M Ở ĐẦU
1.2.7Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Ion kim loại cho thấy có khả năng điều chỉnh hoạt tính phytase. Tuy nhiên, khó xác định ảnh hưởng của các kim loại, do chúng liên kết trực tiếp với enzyme hoặc liên kết với acid phytic tạo thành hợp chất khó tan, vì vậy, làm giảm độ hoạt động của cơ chất hoặc enzyme.
Ảnh hưởng của các ion kim loại không giống nhau đối với mỗi phytase. Hoạt tính của phytase A. fumigatus bị giảm 50% do ảnh hưởng của EDTA. Nhưng EDTA không ảnh hưởng đến hoạt tính của phytase có nguồn gốc từ A. niger, A. terrus,E. nidulans.[26]
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 21 Tổng quan tài liệu
1.2.7.2 Canxi và tỷ lệ Canxi/phospho:
Sự thủy phân của phytase tỉ lệ nghịch với lượng canxi. Nói rộng ra, tỉ lệ canxi/photpho ức chế hoạt tính và làm giảm hiệu lực của phytase. Trong thức ăn chế biến, phytase bổ sung vào không thúc đẩy sự sử dụng phospho-phytate khi có canxi với nồng độ 1%. Do đó, trong thức ăn có phytase, nên giảm lượng canxi còn khoảng 0.6% tới 0.75%.[26]
1.2.7.3 Nồng độ cơ chất:
Nồng độ cơ chất cao, dẫn đến nhóm photphat có thể tác động cục bộ vào trung tâm xúc tác của enzyme. Điều này làm ức chế sự chuyển của phức hợp enzyme-cơ chất thành enzyme và sản phẩm (Ullah và Phillippy, 1994). Mặt khác sự ức chế còn dẫn tới sự hình thành phức hợp phytate-protein khó tan.
Nồng độ cơ chất khoảng 300µmol ức chế các enzyme giống phytase có nguồn gốc từ Paramecium (Freund và cộng sự, 1992). Phytase từ Kleibsiella sp. và Rhizopus oligosus bị ức chế khi nồng độ cơ chất cao (Shaa và Parekh, 1990; Sutardi và Buckle, 1998). Phytase nấm mốc bị ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1mM (Ullah, 1998).[43],[44].
1.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase: 1.2.8.1 Nguồn cacbon: 1.2.8.1 Nguồn cacbon:
Nguồn cacbon và nồng độ tối ưu là yếu tố quan trọng trong sản xuất phytase. Glucose là nguồn cacbon phổ biến nhất. Glucose 1% là nồng độ tối ưu cho Lactobacillus amylovorus (Sreeramulu và cộng sự, 1996) và Enterobacter sp. 4 (Yoon và cộng sự, 1996). Sản xuất phytase từ Bacillus subtilis dùng glucose 2%(Kerovuo và cộng sự, 1998). Cám lúa mì 6% là nguồn cacbon tốt khi sản xuất phytase từ Bacillus sp (Kim và cộng sự, 1998) trong khi Pseudomonas sp. tăng trưởng và sản xuất tốt trên myo-inositol (0.2%)(Irving và Cosgrove, 1971).
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 22 Tổng quan tài liệu
Sự tổng hợp phytase không tăng khi có sodium phytate trong môi trường với nồng độ 1mM. Tuy nhiên, Klebsiella aerogenes sinh phytase nhiều nhất khi nguồn cacbon làsodium phytate (2%).[40]
Đối với nấm mốc, malt và dịch chiết nấm men được dùng để sản xuất phytase (Shieh và Ware, 1968). Khi dùng cacbon đơn giản là glucose hay sucrose, các tơ nấm kết lại với nhau làm giảm năng suất phytase của A. niger NRRL 3135. Sản xuất phytase từ Aspergillus ficuum trên môi trường rắn, sử dụng cơ chất là bột Canola có bổ sung glucose 5.2% làm gia tăng lượng phytase sinh ra.[40]
1.2.8.2 Nguồn nitơ [43]
Nguồn nitơ trong môi trường là một yếu tố cũng quan trọng không kém, nó ảnh hưởng sự tăng trưởng và quá trình sinh tổng hợp enzyme. Trong sản xuất phytase, người ta thường dùng nguồn nitơ hữu cơ như peptone. Ví dụ như peptone (1%) là nguồn nitơ khi lên men phytase từ Aerobacter aerogenes (Greaves và cộng sự, 1967), và K. oxytoca dùng dịch chiết nấm men (1%) (Jareonkitmongkol và cộng sự, 1997). Nguồn nitơ vô cơ như amonium sulphate (0.1%) dùng sản xuất phytase từ Pseudomonas sp. (Irving và Cosgrove, 1971), Enterobacter
sp. 4 (Yoon và cộng sự, 1996), và S. castellii (Lambrechts và cộng sự, 1992). Sản xuất phytase từ B. subtilis, Powar và Jagannathan (1967) dùng N2 là nguồn nitơ. Đối với A. adeninivorans, nguồn nitơ là dịch chiết nấm men (1%) và peptone (1%) (Sano và cộng sự, 1999).
1.2.8.3 Vitamin và các nguyên tố vi lượng :
Bên cạnh nguồn cacbon và nitơ, một vài vi sinh vật cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng và vitamin cho sự tăng trưởng và sản xuất phytase. Sản xuất phytase từ nấm men, môi trường sàng lọc gồm có vitamin và các nguyên tố vi lượng (Galzy, 1964; Segueilha và cộng sự, 1992). Đối với Bacillus subtilis (Powar và Jagannathan, 1967),
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 23 Tổng quan tài liệu
1993), cũng như nấm mốc như A. niger ATCC 9142 và A. ficuum
NRRL 3135 (Shieh và Ware, 1968), sự sản xuất phytase không cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng.[28]
1.2.8.4 Tỷ lệ cacbon/photpho:
Sự tổng hợp phytase chịu ảnh hưởng bởi nồng độ photphat là một hiện tượng chung, được quan sát ở các loài nấm mốc và nấm men sinh phytase. Phytase được sản xuất khi photphat vô cơ bắt đầu cạn kiệt, sự giới hạn photphat vô cơ trong môi trường sẽ cảm ứng sinh phytase, tuy nhiên, bị phụ thuộc vào tổng lượng cacbon có mặt trong môi trường.
Aspergillus ficuum NRRL 3135 sản xuất phytase có hoạt tính nhiều nhất khi nồng độ photphat vô cơ thấp hơn 0.004% (w/ V) trong môi trường chứa 8% (w/ V) bột bắp.[27]
Hàm lượng photpho trong ngũ cốc cao làm kìm hãm khả năng sinh tổng hợp phytase của nấm mốc. Còn khi nồng độ photpho trong môi trường ở mức thấp, sư tăng trưởng của sợi nấm tốt và sự sản xuất phytase đạt tối đa. Khi tăng lượng photphat vào môi trường, nấm mốc tăng trưởng mạnh nhưng lượng phytase sinh ra giảm đáng kể.
1.2.9 Ứng dụng của enzyme phytase
1.2.9.1 Ứng dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, gia cầm [40],[41]
Phytate chiếm từ 60- 80% photpho thực vật, nhưng cơ thể không hấp thu được lượng phytate này vì không có phytase, kể cả các chất dinh dưỡng khoáng cũng không được hấp thu. Phytase được bổ sung trong thức ăn dành cho gia cầm, lợn và cá có tác dụng cải thiện hiệu quả sử dụng photpho, khoáng chất, acid amin và năng lượng, giúp cho cơ thể động vật hấp thu tốt lượng phytate trong nguồn thức ăn.[40]
Có thể dùng các phytase có nguồn gốc khác nhau để bổ sung vào thức ăn động vật. Tuy nhiên, phytase thực vật thì hạn chế hơn do hàm lượng biến thiên, bị bất hoạt ở nhiệt độ hơn 70°C (Pointillart,
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 24 Tổng quan tài liệu
1988). Đồng thời, hiệu quả sinh học của phytase ngũ cốc chỉ 40% so với phytase vi sinh vật từ loài Aspergillus (Zimmermann, 2002). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phytase sản xuất bởi vi sinh vật phân hủy phytate thực vật hầu như hoàn toàn đối với động vật nhai lại (Rodehutscord, 2001). Mặt khác, bổ sung phytase vi sinh vật thay cho photpho vô cơ, vào thức ăn còn làm giảm mạnh sự bài tiết photpho của động vật dạ dày đơn. Tùy vào thực đơn, giống, và mức bổ sung phytase, sự bài tiết photpho có thể giảm từ 25 đến 50% (Kornegay, 1999).
Bổ sung phytase vi sinh vật vào thực đơn của động vật không nhai lại cũng cải thiện tính hiệu quả của các ion Ca2+, Mg2+ (Wall và cộng sự, 1991), và vài nguyên tố vi lượng như kẽm (Thiel và Weigvà, 1992), đồng (Adeola, 1999), sắt (Pallauf và cộng sự, 1992), và mangan (Mohanna và Nys, 1999).
Phytase vi sinh vật cũng có thể tăng cường tiêu hóa protein do phytase phân hủy các phức hợp phytate-protein, phytate-acid amin và phức hợp phytate-khoáng chất-protein. Hơn nữa, phytate ức chế enzyme phân hủy protein (Caldwell, 1992), và ức chế amylase (Deshpvàe và Cheryan, 1984)
Ngày nay, phytase vi sinh vật được sản xuất trên qui mô lớn với chi phí thấp và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thức ăn chăn nuôi.
1.2.9.2 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Chế biến và sản xuất thực phẩm cho con người cũng là một lĩnh vực ứng dụng của phytase. Phytase làm giảm hoàn toàn acid phytic trong quá trình sản xuất các thức ăn từ bột gạo, lúa mì, bắp, yến mạch, cây lúa miến, hỗn hợp bột lúa mì-bột đậu nành (Hurrell, 2003). Thí nghiệm trên ngũ cốc porridge có mức phytate có sẵn nằm trong khoảng từ 0.12% (lúa mì porridge) và 0.89% (lúa miến porridge). Sau khi xử lý
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 25 Tổng quan tài liệu
với Phytase, hàm lượng acid phytic giảm còn ≤ 0.002 %. Đồng thời, sự hấp thu sắt tăng đáng kể.[40]
Phytase nấm được bổ sung trong sản xuất bánh mì có tác dụng giảm thời gian lên men mà không ảnh hưởng đến độ pH của bột nhồi bánh, làm tăng thể tích bánh mì và sự cải thiện kết cấu vụn bánh (Haros, 2001)
1.2.9.3 Ứng dụng trong công nghệ tổng hợp myo-inositol
phosphate[23],[28],[40]
Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay. Trong nghiên cứu, Svàberg (1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5) có tác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt. Thêm 10mg photpho như IP5 làm giảm sự hấp thu sắt đến 39%. IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được cho cùng với IP5 và IP6. Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu, nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3.
Mặt khác, các ester myo- inositol có ít Photpho (mono, bis, tris, và tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật (Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996, Krystofova, 1994).
Các phosphate inositol có thể tổng hợp hóa học hoặc tổng hợp bằng enzyme. Tuy nhiên, cơ chế tổng hợp hóa học của inositol phosphate (Billington, 1993) phức tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao. Trái lại, tổng hợp bằng enzyme phytase thực hiện trong điều kiện ôn hòa, có hiệu quả lớn trong việc sản xuất. Siren (1986) sản xuất thành công D-myo-inositol 1,2,6 trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 26 Tổng quan tài liệu
trisphosphate, L-myo-1,3,4 trisphosphate, và myo-inositol-1,2,3 trisphosphate với sự trợ giúp của phytase có nguồn gốc từ S. cerevisiae. Tương tự, phytase phân lập từ A. niger phân giải IP6 thành các dẫn xuất có mức photpho hóa thấp từ IP5 đến IP2 phụ thuộc vào lượng enzyme (Dvorakova, 2000)
1.2.10Các nghiên cứu về phytase ở Việt Nam:
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về phytase, chỉ có một số nghiên cứu như:
- Nghiên cứu của Lê Quốc Phong, 2007, Nghiên cứu một số đặc tính và bước đầu thử nghiệm ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN. Trong luận văn này tác giả thu nhận phytase của các chủng Bacillus spp, trong đó có chủng BS12, tác giả đã thu được phytase có hoạt độ chung khoảng 60UI/ml ( đơn vị UI là lượng enzyme cần để phóng thích 1nmolP/phút ở điều kiện phản ứng).
- Nghiên cứu của Phạm Tấn Việt, 2007, Hiệu quả của chế phẩm enzyme phytase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus sp. Đối với sự tăng trưởng của chuột nhắt trắng Mus Musculus, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHKHTN.
Trên thị trường hiện nay có một số các sản phẩm thương mại của phytase thu nhận từ tự nhiên như: Natuphos phytase (là sản phẩm được điều chế từ 3-phytase (EC 3.1.3.8) thu nhận từ A. niger (CBS 101.672)), Ronozyme (phytase thu nhận từ E. coli), …
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 27 Tổng quan tài liệu
1.3 Nấm men Pichia pastoris
1.3.1 Phân loại và đặc điểm chung [13]
Theo Phaff năm 1956, Pichia pastoris được phân loại như sau: Giới: Fungi Ngành : Ascomycota Dưới ngành: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Pichia
Loài: Pichia pastoris.
Hình 1.5: Hình thái của nấm men Pichia pastoris [51].
Pichia pastoris là loài nấm men có khả năng sử dụng hợp chất 1carbon mang tính khử như methanol, hay methane, tăng trưởng ở nhiệt độ 30-32o
C, pH 3-7.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 28 Tổng quan tài liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Koichi Ogata là người đầu tiên mô tả khả năng của những loài nấm men có thể sử dụng methanol như một nguồn carbon và năng lượng duy nhất vào 30 năm trước đây.
Trong suốt những năm 1970, công ty Phillips Petrolenum đã phát triển môi trường và qui trình để nuôi Pichia pastoris nhằm sản xuất protein đơn bào trên môi trường chứa methanol trong nuôi cấy liên tục ở mật độ cao. Tuy nhiên, cuộc khủng hoảng dầu mỏ trong thập niên 70 của thể kỷ trước làm giá methanol tăng cao, vì thế giá trị kinh tế của những protein đơn bào sản xuất từ methanol không đáp ứng về mặt kinh tế.[21]
Trong những thập niên sau, Phillips Petroleum đã hợp tác với Viện kỹ thuật sinh học (hay công nghệ sinh học) Salk, Inc. (SIBIA, La Jdla, CA) để phát triển p. pastoris thành hệ thống biểu hiện protein ngoại lai. Những nhà nghiên cứu ở SIBIA đã tách chiết gen, promoter alcohol oxidase và tạo những véctơ, chủng, cũng như qui trình thao tác gen của P. pastoris. Sự kết hợp của qui trình lên men để sản xuất protein đơn bào và promoter AOX mạnh được điều hòa chặt chẽ đã làm tăng mức biểu hiện protein ngoại lai một cách đáng kinh ngạc. Năm 1993, Phillips Petroleum cấp giấy phép cho Invitrogen để thương mại hóa những thành phần của hệ thống biểu hiện dựa trên P. pastoris.[13]
1.3.2 Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
Pichia pastoris được xem là một hệ thống biểu hiện có nhiều ưu điểm vượt trội. Hệ thống biểu hiện này đã được nghiên cứu sâu và dễ thao tác, ngoài ra còn cho phép sản xuất các protein tái tổ hợp với năng suất cao. Những yếu tố góp phần giúp cho hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris ngày càng được ứng dụng rộng rãi gồm có:
· Pichia pastoris là nấm men đơn bào nên dễ thao tác và nuôi cấy. P. pastoris có khả năng tăng trưởng hiếu khí mạnh, nhờ đó đơn giản hóa việc nuôi cấy, mật độ tế bào cao. Mật độ tế bào có thể lên đến gấp 10 lần của
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 29 Tổng quan tài liệu
· Bên cạnh đó các kĩ thuật cần cho thao tác di truyền phân tử cũng tương tự với các kĩ thuật của Saccharomyces cerevisiae, một trong những hệ thống được nghiên cứu kĩ nhất.[12]
· Ngoài ra hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris còn có các promotor mạnh như là AOX1 hoặc GAPDH. Gen được điều khiển bởi các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen của Pichia pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao với hàm lượng lên đến vài gram/L. Trong đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì khả năng cảm ứng bằng methanol đem đến những thuận lợi trong việc kiểm soát biểu hiện của gen quan tâm.[47]
· Pichia pastoris còn là một loài eukaryote, do đó nó có khả năng thực hiện các biến đổi hậu dịch mã như xử lý phân cắt protein, gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide và gắn gốc đường để tạo protein hoạt động. Đây là một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện của các loài prokaryote không có được.[47]
· Việc gắn chèn thêm trình tự tiết vào trước gen quan tâm sẽ giúp protein được tiết vào môi trường, nhờ đó đơn giản hóa việc tinh sạch.
· Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú.
· Thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản không đòi hỏi các yếu tố tăng trưởng hoặc các chất bổ sung vốn đắt tiền và làm việc tinh sạch trở nên khó khăn. Quá trình lên men có thể được thực hiện nhanh chóng đáp ứng các yêu cầu lên men, các thông số ảnh hưởng đến quá trình sản xuất cũng như hoạt tính protein như pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm soát.
Hiện đã có hơn 300 protein từ rất nhiều nguồn khác nhau được biểu hiện thành công ở Pichia pastoris. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ hợp khác bằng hệ thống Pichia pastoris cũng tăng lên từng ngày.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang 30 Tổng quan tài liệu
Với những lý do trên, hệ thống biểu hiện Pichia pastoris được lựa chọn cho việc tạo dòng gen mã hóa cho phytase.
Để hiểu rõ hơn về cơ chế cảm ứng bằng methanol, hoạt động của các promoter, bằng cách nào protein được tiết ra môi trường nuôi cấy cũng như việc lựa chọn chủng chủ Pichia pastoris và vector cho biểu hiện protein, ta sẽ đi sâu vào tìm hiểu các đặc điểm liên quan đến hệ thống Pichia pastoris.
1.3.3 Biến dưỡng methanol ở P. pastoris
Pichia pastoris là một trong khoảng 12 loài nấm men thuộc 4 giống có khả năng chuyển hóa methanol. Các giống khác gồm Candida, Hansenual, Torulopsis
P. pastoris có khả năng sử dụng methanol như một nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Những nghiên cứu sinh hóa cho thấy việc sử dụng methanol cần một con đường chuyển hóa liên quan đến một vài enzyme.