M Ở ĐẦU
2.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel
v Nguyên tắc:
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách các phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ lọt vào bên trong hạt gel (pha mạng) thì bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi đó những phân tử lớn hơn nằm kẹt ở các khe hở giữa các hạt gel (pha kẽ) sẽ di chuyển nhanh hơn và được giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.[1],[6]
Những phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử càng lớn thì ra càng nhanh. Ngược lại phân tử có kích thước và trọng lượng phân tử càng nhỏ thì ra càng chậm. Vì vậy, có thể ví việc tách các chất bằng gel như là một quá trình sàng lọc phân tử.[6]
Trong phần này chúng tôi sử dụng chất mang là Biogel P-100 của hãng Bio-Rad. Biogel P-100 là dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90nm, khả năng ngậm nước là 12ml/g gel khô, phạm vi phân tách là 5.000-150.000 daltons.
Luận Văn Thạc Sĩ Trang54 Vật liệu &Phương pháp
Hình 2.2: Hệ thống sắc ký lọc gelBiologic LP (Bio-Rad).
v Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch đệm Na-Acetate 0.2M, pH 5.5. Đuổi khí trong 90 phút, bảo quản trong tủ lạnh (4oC).
- Pha gel: cân 8g gel (Biogel P100), cho vào becher 500ml, cho nước cất vào gần đầy cốc, để 24h cho gel trương nở hoàn toàn, đổ bỏ lớp gel nổi bên trên, thêm nước cất đến 2/3 cốc, đuổi khí trong 60 phút.
- Chuẩn bị cột: cột được rữa sạch, để khô, sục khí khoảng 2-3h. - Nhồi cột: sau khi đã chuẩn bị cột xong, cho từ từ gel lên cột để tránh tạo bọt khí, cho gần đầy cột rồi để yên cho gel lắng. Sau đó cho thêm gel đến khi lượng gel được 2/3 cột. Lắp cột gel vào hệ thống và cho chạy rửa cột khoảng 30 phút với đệm Na-Acetate pH 5,5 (đã chuẩn bị ở trên).
Luận Văn Thạc Sĩ Trang55 Vật liệu &Phương pháp
- Chuẩn bị mẫu: Hòa tan enzym (đã tủa bằng cồn 96o) trong đệm Na-Acetate 0,2M, pH 5,5. Xác định hàm lượng protein và hoạt độ chung và hoạt độ riêng của mẫu.
- Chạy lọc gel: sau khi chạy rửa cột, bơm 2ml mẫu vào vị trí chứa mẫu, chọn chương trình (phân đoạn 2ml, tốc độ dòng là 0,16ml/ phút). Bắt đầu hứng dịch ra khỏi cột trong các ống nghiệm sạch, khô, có đánh số. Theo dõi màng hình của máy vi tính để biết các peak, đến khi không còn lên peak nữa thì dừng. Chuyển qua chạy rửa cột và tiếp tục chạy mẫu khác.
Đổ các ống của cùng một peak chung lại với nhau và xác định hàm lượng protein, hoạt độ chung và hoạt độ riêng của phytase, tính hiệu suất chạy điện di SDS-PAGE.
Sau khi xác định hết các chi tiêu trên, lấy dung dịch enzym sau khi qua cột đem tủa lại với cồn 96o, ly tâm, hòa tan lại với một ít đệm Na-Acetate pH 5.5, để xác định hằng số Michaelis (Km).