu tủa, cân lượng tủa thu được.
- Lấy tủa thu được hòa tan vào 10ml đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5, đem xác định hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ riêng phytase.
- So sánh và kết luận tác nhân tủa nào tốt đối với quá trình tủa phytase tái tổ hợp thu được.
2.3.4 Xác định hiệu suất của quá trình nuôi cấy thu nhận phytase từ hai chủng GS115/phyAI và GS115/phyB
Sử dụng các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.2 và 2.3.3 để nuôi cấy, ly tâm thu nhận canh trường chứa phytase, tủa và sấy chân không để thu nhận phytase thô (dạng bột).
v Cách thực hiện:
- Giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB được hoạt hóa trong môi trường YPD lỏng trong 24 giờ.
- Sau thời gian nuôi hoạt hóa, hút dịch nuôi cấy trong môi trường YPD-lỏng cấy vào các bình erlen 250ml chứa 50ml môi trường BMGY (với tỷ lệ giống như đã được khảo sát ở mục (2.3.2.1), nuôi lắc trong 24 giờ.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang64 Vật liệu &Phương pháp
- Giống sau khi được nuôi trong môi trường BMGY, ly tâm và chuyển vào các bình erlen 500ml chứa 200ml môi trường BMMY, nuôi lắc trong thời gian như đã khảo sát. Có bổ sung methanol mỗi 24 giờ với lượng thích hợp từ kết quả khảo sát ở mục (2.3.2.2)
- Lấy dịch nuôi cấy trong môi trường BMMY đi ly tâm, lọc. Lấy toàn bộ dịch lọc đem đi tủa với tác nhân tủa tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.3. Sau đó đem đi ly tâm lạnh, lấy tủa, sấy chân không ở 40oC đến khi enzym khô, cân lượng enzym khô thu được. Lấy 0.5g enzym khô hòa tan trong 5ml đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5 đem đi xác định hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ riêng của phytase thu nhận được. Tính hiệu suất nuôi cấy.
2.3.5 Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt độ phytase[45],[46] 2.3.5.1 Khả năng bền với nhiệt của phytase tái tổ hợp thu nhận
được
- Lấy enzym khô thu nhận được hòa tan vào đệm Na- Acetate 0.2M, pH 5.5 sau đó cho vào các ống nghiệm thủy tinh 10ml, mỗi ống 3ml dịch enzym.
- Đem đi ủ trong bồn ổn nhiệt ở các nhiệt độ 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90oC trong 10 phút và 15 phút.
- Đem xác định hoạt độ chung của phytase. Vẽ đồ thị tương quan giữa nhiệt độ và %hoạt độ chung/Hđ ở 30oC. Từ đó kết luận sự bền với nhiệt độ của phytase tái tổ hợp thu nhận được.
2.3.5.2 Ảnh hưởng của pH
- Lấy enzym khô thu nhận được hòa tan vào các loại đệm có các pH khác nhau: đệm Glycine 0.2M, pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, đệm Na-Acetate 0.2M, pH 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, đệm Tris- HCl 0.2M pH 7.0, 7.5, 8.0.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang65 Vật liệu &Phương pháp
- Đem xác định hoạt độ chung. Vẽ đồ thị tương quan giữa các giá trị pH và %hoạt độ chung/Hđmax của phytase. Từ đó kết luận được pH tối ưu của phytase tái tổ hợp thu nhận được.
2.3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại
- Lấy enzym khô thu nhận được hòa tan vào đệm Na- Acetate 0.2M, pH 5.5, bổ sung dung dịch các muối có các ion kim loại: Mn2+, Mg2+, Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+, EDTA, sao cho nồng của các ion kim loại trong dịch phản ứng đạt 1mM/ml và 5mM/ml, lắc đều, để 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đem xác định hoạt độ chung và %HđC/Hđ đối chứng. Từ đó kết luận những ion kim loại có ảnh hưởng lên hoạt độ phytase tái tổ hợp thu nhận được.
2.3.5.4 Nhiệt độ tối ưu (topt) của enzym phytase thu nhận được
Enzym thô sau khi thu nhận được, hòa tan trong dung dịch đệm Na-Acetate 5,5, đem ủ với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60oC, trong 15 phút, ngừng phản ứng với TCA 15%, đem xác định lượng phospho phóng thích ra, tính hoạt độ enzyme.
Vẽ đồ thị tương quan giữa nhiệt độ và %hoạt độ chung/Hđmax của enzyme để tìm ra nhiệt độ tối ưu của enzym phytase tái tổ hợp thu nhận được.
2.3.6 Tinh sạch enzym phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc gel[1],[6]
Enzym phytase thu được sau khi tủa bằng cồn 96o, hòa tan trong đệm có pH thích hợp (khảo sát ở phần 2.3.5.2).
Đem đi chạy sắc ký lọc gel theo phương pháp đã trình bày ở phần
Luận Văn Thạc Sĩ Trang66 Vật liệu &Phương pháp
Thu nhận các peak đem xác định hàm lượng protein và hoạt độ của từng peak và chạy điện di SDS-PAGE.
Tính hiệu suất của quá trình sắc ký.
2.3.7 Điện di SDS-PAGE[1],[11]
Phytase tái tổ hợp sau khi thu nhận và tủa bằng cồn 96o, hòa tan trong đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5, và các peak thu nhận được qua sắc ký lọc gel, tiến hành chạy điện di SDS-PAGE như đã trình bày ở mục
2.2.3.
Xác định trọng lượng phân tử của các phytase thu được. Chụp hình điện di đồ.
2.3.8 Khảo sát các đặc tính của phytase thu được sau khi qua sắc ký lọc gel
2.3.8.1 Khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian để tìm ra giá trị Km (hằng số Michaelis) của enzym trị Km (hằng số Michaelis) của enzym
Na-phytate pha trong đệm Na-Acetate 0,2M, pH 5,5, ở các nồng độ 0,05- 0,10- 0,15- 0,20- 0,25mM/ml
Enzym phytase sau khi qua lọc gel, cho phản ứng với các nồng độ Na-phytate (cơ chất) khác nhau như đã trình bày ở mục
2.2.6.
2.3.8.2 Xác định Km (hằng số Michaelis) của phytase tái tổ hợp thu nhận được sau lọc gel hợp thu nhận được sau lọc gel
Từ việc khảo sát nồng độ cơ chất theo thời gian ở mục
2.3.8.1, dùng chương trình Sigma plot 10.0 để vẽ đồ thị Lineweaver-Burk suy ra được giá trị Km và Vmax của enzyme phytase tái tổ hợp thu nhận được.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang67 Vật liệu &Phương pháp
HVTH: Lê Thị Ngọc Sương CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh 2.4 Tóm tắt qui trình thu nhận phytase tái tổ hợp
MT YPD MT BMGY GS115 /phyAI (phyB) (thạch nghiêng) Hoạt hóa giống Tiếp tục lên men (4 ngày) MT YPD MT BMGY Nhân giống MT BMMY Lên men Ly tâm, lọc Dịch phytase thô Cồn 96o Tủa enzym Ly tâm, sấy Xác định hàm lượng protein, hoạt độ chung Bổ sung methanol
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 67 Kết quả & Biện luận C Chhưươơnngg 33:: K KẾẾTT QQUUẢẢ & & B BIIỆỆNN LLUUẬẬNN
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 68 Kết quả & Biện luận
3.1 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase của các giống Pichia pastoris GS115/phyAI (phytase-PAI) và Pichia pastoris GS115/phyB
(phytase-PB)
Các giống GS115/ phyAI và GS115/ phyB từ bình đông khô, được hoạt