Nghiên cứu thu nhận hợp chất thuộc nhóm STILBENE có hoạt tính kháng oxi hóa từ rễ tơ cây đậu phộng ( arachis hypogaea l )

Vì vậy, trong những năm gần đây nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học... Những chủng vi

đôi lúc tưởng rằng không thể tiếp tục, nhưng may mắn có được sự động viên của ba

mẹ, sự quan tâm, dìu dắt của các anh chị, thầy cô và sự giúp đỡ của bạn bè, em nhỏ

đã cho tôi nguồn sức mạnh to lớn để tiếp tục hoàn thành đề tài của mình Và sẽ không có tôi ngày hôm nay nếu không có mọi người luôn bên cạnh, tôi xin gửi đến

tất cả lời cảm ơn chân thành

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin dành cho ba mẹ - người đã sinh ra và nuôi dạy tôi nên người Con cảm ơn ba mẹ vì trong bất kỳ hoàn cảnh nào ba mẹ luôn là chỗ dựa

vững chắc giúp con có đủ nghị lực và sức mạnh để vượt qua khó khăn, trở ngại Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Bùi Văn Lệ, cảm ơn thầy đã truyền

niềm đam mê, nhiệt huyết với khoa học đặc biệt là sinh hóa thực vật thông qua

những bài giảng cho con ở giảng đường đại học Thầy đã tận tình hư ớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để con thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths Quách Ngô Diễm Phương, chị là người hướng dẫn, cung cấp những kiến thức, kỹ thuật sinh hóa thực vật, đưa ra ý tư ởng,

dẫn dắt và luôn đồng hành cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tiếp đến, tôi kính gửi lời cảm ơn đến cô Cung Hoàng Phi Phượng, thầy Kiều Phương Nam, anh Bùi Xuân Sơn, anh Nguyễn Hữu Hoàng, em Nguyễn Hoài Nguyên và các em 07CS chuyên ngành Nông nghiệp đã luôn hỗ trợ và chia sẽ với tôi những lúc khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi cảm ơn các thành viên 05CS Nông nghiệp, cảm ơn FAMI, các anh chị lớp Hóa Sinh K19 và những người bạn thân đã luôn đ ộng viên và hỗ trợ Minh; chân thành cảm ơn các thành viên của bộ môn Sinh hóa, bộ môn Di truyền đã luôn hỗ trợ

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2011

Hoàng Thị Thanh Minh

Mở đầu

M Ở ĐẦU

Thực vật là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho cuộc sống của con người Nó không chỉ là nguồn cung cấp lương thực cho cuộc sống thiết yếu của con người, thực vật còn là nguồn dược liệu phong phú giúp con người chữa trị bệnh tật, tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ Bên cạnh việc sử dụng thảo dược để chữa

bệnh, các nhà khoa học đã tìm nhiều phương pháp tổng hợp các hợp chất có cơ cấu tương tự các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật Tuy nhiên, các thuốc tổng hợp thường gây ra môt số tác dụng phụ Vì vậy, nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ

thực vật ngày càng gia tăng Chính vì thế giá trị của các hợp chất thứ cấp là rất cao,

mỗi kg có thể lên đến hàng triệu đô la, chẳng hạn các loại thuốc chống ung thư như vincristin, vinblastin và taxol

Trong số những hợp chất quý giá đó, hợp chất nhóm stilbene được biết đến

với nhiều giá trị trong y dược bởi các hoạt tính sinh học như tính kháng oxy hóa, ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, kháng viêm, kéo dài tuổi thọ Do

đó, nhu cầu sử dụng và thương mại hóa hợp chất nhóm stilbene đặc biệt là resveratrol tăng lên nhanh chóng, trong khi hàm lượng của nó trong tự nhiên rất

thấp Vì vậy, nghiên cứu sản xuất resveratrol từ những nguồn thay thế, ổn định, chủ động và hàm lượng cao là rất cần thiết

Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác nhân bệnh – Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc như như phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trư ởng ngoại sinh, bền

vững về mặt di truyền và tổng hợp hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc

bằng với cây mẹ, tạo sinh khối lớn Vì vậy, trong những năm gần đây nuôi cấy rễ tơ

để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

Mở đầu

Dựa trên những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận hợp chất thuộc nhóm stilbene có hoạt tính kháng oxi hóa từ rễ tơ cây đậu phộng (Arachis hypogaea

L.)” được tiến hành với mục đích nghiên cứu khả năng thu nhận hợp chất stilbene

từ rễ tơ nhằm chủ động cung cấp nguồn dược liệu cho việc sản xuất stilbene tại Việt Nam Đề tài thực hiện những nội dung chính như sau:

- Xây dựng quy trình nuôi cấy rễ tơ cây đậu phộng được cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834

- Xác định hợp chất thuộc nhóm stilbene và khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa trong các phân đoạn cao được thu nhận từ rễ tơ

- Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng hợp chất nhóm stilbene trong rễ tơ nuôi

cấy bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng

PH ẦN 1

Tổng quan tài liệu

1.1.1 V ị trí phân loại

Lớp : Magnoliopsida Phân lớp : Rosidae

Họ : Papillonneceae

Loài : Arachis hypogaea L

Tên thông thường: đậu phộng, đậu phụng, lạc, đậu nụ

Tên tiếng Anh: peanut, groundnut

Hình 1.1 Cây đậu phộng [62]

1.1.2 Ngu ồn gốc và phân bố

Đậu phộng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ (Braxin, Bôlivia, Paragoay…) Đậu phộng được trồng ở những nước nhiệt đới nóng ẩm, nóng khô

Tổng quan tài liệu

đến cận nhiệt đới và cả một số vùng ôn đới ẩm có nhiều mưa, nhất là Ấn Độ, Trung

Quốc, Nigiêria, Xênegan, Hoa Kỳ, Braxin, Thái Lan, Xu Đăng [6, 7, 51] Ở Việt Nam có bốn vùng trồng đậu phộng chính là: 1 Vùng trung du Bắc Bộ: đậu phộng được trồng trên đất bạc màu Hà Bắc, Vĩnh Phú, vụ chính tháng 2 – 4, bị hạn chế về mưa cuối vụ; 2 Vùng Bắc Trung Bộ: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, trên đ ất cát ven biển là chính; 3 Vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, trên nhiều loại đất cát, đất đỏ, đất đen; 4 Vùng Đông Nam Bộ (Tây Ninh, Đồng Nai, Sông Bé…) trên nhiều loại đất: đất đỏ bazan, đất vàng đỏ, đất đen …[6,7]

lá kèm làm thành bẹ bao quanh thân, hình dải nhọn Cụm hoa chùm ở nách lá gồm 2

- 4 hoa nhỏ, màu vàng Hoa tự thụ phấn, cuống hoa dài ra đưa hoa xuống đất và hình thành quả trong đất Quả không chia đốt hình trụ thuôn, thon lại giữa các hạt,

có vân mạng Hạt hình trứng, có rãnh dọc; vỏ lụa màu đỏ, cánh sen hay vàng,

trắng.[7]

 Rễ

Hệ thống rễ sơ khởi sẽ được thay thế bằng các rễ mới 3 ngày sau khi nảy

mầm Mặc dù chiều dài bộ rễ có thể lên đến 135 cm, chúng thường bị giới hạn trong vùng 5 đến 35 cm bên dưới mặt đất Rễ cây đậu phộng luôn cộng sinh với vi khuẩn

Bradyrhizobium trong tự nhiên.[51]

Tổng quan tài liệu

 Lá

Lá mọc xen kẽ gồm những lá kép lông chim mang 2 đôi lá chét, dài 18 – 40

mm, rộng 15 – 25 mm Lá của loài đậu phộng thân bò có nhiều lông tơ ở mặt dưới [4]

 Hoa

Cây đậu phộng là loài duy nhất trong số các cây thuần chủng có hoa trên mặt đất nhưng tạo quả và hạt bên dưới mặt đất [51] Hoa mọc thành chùm từ 2 đến 6 cái, hoa mọc ở đỉnh, gốc thân hay ở nách lá, có màu vàng Hoa nở và héo trong cùng một ngày Hoa đặc trưng cho phân họ cánh bướm, tràng hoa gồm 5 cánh, ở trên có một cánh lớn giương lên gọi là cánh cờ, hai bên có hai cánh xòe ra gọi là cánh bướm, bên dưới có hai cánh ghép lại với nhau thành hình mạn thuyền Có hai

loại hoa, hoa bất thụ là những hoa lớn, màu vàng có vằn đỏ rất rõ và hoa hữu thụ

nhỏ, mọc ở nách là thấp khi thân đứng hoặc phân phối cách khoảng khi thân bò

Những hoa hữu thụ này mọc ở đầu những cuống dài, sau khi thụ phấn và thụ tinh

mọc dài nghiêng ra về phía đất và đẩy các bầu nhị cái chui vào trong đất xốp Các

bầu nhị cái này phình lớn thành quả đậu và đi dần vào sâu trong đất Khi quả đậu chín, chúng sẽ nằm sâu 5 – 6 cm dưới mặt đất [4]

 Quả

Quả là những quả khô, giòn, có hình trụ dài hoặc hình trứng dài từ 2 – 5 cm, đường kính 1 – 1,5 cm có 10 – 12 đường gân chạy theo chiều dọc và nối liền với nhau bằng những đường gân ngang tạo thành một mạng lưới chằng chịt giới hạn

những chỗ trũng, bên trong quả có thể có 1 – 5 hạt hình dạng khác nhau Mỗi cây có

thể có từ 50 – 100 quả, phân bố trên thân theo cách phân bố của hoa [4] Hạt được

bọc trong lớp màng mỏng màu trắng hồng hay nâu đỏ, gồm 2 lá mầm hai bên hình

phẳng lồi màu trắng ngà chứa 30 – 50% chất béo, cây mầm nằm giữa 2 lá mầm

Tổng quan tài liệu

Đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là một nguồn nguyên liệu chứa những chất

kháng oxi hóa tự nhiên Vỏ đậu phộng chứa flavonoid có hoạt tính kháng oxi hóa như 5,7-dihydroxychromone, eriodictyol, luteolin và dihydroquercetin Hạt đang

nảy mầm hay thân cây dưới tác động của vi sinh vật đều sinh tổng hợp stilbene, ở

dạng đồng phân cis- hay trans- của dẫn xuất có công thức gần giống với

3,4′,5-trihydroxy-4-isopentenylstilbene Trục hạ diệp cây đậu phộng bị nhiễm nấm cũng

chứa dạng đồng phân cis- và trans-3,4′,5-trihydroxystilbene (resveratrol).[13]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy cây đậu phộng được trồng trong điều

kiện bình thư ờng, sạch bệnh (không chịu tác động bởi vi sinh vật) cũng sinh tổng

hợp stilbene như piceatannol và resveratrol Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2001) chứng minh rằng ở rễ cây đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao và

đánh giá rễ đậu phộng như là một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol [13]

Cây đậu phộng được trồng chủ yếu để lấy hạt [7] Thành phần chủ yếu trong nhân đậu phộng là 40 – 50% chất béo (dầu đậu phộng - Oleum arachidis) Dầu đậu

phộng gồm các glyceride của nhiều acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất nhiều tùy theo loại đậu phộng: oleic acid (51 – 79%), linoleic acid (7,4 – 26%), palmitic acid (8,5%), stearic acid (4,5 – 6,2%), hexaconic acid (0,1 – 0,4%), hai acid thấy trong dầu đậu phộng: có trọng lượng phân tử lớn hơn là arachidic acid (C20) và lignoceric acid (C24

Tổng quan tài liệu

1.2 Nuôi c ấy rễ tơ và phương pháp tăng sinh hợp chất thứ cấp

1.2.1 Gi ới thiệu về rễ tơ

Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác nhân bệnh – Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật

Trong quá trình xâm nhiễm vào mô thực vật bị thương, vi khuẩn này chuyển DNA, một phần của Ri plasmid vào bộ gen tế bào chủ Những chủng vi khuẩn thuộc nhóm agropine có hoạt lực mạnh, T-DNA chứa 2 phần riêng rẻ được gọi là TL-DNA, mang những gen rol cảm ứng cho sự hình thành kiểu hình rễ tơ, và TR-

T-DNA mang một số gen mã hóa ra enzyme điều hòa sự sinh tổng hợp và xác định sự cân bằng hormone trong những rễ đã chuyển gen Sau khi A rhizogens xâm nhiễm

vào mô, rễ hình thành và phát triển từ vị trí bị thương, được cắt ra, và sau đó chuyển sang môi trường lỏng lắc để tăng sinh khối Rễ tơ được đặc trưng bởi sự phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh,

và bền vững về mặt di truyền [25] Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tơ: độ

tuổi cây, loại mô, loại cây, chủng vi sinh vật, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian ngâm mẫu [24]

Agrobacterium rhizogenes (tên c ũ Phytomonas rhizogenes) được định danh

lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm (Riker và cộng sự, 1930; Hildebrand, 1934; White, 1972) Vi khuẩn A rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở thực vật: hội chứng

tạo rễ tơ hay bệnh rễ nhày A rhizogenes là vi khuẩn đất hình que, gram âm, thuộc chi Agrobacterium (Conn 1942) [55]

Những chủng A rhizogenes có thể được phân loại theo các phân nhóm dựa

vào dạng opine chúng tổng hợp Hiện nay, A rhizogenes được phân biệt gồm dạng

agropine (đại diện là Ri plasmids pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834, và pRiLBA9402), dạng mannopine (đại điện Ri plasmid, pRi8196), dạng cucumopine (đại diện Ri plasmid, pRi2659) và mikimopine (đại diện Ri plasmid, pRi1724)

Tổng quan tài liệu

Mikimopine và cucumopine là các stereo-isomer, nhưng không tìm th ấy sự tương đồng giữa các gen sinh tổng hợp opine tại mức độ nucleotide Trong số các chủng

A rhizogenes được biết đến, K47, K599, và HRI là các dạng độc tính cao có thể xâm nhiễm vào một phạm vi rộng các loại thực vật khác nhau [55]

Nuôi cấy rễ tơ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất hợp chất thứ

cấp, tạo giống cây trồng mới, mô hình nghiên cứu phytoremediation, tìm hiểu con đường sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học, nghiên cứu sinh lý của rễ và

sản xuất protein tái tổ hợp Trong đó, sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tơ được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [42]

Hình 1.2 M ột số ứng dụng của rễ tơ [42]

Tổng quan tài liệu

1.2.4 Bi ện pháp tăng sinh hàm lượng hợp chất thứ cấp

1.2.4.1 B ổ sung tiền chất

Dựa trên kiến thức về con đường sinh tổng hợp, vài hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tổng hợp hợp chất thứ cấp nhằm tăng hàm lượng [40] Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng

những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các

tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan kích thích sự sản xuất các hợp

chất thứ cấp [3] Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất

thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của

tế bào trong một số trường hợp xác định Phương pháp này có giá trị cao khi giá thành của các tiền chất không quá đắt Các yếu tố như nồng độ và thời gian bổ sung

tiền chất có ảnh hưởng lớn đến việc tăng hàm lượng trong huyền phù tế bào Bổ sung loganin, tryptophan và tryptamine đã c ảm ứng sự tổng hợp secologanin và indole alkaloid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus Hàm lượng

paclitaxel trong nuôi cấy huyền phù Taxus cuspidate đã tăng 6 lần bằng cách bổ

sung phenylalanine và những tiền chất khác trong chu trình tổng hợp paclitaxel (benzoic acid, N-benzoylglycine và serine) [33] Phenylalanine là một tiền chất để

tổng hợp acid rosmarinic, khi thêm chất này vào dịch nuôi cấy huyền phù tế bào

Salvia officialis thì nó kích thích sự tổng hợp acid rosmarinine cũng như rút ng ắn

thời gian sản xuất [17] Trong nuôi cấy huyền phù tế bào Vitis vinifera, bổ sung

phenylalanine 0,2 mM dẫn đến sự tích lũy stilbene nội bào tăng lên đáng kể Bổ sung tiền chất là một phương pháp đầy hứa hẹn và có tính khả thi tuy nhiên để ứng

dụng, trước hết cần nghiên cứu cơ chế và cách điều hòa sự sinh tổng hợp hợp chất

thứ cấp

Tổng quan tài liệu

1.2.4.2 B ổ sung tác nhân cảm ứng

Sự cảm ứng là một trong chiến lược thành công nhất để tăng sản xuất hợp

chất thứ cấp Sự cảm ứng bao gồm việc bổ sung những tác nhân hóa học hay tạo stress vật lý vào môi trường nuôi cấy để kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp, những

chất thường được tổng hợp với hàm lượng thấp hoặc không được tổng hợp Tác nhân cảm ứng được định nghĩa là những phân tử kích thích những đáp ứng được

cảm ứng bởi stress hay tính kháng ở thực vật (Van Etten và cộng sự, 1994) Những tác nhân cảm ứng như jasmonate và dẫn xuất của nó kích thích sự tổng hợp hợp

chất thứ cấp trong cây (Sanz và cộng sự, 2000)

Bên cạnh tác nhân cảm ứng kích thích sản xuất một số hợp chất thứ cấp mong muốn thì tác nhân cảm ứng cũng hoạt hóa một số gen liên quan tới sự sinh

tổng hợp hợp chất đó Điều này được chứng minh trong nghiên cứu về sự sinh tổng

hợp nicotine mục tiêu trong tế bào thuốc lá (Breyne và Zabeau, 2001; Goossens và

cộng sự, 2003)

Furanocoumarin là hợp chất phytoalexin có giá trị y dược và công nghiệp, nó

chỉ tồn tại trong 4 họ: Leguminosae, Apiaceae, Umbelliferae và Rutaceae

Furanocoumarin được tổng hợp từ cây Citrus bergamia nhưng sản lượng không đáp

ứng đủ nhu cầu ngày càng tăng cao của xã hội Đáp ứng với tác nhân cảm ứng đã

chứng minh rõ ràng trong nuôi cấy tế bào Ruta graveolens khi được bổ sung dịch môi trường của Rhodoturula rubra đã vô trùng Sự tích lũy hợp chất này tăng lên là

do sự cảm ứng của những enzyme chuyên biệt trong quá trình sinh tổng hợp nó như phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamate-4-hydroxylase (C4H), 4-coumarate: CoA ligase (4CL), S-adenosyl-L-methionine: bergaptol-O-methyltransferase (BMT), và S-adenosyl-L-methionine: xanthtoxol-O-methyltransferase (XMT) [41]

Tác nhân cảm ứng là tác nhân hóa học hay sinh học hay vật lý, dẫn đến tế bào đáp ứng về mặt sinh lý, hình thái và tích lũy phytoalexin Do đó, tác nhân c ảm

Tổng quan tài liệu

ứng được sử dụng như một công cụ để tăng sản lượng hợp chất thứ cấp Về mặt phân loại, tác nhân cảm ứng được phân chia thành 2 loại: tác nhận cảm ứng sinh

học và tác nhân cảm ứng phi sinh học Những năm gần đây, khuynh hướng sử dụng tác nhân cảm ứng phi sinh học ngày càng phổ biến do giá thành thấp hơn tác nhân

cảm ứng sinh học [61]

1.3 Stilbene và resveratrol

1.3.1 Gi ới thiệu về hợp chất nhóm stilbene

Stilbene có khung cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng thơm, n ối với nhau bởi cầu

nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc nhóm hợp chất polyphenol [18,56] Stilbene gồm

có dạng monomer, oligomer và polimer [56] Stilbene monomer có khối lượng phân tử nhỏ (210 – 270 g/mol) Stilbene tồn tại ở dạng đồng phân cis-(E) và trans- (Z) Stilbene trong t ự nhiên đa phần tồn tại ở dạng trans- và nhiều nghiên cứu cho

thấy stilbene dạng trans- thể hiện hoạt tính sinh học cao hơn so với dạng cis- [30]

Stilbene là hợp chất thứ cấp gắn liền với nhiều lợi ích sức khỏe con người như kháng ung thư, kháng viêm và giảm nguy cơ về bệnh tim mạch [9] Stilbene là một nhóm nhỏ của hợp chất nhóm phenylpropanoid được đặc trưng bởi khung 1,2-diphenylethylene Hầu hết stilbene thực vật là dẫn xuất từ cấu trúc cơ bản trans- resveratrol (3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbene), mặc dù những cấu trúc khác chỉ được tìm thấy trong một số họ thực vật đặc thù Một số loài cây tổng hợp stilbene như nho, cây thông, đậu phộng và cây lúa miến (Bảng 1.1) 15 năm qua, thực vật chứa stilbene được quan tâm đặc biệt do hoạt tính sinh học và những ứng dụng trong y dược của chúng.[16]

Stilbene là phytoalexin, hợp chất được tổng hợp khi thực vật đáp ứng với sự xâm hại của nấm mốc, vi khuẩn và tác nhân gây bệnh Resveratrol là hợp chất phổ

biến nhất của nhóm stilbene Nó tồn tại ở cả dạng đồng phân cis- và trans- và trong

mô thực vật ở dạng cơ bản như trans-resveratrol-3-O-glucoside được biết như

piceid và polydatin.[18]

Tổng quan tài liệu

Sơ đồ 1.1: Con đường sinh tổng hợp stilbene [20]

Con đường sinh tổng hợp stilbene trên chỉ hình thành cấu trúc stilbene cơ

bản Ngoài ra, còn có một số enzyme khác liên quan với stilbene synthase xúc tác

sự methyl hóa, đường hóa, đồng phân hóa, oligo hóa khung stilbene cơ bản để hình thành các hợp chất có cấu trúc phức tạp hơn.[16]

Stilbene thực vật có nguồn gốc từ con đường phenylpropanoid (Sơ đồ 1.1) Tất cả

thực vật bậc cao đều có thể tổng hợp malonyl-CoA và CoA-ester của dẫn xuất cinnammic, nhưng chỉ vài loài thực vật có

thể tổng hợp stilbene Một số enzyme đầu

của con đường phenylpropanoid như phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamate-4-hydroxylase (C4H) và 4-coumarate: CoA ligase (4CL) Stilbene synthase (STS) là đặc trưng của thực vật

tổng hợp stilbene và xúc tác sinh tổng hợp khung stilbene từ ba malonyl-CoA và một CoA-ester của dẫn xuất cinnamic acid (hầu

hết là cinnamoyl-CoA hay

p-coumaroyl-CoA)

Tổng quan tài liệu

B ảng 1.1 Một số stilbene phổ biến ở thực vật [16]

trans-resveratrol

Vitis Arachis, Fallopia

3

Tổng quan tài liệu

1.3.2.1 L ịch sử nghiên cứu

Resveratrol được xác định lần đầu tiên năm 1940 trong rễ cây Veratrum grandilorum O Loes Đến năm 1963, resveratrol được tìm thấy trong rễ khô của

cây Polygonum cuspidatum (trong tiếng Nhật là Ko-jo-kon) là một loại cây thuốc

cổ truyền chữa viêm da, nhiễm trùng da, mưng mủ, bệnh nấm ngoài da, bệnh tăng lipid trong máu [9, 11] Ngày nay, resveratrol được xác định như một phytoalexin

tự nhiên được tổng hợp ở một số cây như nho, đậu phộng, … khi đáp ứng với stress,

vết thương, tia cực tím (UV), sự xâm nhiễm của nấm mốc, vi khuẩn

Cũng giống như những polyphenolic khác, resveratrol có tác dụng trong việc

chống oxy hóa, nhưng điều khiến người ta chú ý đến nó bởi giả thuyết: resveratrol

là tác nhân chính làm giảm các bệnh về tim mạch ở những người thường xuyên

uống rượu vang ở Pháp, mà người ta hay gọi là “Nghịch lý nư ớc Pháp” (French paradox) [20] Kể từ đó, số lượng các nhà khoa học quan tâm, tiến hành các nghiên

cứu và đăng tải những bài báo khoa học về resveratrol không ngừng gia tăng Các nghiên cứu sâu thêm về tác dụng, cơ chế tác động và cách thu nhận cũng như gia tăng hàm lượng của resveratrol trong thực vật vẫn không ngừng được tiến hành Các nghiên cứu về resveratrol tăng 40% mỗi năm.[11, 34]

Bi ểu đồ 1.1: Những nghiên cứu về resveratrol theo thời gian [11]

Tổng quan tài liệu

1.3.2.2 Ngu ồn resveratrol

Nho đỏ hay rượu vang là nguồn resveratrol phổ biến Resveratrol được xác

định trong nhiều loài thực vật như knotweed Nhật Bản (Polygonum cuspidatum), đậu phộng, Vaccinum spp (bao gồm cây việt quất, cây nam việt quất), Reynoutria japonica và thông Scots Những loài thực vật khác có chứa resveratrol như giống

Vitis (bao g ồm trong lá, thân và vỏ quả nho); giống Morus (bao gồm cây dâu tằm);

giống Veratrum (huệ tây); các cây họ đậu (giống Cassia, Pterolobium hexapetallum); gi ống Picea (cây khuynh diệp, vân sam), giống Pinus (thông), giống Poaceae (các loài c ỏ như Festuca, Hordeum, Poa, Stipa), giống Trifolium, giống Nothofagus, gi ống Artocarpus, giống Gnetum, Pleuropterus ciliinervis; Bauhinia racemosa; Paeonia lactiflora; Scilla nervosa; và Tetrastigma hypoglaucum (hình

1.3) [10]

Hình 1.3 Ngu ồn resveratrol ở các loài thực vật khác nhau [10]

Tổng quan tài liệu

1.3.2.3 Tính ch ất hóa lý của resveratrol

Resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) ở dạng bột màu trắng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 253 – 255o

C, công thức phân tử là C14H12O39

và trọng lượng phân tử 228,25 g/mol [ ] Resveratrol không tan trong nước nhưng tan trong ethanol và dimethylsulphoxide Trị số Rf

45

lần lượt là 0,68 trên sắc ký bản mỏng với hệ dung môi hệ dung môi giải ly chloroform:ethyl acetate:formic acid (5:4:1); 0,11 với hệ dung môi toluene:methanol (9:1) [ ]; 0,24 với hệ dung môi chloroform:acetic acid (9:1); 0,36 với hệ dung môi n-hexane:ethyl acetate:methanol (50:50:1)[47] Cấu trúc resveratrol gồm 2 vòng phenol đư ợc nối với nhau bởi cầu nối styrene để tạo ra 3,4’,5-trihydroxystilbene Mặc dù sự hiện diện của nối đôi dẫn đến sự hình thành

đồng phân cis- và trans- của resveratrol nhưng đồng phân trans- là dạng bền hơn

Phân tích quang phổ trong ethanol, trans-resveratrol hấp thụ cực đại ở bước sóng

308 nm và cis-resveratrol tại bước sóng 288 nm [10]

Trans-resveratrol là d ạng thương mại và chuyển hóa thành dạng cis- khi tiếp

xúc với tia UV Trans-resveratrol bền trong vài tháng khi được bảo vệ khỏi ánh

sáng Dạng cis cực kỳ nhạy cảm với ánh sáng nhưng có thể bền trong tối ở nhiệt độ

phòng trong ethanol 50% khoảng 35 ngày pH thấp có thể chuyển hóa resveratrol thành trans-resveratrol Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) và GC (Gas chromatography) được dùng để phát hiện và định lượng hàm lượng resveratrol [9]

cis-1.3.2.4 Ứng dụng của resveratrol

- Ứng dụng của trans-resveratrol trong y dược và dinh dưỡng

Trans-resveratrol là h ợp chất có lợi cho sức khỏe con người

Trans-resveratrol gắn liền với sự kiện “French paradox” bởi vì việc tiêu thụ nó hằng ngày (chẳng hạn như rượu vang đỏ) giúp cơ thể chống lại những bệnh về tim mạch (Gronbaek và cộng sự; 2000; Jeandet và cộng sự, 1995; Stervbo và cộng sự, 2007) Rượu vang đỏ chứa từ 0,2 đến 5,8 mg/L (Gu và cộng sự, 1999) phụ thuộc vào loại

Tổng quan tài liệu

nho, trong khi đó vang trắng chứa hàm lượng thấp hơn nhiều Resveratrol có tác

dụng bảo vệ thông qua việc điều hòa sản xuất nitric oxide (Giovannini và cộng sự, 2001), và nó chống sự kết cụm thrombocyte thông qua sự điều hòa tổng hợp eicosanoid (Olas và cộng sự, 2001) Cùng với rượu vang đỏ, một số thực phẩm khác

cũng chứa nguồn trans-resveratrol như trà Itadori, đậu phộng, bơ đậu phộng và

chocolate (Burns và cộng sự, 2002; Tokusoglu và cộng sự, 2005; Counet và cộng

sự, 2006; Hurst và cộng sự, 2008).[34]

Trans-resveratrol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh, nó làm thay đổi sự oxi hóa của lipid (Frankel và Waterhouse, 1993; Leighton và cộng sự, 1999) Do hoạt

tính kháng oxi hóa, trans-resveratrol được giả thuyết đóng vai trò quan tr ọng trong

việc ngăn ngừa các bệnh về tim mạch (Bradamante và cộng sự, 2004) và cũng kháng một số loại ung thư (Aggawal và cộng sự, 2004; Kundu và Surh, 2008) Khả

năng kháng ung thư của trans-resveratrol được tìm ra đ ầu tiên năm 1997 (Jang và

cộng sự, 1997); từ đó rất nhiều công bố về khả năng kháng ung thư của

trans-resveratrol liên quan đến ảnh hưởng nó lên cơ chế tế bào như điều hòa sự phát triển

và tăng sinh tế bào (Roemer và Mahyar-Roemer, 2002; Pervaiz, 2003; Aggarwal và

cộng sự, 2004) Tác động kháng ung thư của trans-resveratrol thể hiện qua khả

năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có tác động gây độc tế bào trực tiếp lên khối u

Hơn thế nữa, trans-resveratrol còn có tác dụng trong điều trị đái tháo đường và

những bệnh suy giảm thần kinh như Alzheimer thông qua sự cảm ứng gen Sirtuin 1 Ngoài ra, resveratrol cũng góp phần kéo dài tuổi thọ [34]

- Ứng dụng của trans-resveratrol trong nông nghiệp

Sự ảnh hưởng của trans-resveratrol lên sinh lý thực vật cũng có nhiều ứng

dụng đặc biệt trong nông nghiệp Trans-resveratrol thể hiện hoạt tính kháng nấm

mốc ((Jeandet và cộng sự, 2002; Adrian và Jeandet, 2006); nó hoạt động như phytoalexin được tạo ra khi đáp ứng với stress như sự tấn công của tác nhân gây

bệnh, bị thương (Langcake và Pryce, 1976) Trong gỗ, trans-resveratrol được tạo ra

Tổng quan tài liệu

và hoạt động như một phytoanticipin (Van Etten và cộng sự, 1994) Bên cạnh đó,

một số thực vật được biến đổi di truyền bằng cách chuyển gen stilbene synthase hay

resveratrol synthase (STS ) để tạo trans-resveratrol nhằm đánh giá vai trò c ủa resveratrol trong việc điều hòa bệnh và tăng cường sức khỏe một số loài thực vật như thuốc lá, cà chua, khoai tây (Giorcelli và cộng sự, 2004; Halls và Yu, 2008; Delaunois và cộng sự, 2009) Thực vật chuyển gen tạo resveratrol bằng cách biểu

hiện vượt mức gen STS đã tăng tính kháng của cây khi bị xâm nhiễm bởi nấm mốc

(Thomzik và cộng sự, 1997) [34]

1.4 Tình hình nghiên c ứu

- Nuôi cấy rễ tơ:

Năm 2009, Nguyễn Thành Hải đã kh ảo sát sự cảm ứng rễ tơ sử dụng

Agrobacterium rhizogenes ATCC 11235 từ các bộ phận khác nhau như trụ hạ diệp,

lá, mô sẹo, trụ thượng diệp cây mãn đình hồng và cây hòe

Bên cạnh những nghiên cứu về cơ chế tác dụng của resveratrol, những nghiên cứu về những phương pháp nhằm chủ động thu nhận hợp chất resveratrol

cũng không ngừng phát triển Hiện nay, các nghiên cứu thu nhận resveratrol theo 3

hướng chính: nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy rễ tơ, vi sinh vật mang gen STS

tái tổ hợp

Tổng quan tài liệu

Sản xuất resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào được thực

hiện chủ yếu trên cây nho (Vitis spp.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) Khi

nuôi cấy huyền phù tế bào không xử lý các tác nhân thì hàm lượng trans-resveratrol

thấp Do đó, những chiến lược như bổ sung tiền chất, chất cảm ứng, gây stress được

sử dụng để tăng hàm lượng trans-resveratrol Hàm lượng resveratrol trong nuôi cấy

huyền phù tế bào cây Vitis vinifera cv Monastrell là 1257 mg/l [20,34]

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi như là sinh vật mô hình để sản suất nhiều

hợp chất có giá trị Những gen cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp resveratrol không có trong vi sinh vật Vì vậy, để sản xuất trans-resveratrol sử dụng vi sinh vật

thì cần phải chuyển những gen cần thiết vào vi khuẩn hoặc nấm mốc và phải bổ sung coumaric acid, tiền chất của resveratrol vào môi trường nuôi cấy Hiệu quả của

vi sinh vật tái tổ hợp trong sinh tổng hợp trans-resveratrol phụ thuộc nhiều tác nhân

như loài, chủng và nguồn gốc của gen chuyển, cũng như các thông số như plasmid,

tiền chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, resveratrol tổng hợp từ

phương pháp này vẫn thấp hơn 10 lần so với phương pháp nuôi cấy huyền phù tế

bào Vitis spp [20]

Phương pháp nuôi cấy rễ tơ được nghiên cứu để sản xuất nhiều hợp chất có

hoạt tính sinh học Gần đây, các nhà khoa học Mỹ và Hàn Quốc đã sử dụng nuôi

cấy rễ tơ cây đậu phộng cho mục tiêu thu nhận resveratrol Hàm lượng resveratrol

phụ thuộc vào chủng A rhizogenes cảm ứng tạo rễ tơ, các tác nhân cảm ứng Những

kết quả nghiên cứu đó cho thấy nuôi cấy rễ tơ đậu phộng là phương pháp đầy hứa

hẹn để sản xuất resveratrol ở quy mô lớn

PH ẦN 2

PHÁP

Vật liệu – Phương pháp

2.1 V ật liệu

- Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu

và cây có dầu, quận 1, Tp Hồ Chí Minh

Hình 2.1 Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân

hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản

Vật liệu – Phương pháp

15834

Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa

lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro

- Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng sinh vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834

- Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn

- Tiền chất bổ sung: phenylalanine

Vật liệu – Phương pháp

2.1.3 Hóa ch ất sử dụng

2.1.3.1 Hóa ch ất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa

- Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide (K3(Fe(CN)6)), acid tricloroacetic, NaH2PO4 2H2O, Na2HPO4.12H2O, FeCl

- Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

3

2.1.3.2 Hóa ch ất PCR (Polymerase chain reaction)

- Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas),

dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch

- Mồi sử dụng:

• Mồi khuếch đại gen rolB

Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22, 37]

B ảng 2.1 Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR

CTA GAT TT-3’

5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’

• Mồi khuếch đại gen rolC

Vật liệu – Phương pháp

Gen rolC được khuếch đại với cặp mồi rolCF và rolCR Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 626 bp [22, 37]

Bảng 2.2 Đặc điểm của cặp mồi rolCF và rolCR

TCA AAC TCG TC-3’

5’-TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3’

2.1.3.3 Hóa ch ất tách chiết và điện di

- Các dung môi hữu cơ: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol

- Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), phenol, chloroform, nitơ lỏng, TE (Tris – EDTA), ethanol

- Hóa chất tách chiết plasmid: Dung dịch I gồm glucose 50 mM, Tris HCl 2,5

mM pH 8 và EDTA 10 mM pH 8 Dung dịch II gồm SDS 10% và NaOH 5N Dung dịch III gồm KOAc 5M và glacial acetic 0.2M

- Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TAE (Tris-Acetate-EDTA), ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue, xyencyanol)

Vật liệu – Phương pháp

- Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực

vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường Đại học Khoa học Tư nhiên Tp Hồ Chí Minh

2.2.1 Tạo cây con in vitro

- Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ, rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được rửa lại bằng nước cất cho sạch xà phòng Erlen chứa hạt được đậy bằng

giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng

- Thao tác trong tủ cấy vô trùng: Tiến hành lắc với cồn 70o

trong khoảng 30 giây đến 1 phút Tiếp đó, ngâm và lắc hạt trong dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,5% trong 7 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần Các hạt được cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l) Sau 5 ngày thì hạt nãy mầm với điều kiện chiếu sáng 16

giờ trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28o

C

Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.3 Cây đậu phộng in vitro

2.2.2 C ảm ứng tạo rễ tơ

Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.4 Quy trình t ạo rễ tơ

Rễ tơ được tạo ra thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa trên môi trường lỏng NB lắc với vận tốc

100 - 130 vòng/phút trong 48 giờ ở 25o

C vào tế bào thực vật Vi khuẩn sau khi hoạt

hóa được cấy vào môi trường NB để tăng sinh khối Khi A rhizogenes phát triển

đến giữa pha tăng trưởng (mid-log phase) với OD600

28

= 0,5 được dùng để gây nhiễm

nhằm chuyển gen Các mẫu (tử diệp, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) được

cắt và tạo vết thương được nhúng vào dịch khuẩn A rhizogenes Thời gian ngâm

mẫu trong dịch khuẩn là 15 phút Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy Quá trình đồng nuôi cấy được thực hiện trong tối Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu được rửa với môi trường

MS lỏng có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại vi khuẩn trên bề mặt mẫu Sau khi rửa, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường MS rắn bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn và cảm ứng tạo rễ tơ Sau 2-3 tuần nuôi cấy, rễ tơ được tao thành từ vết thương [ , 61]

Nguyên tắc của phương pháp: Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng

hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase

Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là

để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự

: Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu rúc

của các nucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính linh động của phân tử trong gel phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân tử nucleotide hay cặp nucleotide và nồng độ các chất cấu thành gel.[ ]

Mục tiêu của điện di

: Phân tích và kiểm tra kích thước của sản phẩm khuếch đại PCR

2.2.4.1 Điều chế các loại cao

Mỗi loài cây đều chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến

loại rất phân cực, vì thế dung môi được sử dụng điều chế cao có độ phân cực tăng

dần [5]

Xử lý nguyên liệu: Rễ tơ sau 25 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc được

rửa sạch môi trường nuôi cấy, ghi nhận trọng lượng tươi

Quy trình điều chế cao xử dụng máy Soxhlet:

Vật liệu – Phương pháp

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ điều chế cao

Các loại cao thu nhận được được dùng để khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa

Dung d ịch môi trường nuôi cấy rễ tơ

2.2.5 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa

: hòa dung môi ethyl acetate vào dịch môi trường, hỗn hợp dung môi và dịch môi trường được trộn đều trong 30 phút, sau

đó hổn hợp được lắng, thu lấy phân đoạn ethyl acetate để xác định hàm lượng

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia

phản ứng oxy hóa khử Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng kháng oxy hóa của một chất Trong phương pháp của Yen và Duh (1993) [59], chất khử sẽ

khử potassium ferricyanide (K3(Fe(CN)6)) thành potassium ferrocyanide (K4(Fe(CN)6)), hay nói cách khác ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide bị

)

6)3- (Fe(CN)6) Sau đó bổ sung Fe

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (hình 2.5 ) được đặc trưng bởi gốc tự

do ổn định Gốc tự do này bền do được an định bởi các hiệu ứng điện tử và hiệu ứng lập thể nội phân tử tạo ra, do đó các phân tử này không thể kết hợp tạo thành

nhị phân tử DPPH có màu tím đặc trưng Đỉnh hấp thu của dung dịch DPPH trong dung môi methanol là 515 - 517 nm Khi DPPH phản ứng với hợp chất có thể cho phân tử hydrogen, thì màu tím đ ặc trưng của DPPH giảm xuống [39] Vì vậy, phương pháp này dùng để sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất thu nhận được trong nhiều nghiên cứu

Hình 2.5 C ấu trúc DPPH ở trạng thái tự do (có màu tím đặc trưng)

Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.6 C ấu trúc DPPH mất gốc tự do (có màu vàng)

Nguyên t ắc: Mỗi hợp chất có màu đều có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng

hấp thu chuyên biệt, chẳng hạn như trans – resveratrol được hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 308 nm [10,43] , trans – pterostilbene có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng

hấp thu 308 nm [43] Do đó, khi đo mật độ quang ở bước sóng đặc trưng cho chất chuẩn có nồng độ khác nhau sẽ có một đường chuẩn tuyến tính của mật độ quang

với nồng độ chất chuẩn đó Từ đó, với bất kỳ hổn hợp nào có chứa hợp chất này, chỉ

cần xác định mật độ quang của nó ở bước sóng hấp thu đặc trưng đó, nồng độ hợp

chất có trong dung dịch đem đo sẽ được xác định Hàm lượng stilbene được suy ra

dựa vào đường cong phổ hấp thu ở bước sóng 308 nm của resveratrol chuẩn Resveratrol được xem là đại diện của nhóm stilbene trong rễ cây đậu phộng [13]

Các bước tiến hành:

Xây dựng đường chuẩn:

Resveratrol được cân chính xác và được hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ

0,005 mg/ml đến 0,030 mg/ml Đo mật độ quang của các dung dịch được pha ở bước sóng 308 nm; trong đó, dung môi methanol có giá trị ABS = 0

Định lượng hợp chất có trong dịch được tách chiết: Pha loãng dung dịch có

chứa hợp chất cần định lượng cho đến khi mật độ quang của chúng nằm trong khoảng giới hạn các mật độ quang có trong đường chuẩn Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 113,7x – 0,068 với y là giá trị OD và x là nồng độ resveratrol (mg/ml), suy ra nồng độ hợp chất tương ứng trong dung dịch đem đo, từ đó quy về hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu

y = 113,7x - 0,068 R² = 0,994

-.500 000 500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000

Vật liệu – Phương pháp

Trong luận văn này, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP HCM

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức từ 30-35

mẫu Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần

mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0 phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett Kết quả được trình bày ở

dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE)

2.3.1 Kh ảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ

2.3.1.1 Kh ảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ

Hầu hết các mô và cơ quan thực vật gồm trục hạ diệp, lá, trục thượng diệp,

cuống lá được xâm nhiễm đều có thể được chuyển gen bởi A rhizogenes dẫn đến

cảm ứng hình thành rễ tơ Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào sự

tương tác giữa vi khuẩn A rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào [55] Vì

vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để

cảm ứng tạo rễ tơ Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20 ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu

để khảo sát sự tạo rễ tơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Vật liệu – Phương pháp

Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn là 15 phút và thời gian đồng nuôi

cấy là 72 giờ [28,32]

Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên

mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường tương tự Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu

2.3.1.2 Kh ảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ

Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gene từ

Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy [55] Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tơ cao nhất Sau khi tiến hành khảo sát loại mô, ta chọn được nguồn vật liệu đầu phù

hợp cho sự cảm ứng tạo rễ tơ ở đậu phộng Mẫu sau khi được nhúng trong dịch khuẩn 15 phút, được chuyển sang giấy thấm vô trùng để giảm độ ẩm trên bề mặt

mẫu và sau đó chuyển lên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trư ởng để đồng nuôi cấy Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ,

96 giờ, 120 giờ Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng ra rễ tơ Số mẫu trên

mỗi nghiệm thức là 45 mẫu Lặp lại 3 lần

vi ệc hình thành rễ tơ

Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tơ, mỗi tác giả sử dụng một thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn đã hoạt hóa Vì vậy, thí nghiệm này được

tiến hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễ tơ nhiều

nhất Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ

Vật liệu – Phương pháp

2.3.2 Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và khảo sát khả

năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc

2.3.2.1 Ki ểm tra sự chuyển gen

Kiểu hình rễ tơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng

hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật Do đó, kiểm tra chuyển

gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn vì trong m ột số trường hợp opine tại ra không bền Để phát hiện T-DNA, phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61] Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm

tra sự chuyển gen vào tế bào.[49]

Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của

Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của

rễ cây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ

được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra;

thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm

Vật liệu – Phương pháp

Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật

Vi khuẩn A rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1)

được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976) [

Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0oC qua đêm

C

Vật liệu – Phương pháp

Sơ đồ 2.3 Quy trình tách chiết DNA plasmid

10-15 ml dịch khuẩn A rhizogenes

Ly tâm 6000 rpm/15 phút Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml Sinh khối giữ trong gel lạnh

100 µl dung dịch I Votex kĩ

100 µl TE 0,1X, để lạnh

200 µl dung dịch II, đảo nhẹ

600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ

100 µl dung dịch III đảo nhẹ

Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi

Mồi xuôi, 10 pmol/µl

Mồi ngược, 10 pmol/µl

DEPC-H2

1,5

1

1 17,75 1,5 1,25

1

25

O

Dream Taq buffer

Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl

DNA khuôn

Tổng thể tích phản ứng

Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC

Các bước khuếch đại Nhiệt độ (o

0:30 0:30 1:00