thu nhận hợp chất resveratrol từ rễ tơ cây đậu phộng

GVHD: TS LÊ THỊ THỦY TIÊN HVTH: NGUYỄN THỤY HAI: 12310729 THI PHỐI PHỐI : 12310746 VŨ NGỌC LINH : 12310737 • Cây đậu phộng Chi : Arachis Loài : Arachis hypogaea L Tên tiếng Anh: peanut, groundnut • Vỏ đậu phộng chứa flavonoid • Hạt nảy mầm hay thân tác động vi sinh vật sinh tổng hợp stilbene (đồng phần cis-, trans-) • rễ đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao (Chen cs, 2001) Stilbene - Stilbene phytoalexin - Stilbene nhóm nhỏ hợp chất nhóm phenylpropanoid đặc trưng khung 1,2diphenylethylene - Stilbene có khung cấu trúc gồm vòng thơm, nối với cầu nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc nhóm hợp chất polyphenol - có dạng monomer, oligomer polimer Resveratrol - 1940 phát rễ Veratrum grandilorum O Loes - Resveratrol hợp chất phổ biến nhóm stilbene - Tồn dạng đồng phân cis- trans- - 1963, tìm thấy rễ khô Polygonum cuspidatum (trong tiếng Nhật Ko-jo-kon) - Resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) dạng bột màu trắng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 253 – 2559 oC, công thức phân tử C14H12O3và trọng lượng phân tử 228,25 g/mol - chống oxy hóa - làm giảm bệnh tim mạch • Vật liệu - Hạt đậu phộng - Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 • Môi trường nuôi cấy - Môi trường Murashige and Skoog (MS) - Môi trường Nutrient Broth (NB) - Các tác nhân cảm ứng: AlCl2, natri acetate,vi khuẩn - Tiền chất bổ sung: Phenylalanine • Phương pháp * Tạo in-vitro: • Thao tác tủ cấy: Các hạt tách vỏ > rửa xà phòng -> rửa lại nước cất -> erlen chứa hạt đậy giấy bạc đưa vào tủ cấy vô trùng • Thao tác tủ cấy vô trùng: lắc với cồn 70o /30s- 1ph -> dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,5% - ngâm lắc hạt /7ph -> rửa lại nước cất vô trùng lần > cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30 g/l) agar (7,5 g/l) -> chiếu sáng 16h/5 ngày ->hạt mầm (cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28oC) • Cảm ứng tạo rễ tơ, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo rễ tơ như: - Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ - Thời gian đồng nuôi cấy - Thời gian ngâm mẫu Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ Mẫu (trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) Agrobacterium rhizogenes đồng nuôi cấy tối, 72h Mẫu đối chứng không gây nhiễm vi khuẩn loại VK cefotaxime nuôi cấy MT MS (bổ sung saccharose 30 g/l, agar 7,5 g/l, cefotaxime 250 mg/ml) chất ĐHTT  Phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ số rễ tơ ghi nhận sau - tuần nuôi cấy Hình 3.7 Rễ tơ phát triển môi trường lỏng lắc theo từ đến 30 ngày (kí hiệu từ A tời M) hình kí hiệu N ngày 39 Về màu sắc rễ tơ trình tăng trưởng, rễ phát triển đến ngày 15 xuất màu vàng ngày màu đậm - rễ tơ phát triển chậm ngày đầu - pha tăng trưởng từ ngày nuôi cấy lỏng lắc thứ đến 21 - phát triển ổn định từ ngày thứ 22 đến 30 (Trong pha tăng trưởng, rễ tơ tăng sinh khối nhanh đáng kể từ ngày thứ đến ngày 15)  Dựa vào kết chọn thời gian nuôi cấy từ ngày đến ngày 21 để bổ sung tác nhân cảm ứng vào môi trường nuôi cấy rễ tơ, thu nhận sinh khối để tách chiết hợp chất stilbene rễ tơ 21 – 30 ngày tuổi Chứng minh diện nhóm stilbene đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa Rễ tơ Sấy 40oC Xay nhuyễn Bột khô Soxhlet Cao Methanol Cao Chloroform Cao Ethylacetate Cao Hexan Dựa vào kết định tính định lượng resveratrol, dung môi lựa chọn để tiến hành tách chiết resveratrol từ sinh khối rễ methanol Tuy nhiên, methanol hòa tan hoàn toàn nư ớc, nên việc sử dụng methanol để cô lập hoạt chất từ môi trường nuôi cấy rễ tơ gây nhiều trở ngại Do riêng trường hợp cô lập hoạt chất từ dịch môi trường dung môi ethyl acetate sử dụng để thay cho môi trường methanol Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa loại cao Chất khử khử potassium ferricyanide (K3(Fe(CN)6)) thành potassium ferrocyanide (K4(Fe(CN)6)), hay nói cách khác ion Fe3+ phân tử potassium ferricyanide bị khử thành ion Fe2+ phân tử potassium ferrocyanide Phương trình ph ản ứng sau: Sau bổ sung Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanide tạo thành phức hợp ferric ferrocyanide màu xanh (Prussian Blue) có công thức Fe4(Fe(CN)6)3 Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng ion ferrocyanide, tức tỉ lệ với khả khử hợp chất thử nghiệm Thông qua phương pháp lực khử, ta thấy loại cao thể khả kháng oxi hóa Trong đó, cao ethyl acetate thể hoạt tính kháng oxi hóa mạnh cao hexane có hoạt tính kháng oxi hóa thấp Thành phần hóa học đậu phộng chứa nhóm stilbene mà chứa số nhóm chức khác flavonoid, saponin Như vậy, cao ethyl acetate chứa hợp chất nhóm flavonoid hợp chất thuộc nhóm stilbene khác resveratrol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh piceatannol Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene nuôi cấy rễ tơ phương pháp bổ sung tiền chất chất cảm ứng Stilbene tổng hợp thông qua đường phenylpropanoid với enzyme phenylalanine ammonia-liase (PAL) → phenylalanine tác nhân quan trọng sinh tổng hợp stilbene Theo nghiên cứu Media-Bolivar cộng (2009), bổ sung natri acetate 10,2 mM vào môi trường nuôi cấy rễ tơ đậu phộng natri acetate cảm ứng tiết resveratrol vào môi trường nuôi cấy hàm lượng resveratrol ngoại bào tăng 60 lần Trong đó, bổ sung nhôm clorua tăng từ 0,3 mM đến 0,9 mM cho thấy hàm lượng stilbene tăng dần đạt mức tăng mạnh nhôm cloura 0,9 mM Và bổ sung nhôm clorua 1,2 mM vào môi trường nuôi cấy dẫn đến giảm hàm lượng stilbene nội bào lẫn ngoại bào Vi khuẩn kích thích sinh tổng hợp stilbene tiết stilbene vào môi trường nuôi cấy Về mặt thống kê cho thấy khác biệt thay đổi mật độ tế bào vi khuẩn bổ sung Từ kết luận mật độ vi khuẩn không ảnh hưởng nhiều đến lượng stilbene tổng hợp Ghi nhận mục tiêu đề tài Rễ tơ cảm ứng từ hạ diệp nuôi cấy điều kiện lỏng lắc tăng sinh khối rễ mà tạo chồi từ rễ tơ Mặc dù, gen rolC cảm ứng tạo chồi nghiên cứu gần nuôi cấy rễ tơ đậu phộng chưa có công bố việc phát sinh chồi bất định từ rễ tơ Đề nghị Trên sở kết thu được, tiến hành số nghiên cứu tiếp theo: - Chọn lọc dòng rễ tơ có hàm lượng stilbene cao tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy rễ tơ môi trường lỏng lắc - Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate - Khảo sát thời gian bổ sung chất cảm ứng khoảng thời gian thu nhận stilbene sau bổ sung - Nghiên cứu tác động chất cảm ứng tiền chất mức phân tử lên sinh tổng hợp stilbene rễ tơ đậu phộng - Ứng dụng bioreactor vào việc nhân sinh khối rễ tơ để thu nhận hợp chất nhóm stilbene - Nghiên cứu nhân chồi tái sinh từ chồi bất định phát sinh từ rễ tơ [...]... thành rễ) Rễ tơ cảm ứng từ các bộ phận khác nhau sau 20 ngày nuôi cấy A Tử diệp B Trụ thượng diệp C Trụ hạ diệp D Cuống lá E Lá F Đối chứng (Mỗi thanh ngang 1 cm) Hình 3.2 Rễ tơ phát triển trên môi trường rắn A Rễ tơ cắt ra từ mẫu lá cảm ứng B Rễ tơ từ hình A sau 2 tuần nuôi cấy + Arachis hypogaea L khá nhạy cảm với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 + Sự cảm ứng tạo rễ tơ từ mẫu lá cao hơn so với từ. .. (Trong pha tăng trưởng, rễ tơ tăng sinh khối nhanh và đáng kể từ ngày thứ 9 đến ngày 15)  Dựa vào kết quả này có thể chọn thời gian nuôi cấy từ ngày 9 đến ngày 21 để bổ sung các tác nhân cảm ứng vào môi trường nuôi cấy rễ tơ, thu nhận sinh khối để tách chiết hợp chất stilbene khi rễ tơ 21 – 30 ngày tuổi Chứng minh sự hiện diện của nhóm stilbene và đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa Rễ tơ Sấy ở 40oC Xay nhuyễn... bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ lá, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, tử diệp và cuống lá với cặp mồi rolCF và rolCR Giếng 9, 9’: Sản phẩm PCR của mẫu nước Xây dựng đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Rễ tơ được cảm ứng từ mẫu lá MT MS bổ sung saccharose 30 g/l điều kiện lắc 120 vòng/phút 25 – 28oC Rễ tơ được cân và xác định trọng lượng 3 ngày/lần (Trọng lượng rễ tơ ban đầu... 0,34g) Hình 3.7 Rễ tơ phát triển trong môi trường lỏng lắc theo tuần tự từ 0 đến 30 ngày (kí hiệu từ A tời M) và hình kí hiệu N là ở ngày 39 Về màu sắc của rễ tơ trong quá trình tăng trưởng, rễ phát triển đến ngày 15 thì xuất hiện màu vàng và càng ngày màu càng đậm - rễ tơ phát triển chậm trong 6 ngày đầu - pha tăng trưởng từ ngày nuôi cấy lỏng lắc thứ 7 đến 21 - phát triển ổn định từ ngày thứ 22 đến... Ethylacetate Cao Hexan Dựa vào kết quả định tính và định lượng resveratrol, dung môi được lựa chọn để tiến hành tách chiết resveratrol từ sinh khối rễ là methanol Tuy nhiên, do methanol hòa tan hoàn toàn trong nư ớc, nên việc sử dụng methanol để cô lập hoạt chất từ môi trường nuôi cấy rễ tơ gây nhiều trở ngại Do đó riêng trường hợp cô lập hoạt chất từ dịch môi trường dung môi ethyl acetate được sử dụng để... hợp chất nhóm flavonoid hoặc hợp chất thu c nhóm stilbene khác resveratrol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh như piceatannol Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene trong nuôi cấy rễ tơ bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng Stilbene được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid với enzyme phenylalanine ammonia-liase (PAL) → phenylalanine là tác nhân quan trọng trong sự sinh tổng hợp. .. mg/l, không chất điều hòa tăng trưởng) 96h nuôi cấy trên MT MS rắn như trên (bổ sung cefotaxime 250 mg/l)  kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ sau 3 tuần nuôi cấy Loại VK Sự hình thành rễ tơ có thể được chia thành 4 bước:  hoạt hóa  biến đổi  chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật  cảm ứng sự hình thành và phát triển rễ tơ Chứng minh sự chuyển gen và khảo sát khả năng sinh trưởng của rễ tơ trong MT... hợp stilbene và sự tiết stilbene vào môi trường nuôi cấy Về mặt thống kê cho thấy không có sự khác biệt khi thay đổi mật độ tế bào vi khuẩn bổ sung Từ đó có thể kết luận mật độ vi khuẩn không ảnh hưởng nhiều đến lượng stilbene được tổng hợp Ghi nhận mới ngoài mục tiêu đề tài Rễ tơ được cảm ứng từ hạ diệp khi nuôi cấy trong điều kiện lỏng lắc không những tăng sinh khối rễ mà còn tạo ra chồi con từ rễ. .. cảm ứng từ hạ diệp khi nuôi cấy trong điều kiện lỏng lắc không những tăng sinh khối rễ mà còn tạo ra chồi con từ rễ tơ Mặc dù, gen rolC có thể cảm ứng tạo chồi nhưng những nghiên cứu gần đây về nuôi cấy rễ tơ cây đậu phộng chưa có một công bố nào về việc phát sinh chồi bất định từ rễ tơ ... đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Kiểm tra sự chuyển gen Tách chiết DNA bộ gen • Đối chứng: rễ cây đậu phộng in vitro • Đối chứng dương: Ri-plasmid A rhizogenes ATCC 15834 PCR khuếch đại trình tự đoạn gen chuyển • cặp mồi rolCF và rolCR khuếch đại gen rolC (626bp) • cặp mồi rolBF và rolBR khuếch đại gen rolB (423 bp) Kết luận: gen rolB và gen rolC từ Ri plasmid của A rhizogenes ... tổng hợp Ghi nhận mục tiêu đề tài Rễ tơ cảm ứng từ hạ diệp nuôi cấy điều kiện lỏng lắc tăng sinh khối rễ mà tạo chồi từ rễ tơ Mặc dù, gen rolC cảm ứng tạo chồi nghiên cứu gần nuôi cấy rễ tơ đậu phộng. .. 3.2 Rễ tơ phát triển môi trường rắn A Rễ tơ cắt từ mẫu cảm ứng B Rễ tơ từ hình A sau tuần nuôi cấy + Arachis hypogaea L nhạy cảm với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 + Sự cảm ứng tạo rễ tơ từ. .. Cảm ứng tạo rễ tơ, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo rễ tơ như: - Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ - Thời gian đồng nuôi cấy - Thời gian ngâm mẫu Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ Mẫu (trụ thượng