3. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
3.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy
lỏng lắc
Rễ tơ được tạo ra từ mẫu lá, được cắt và chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS lỏng có bổ sung saccharose 30 g/l, không có chất điều hòa sinh trư ởng thực vật, lắc với vận tốc 100 – 130 vòng/phút, đ ể kiểm tra sự tăng sinh theo thời gian nuôi cấy. Đo sự tăng trưởng của rễ tơ trong 30 ngày, 3 ngày đo một lần. Chỉ tiêu theo dõi là trọng lượng tươi rễtơ. Trọng lượng tươi ban đầu khoảng 0,3 – 0,4 g.
2.3.3. Chứng minh sự hiện diện của nhóm stilbene, đánh giá hoạt tính
kháng oxi hóa của các loại cao từ rễ tơ cây đậu phộng
2.3.3.1. Chứng minh sự hiện diện của hợp chất nhóm stilbene trong các loại
cao sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng là phương pháp định tính để xác định các chất trong cao có chứa chất hợp chất đang quan tâm [5]. Thí nghiệm này tiến hành để xác định xem cao nào chứa hợp chất nhóm stilbene.
Tiến hành: Chấm dung dịch methanol có hòa tan các loại cao (cao hexan, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao methanol) lên bản silica gel, sấy khô. Hệ dung môi giải ly là chloroform: ethyl acetate: formic acid (5:4:1) [45] nhưng do điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng acetic acid thay thế cho formic acid và chất chuẩn là resveratrol. Kết quả ghi nhận được khi quan sát dưới đèn UV (254 nm).
2.3.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các loại caoPhương pháp Yen và Duh: Phương pháp Yen và Duh: Phương pháp Yen và Duh:
Vật liệu – Phương pháp
Hút lần lượt 1 ml dung dịch Vitamin E 0,5 mg/ml, chất thử nghiệm (cao methanol, cao ethyl acetate, cao chloroform, cao hexane) nồng độ 0,5 mg/ml, dung môi tách chất thử nghiệm (chứng âm) vào từng ống nghiệm riêng biệt.
Hút 2,5 ml dung dịch đệm phosphate 0,2 M pH = 6,6 cho vào từng ống nghiệm trên, lắc đều.
Hút 2,5 ml dung dịch K3(Fe(CN)6) 1% cho vào từng ống nghiệm trên. Hổn hợp phản ứng được đặt trong bểổn nhiệt ở 50oC, trong 20 phút.
Sau khi làm nguội, hút 2,5 ml trichloroacetic acid 1% cho vào từng ống nghiệm trên.
Ly tâm các dung dịch trên ởđiều kiện 7000 vòng trong 2 phút, thu dịch nổi Hút 1 ml dịch nổi vào từng ống nghiệm sạch riêng biệt, thêm 2 ml nước cất, 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%.
Lắc đều hỗn hợp trong vòng 5 phút. Ghi nhận kết quả độ hấp thu ở bước sóng 700 nm.
Phương pháp DPPH:
Phương pháp tiến hành:
Cân mỗi loại cao và resveratrol chuẩn, hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml.
Pha loãng cao và resveratrol bằng dung môi methanol tuyệt đối ở các nồng độ liên tiếp.
Hút 0,5 ml mỗi cao và resveratrol đã đư ợc pha loãng vào mỗi ống nghiệm riêng lẽ. Thêm lần lượt vào mỗi ống nghiệm 3 ml methanol tuyệt đối.
Thêm vào 0,5 ml dung dịch DPPH được pha trong methanol tuyệt đối ở nồng độ 0,6 mM.
Vật liệu – Phương pháp
Lắc đều hỗn hợp, ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó, đem các dung dịch đo độ hấp thu ởbước sóng 516 nm.
Song song với tiến trình như trên, th ực hiện với một ống nghiệm khác gồm 3,5 ml methanol tuyệt đối được bổ sung 0,5 ml DPPH 0,6 mM, được sử dùng làm chứng âm.
Khả năng làm mất màu DPPH của mỗi mẫu được tính theo công thức sau[12, 27]:
% mất màu của DPPH (%DC) = [(AB – AC)/AB] x 100
Trong đó: Mức độ làm mất màu DPPH ở tại nồng độ C nhất định tương ứng với khảnăng bắt gốc tự do của chất đó tại nồng độ C (khác không). Giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) được tính thông quá việc nội suy thông qua phương trình đư ờng thẳng.
AB: giá trị OD của chứng âm ([chất thử nghiệm] = không) AC: giá trị OD tại một nồng độ C nhất định (khác không) Bố trí thí nghiệm
Mỗi loại cao và mỗi hợp chất có khảnăng kháng oxi hóa khác nhau. Vì vậy, tùy thuộc vào khả năng kháng oxi hóa của từng loại cao, thí nghiệm khảo sát dãy các nồng độ cao khác nhau để xác định giá trị IC50 của mỗi loại cao. Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu so sánh hoạt tính kháng oxi hóa giữa các loại cao và resveratrol chuẩn.
Vật liệu – Phương pháp
2.3.4. Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene trong nuôi cấy rễ tơ bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng
2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung phenylalanine lên sự sinh tổng
hợp stilbene trong rễ tơ cây đậu phộng
Phenylalanine là tiền chất trong con đường sinh tổng hợp stilbene. Phenylalanine trong môi trường nuôi cấy ban đầu được bổ sung ở các nồng độ khác nhau: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM. Chỉ tiêu theo dõi là hàm lư ợng stilbene trong sinh khối rễtơ và trong dung dịch môi trường sau 21 ngày nuôi cấy.
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri acetate lên sự sinh tổng hợp
stilbene
Natri acetate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ đậu phộng ở nồng độ 5, 10, 20 mM vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong sinh khối rễ tơ và trong môi trường nuôi cấy [38]. Mẫu đối chứng là rễtơ không có bổ sung natri acetate.
2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự sinh tổng hợp stilbene
Nhôm clorua được bổsung vào môi trường nuôi cấy rễtơ ở các nồng độ 0,3; 0,6; 0,9; 1,2 mM vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong môi trường nuôi cấy và trong sinh khối rễ tơ.
2.3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự sinh tổng hợp stilbene
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ ở các nồng độ: 0,5x109; 1,5x109; 2,5x109; 3,5x109 tế bào vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong dung dịch môi trường và trong sinh khối rễtơ.
PHẦN 3
Kết quả - Biện luận
3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tơ
3.1.1. Khảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Các mẫu cắt từ trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá sau khi ủ chung với vi khuẩn A. rhizogenes, đồng nuôi cấy trong tối trong 72 giờ, loại vi khuẩn bằng cefotaxime, mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung saccharose 30 g/l, agar 7,5 g/l, cefotaxime 250 mg/ml và không có chất điều hòa tăng trưởng. Mẫu đối chứng là những khúc cắt không được gây nhiễm vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường như trên. Phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ trên mỗi mẫu cấy được ghi nhận sau 2 - 3 tuần nuôi cấy. Kết quả của sự tạo rễtơ được trình bày như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỉ lệ tạo rễtơ và số rễtơ được cảm ứng từ các bộ phận khác nhau
Bộ phận % tạo rễtơ Số rễtơ Lá 81,437 ± 0,643 7,973 ± 0,451 Tử diệp 43,507 ± 1,465 6,260 ± 0,423 Trụ hạ diệp 75,927 ± 0,268 6,767 ± 0,318 Trụthượng diệp 18,337 ± 0,193 3,890 ± 0,110 Cuống lá 9,017 ± 0,421 2,523 ± 0,215
Kết quả cho thấy các mẫu mô khác nhau từcây đậu phộng đã xâm nhiễm A. rhizogenes đều cảm ứng ra rễ tơ nhưng với tỉ lệ khác nhau. Trong đó, phần trăm cảm ứng tạo rễtơ và số rễ tạo ra ở mẫu lá là cao nhất. Phần trăm tạo rễ và số rễ tạo ra từ mẫu cuống là là thấp nhất. Tất cả các mẫu đối chứng đều không hình thành rễ.
Kết quả - Biện luận
Hình 3.1. Rễtơ được cảm ứng từ các bộ phận khác nhau và mẫu đối chứng sau 20 ngày nuôi cấy.
A. Tử diệp, B. Trụthượng diệp, C. Trụ hạ diệp, D. Cuống lá, E. Lá, F. Đối chứng Mỗi thanh ngang tương ứng với một cm.
Kết quả - Biện luận
Khi quan sát hình dạng rễtơ tạo ra từ các mẫu cho thấy, rễtơ được tạo ra từ mẫu tử diệp phát triển nhanh nhất, phát sinh nhiều nhánh, rễtơ từ mẫu lá ngắn và ít phân nhánh hơn. Tuy nhiên, rễtơ từ mẫu lá khi được cắt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật phát triển rất nhanh, tạo nhiều nhánh. Về mặt hình thái giải phẫu, rễ tơ và rễ in vitro không có sự khác biệt. Bên cạnh đó, rễ tơ đậu phộng có chiều dày rễ trung bình 1 mm, không có rễ lông tơ rõ ràng. Hình dạng rễ tơ này tương tự với rễ tơ được mô tả trong nghiên cứu của Mediana-Bolivar và cộng sự (2009).
Hình 3.2. Rễtơ phát triển trên môi trường rắn
A. Rễtơ cắt ra từ mẫu lá cảm ứng B. Rễtơ từ hình A sau 2 tuần nuôi cấy Mỗi thanh ngang tương ứng với 1 cm
Phần trăm cảm ứng tạo rễtơ trung bình từ các mẫu mô khác nhau là 45,63%. Do đó, ta có thể kết luận Arachis hypogaea L. khá nhạy cảm với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834. Sự cảm ứng tạo rễtơ từ mẫu lá cao hơn so với từ mẫu trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, cuống lá, tử diệp; từđó có thể kết luận quá trình biến nạp của vi khuẩn vào tếbào cây đậu phộng ở lá dễdàng hơn hơn so với các mẫu còn lại. Bercetche và cộng sự(1987) đã công bố rễ tơ chỉ được cảm ứng từ mô sẹo của củ cà rốt (Daucus carota var sativa) và những đoạn thân của Nicotinana tabacum. Shi
Kết quả - Biện luận
và Kintzios (2003) ghi nhận trên cây Pueraria phaseoloides có sự cảm ứng tạo rễtơ từ mẫu cuống lá cao hơn từ mẫu lá và tử diệp. Dựa trên kết quả này, hai tác giả này đã đề nghị rằng quá trình biến nạp phụ thuộc vào mô, cơ quan hay vị trị xâm nhiễm [48]. Rahimi và cộng sự (2008) cho sau khi đồng nuôi cấy Valeriana sisymbriifolium với A. rhizogenes, trong các mẫu lá, cuống lá, trụ hạ diệp thì mẫu trụ hạ diệp không cảm ứng tạo rễtơ tốt như mẫu lá và cuống lá [44].
Phần trăm cảm ứng tạo rễtơ và số rễ từ mẫu lá lần lượt là 81,44%, 7,97 rễ. Trong khi đó, Kim và cộng sự (2008) khảo sát sự ảnh hưởng của các chủng A. rhizogenes khác nhau lên sự tạo rễ tơ từ mẫu lá đậu phộng cho kết quả phần trăm cảm ứng tạo rễtơ từA. rhizogenes ATCC 15834 là 36,8% và số rễtơ trung bình tạo ra ở vị trí bị thương là 2,3 rễ [32]. Phần trăm cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ từ trụ hạ diệp lần lượt là 75,93% và 6,77 rễ. Trong khi đó, Karthikeyan và cộng sự (2007) ghi nhận phần trăm cảm ứng tạo rễ tơ từ trụ hạ diệp của Arachis hypogaea L. cao nhất là 73,5% và số rễ tạo ra trên mỗi mẫu là 8,00 rễ [28]. Dựa vào những so sánh trên, ta thấy rằng khả năng cảm ứng tạo rễ tơ bởi A. rhizogenes ATCC 15834 lên giống đậu phộng VD1 (Arachis hypogaea L.) của Việt Nam là có hiệu quả, nhiều tiềm năng cho những ứng dụng trong nhân sinh khối rễ tơ đậu phộng để thu nhận resveratrol sau này.
Dựa vào kết quả trên, mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp được chọn làm nguồn vật liệu đầu để xâm nhiễm, cảm ứng tạo rễtơ ở thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy, thời gian ngâm mẫu lên quá trình tạo rễtơ. Các thí nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene cũng sử dụng nguồn rễtơ được cảm ứng từ mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ứng tạo rễ tơ
Mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp sau khi được nhúng trong vi khuẩn 15 phút, được chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng và đồng nuôi
Kết quả - Biện luận
cấy trong các khoảng thời gian khác nhau: 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Sau đó, mẫu được loại bỏ vi khuẩn trên bề mặt bằng môi trường MS lỏng có bổ sung cefotaxime và nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung cefotaxime 250 mg/l. Sau 3 tuần nuôi cấy, kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ. Kết quả phần trăm mẫu tạo rễ tơ ở thời gian đồng nuôi cấy khác nhau được trình bày ở bảng 3.2.
Phần trăm tạo rễtơ từ nghiệm thức đồng nuôi cấy trong 96 giờ là cao nhất. Tuy nhiên, về mặt thống kê thì không có sự khác biệt nhiều giữa thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ và 96 giờ. Thời gian đồng nuôi cấy ngắn (24 giờ) và quá dài (120 giờ) cho thấy hiệu suất chuyển gen và tạo rễtơ thấp.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên sự tạo rễtơ
Thời gian (giờ) % tạo rễtơ
24 30,519 ± 2,624
48 56,472 ± 2,557
72 71,667 ± 2,546
96 85,606 ± 3,062
120 54,293 ± 2,409
Quá trình đồng nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến nạp của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ. Thời gian đồng nuôi cấy là thời gian vi khuẩn đã bám vào mẫu ở quá trình nhúng mẫu vào dịch vi khuẩn, có điều kiện tăng sinh số lượng trên môi trường rắn. Sự chuyển và sáp nhập T-DNA vào bộ gen tế bào thực vật xảy ra trong giai đoạn này (Su và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng nếu thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể không hoàn toàn, trong khi đó thời gian đồng nuôi cấy dài có thể ảnh hưởng không
Kết quả - Biện luận
tốt đến quá trình biến nạp do ái lực của vi khuẩn với tế bào thực vật sẽ giảm hoặc sẽ ức chế cạnh tranh.[53]
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu lên sự cảm ứng tạo rễ tơ tơ
Để xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu, 3 phương pháp đã sử dụng: tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô, mẫu được cắt và ngâm trong dung dịch vi khuẩn một thời gian, mẫu được cắt và tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng vào dung dịch vi khuẩn [21]. Trong các nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học thường sử dụng phương pháp ngâm mẫu trong dung dịch vi khuẩn. Mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp được nhúng trong dung dịch vi khuẩn với khoảng thời gian khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút, sau đó được chuyển qua đồng nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung saccharose 30 mg/l, agar 7,5 mg/l, không chất điều hòa tăng trưởng trong 96 giờ. Sau đó mẫu được chuyển lên môi trường MS như trên có bổ sung cefotaxime 250 mg/l để loại vi khuẩn. Sau 3 tuần nuôi cấy, phần trăm mẫu tạo rễtơ được ghi nhận và kết quả thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu lên sự hình thành rễ
Thời gian (phút) Phần trăm tạo rễ tơ
5 68,633 ± 1,008 10 70,476 ± 1,983 15 75,490 ± 2,928 20 90,885 ± 1,146 25 70,008 ± 6,088 30 69,506 ± 3,096
Kết quả - Biện luận
Kết quả cho thấy phần trăm tạo rễtơ từ mẫu nhúng trong dung dịch vi khuẩn 20 phút là cao nhất. Phần trăm tạo rễ tơ từ mẫu nhúng trong dịch khuẩn với thời gian khác thì không có sự khác biệt.
Cơ chế của sự hình thành rễtơ vẫn chưa được hiểu rõ. Sự hình thành rễtơ có thể được chia thành 4 bước: hoạt hóa, biến đổi, chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật và cảm ứng sự hình thành và phát triển rễ tơ. Trong 4 bước trên thì 3 bước đầu đã được hiểu biết tương đối cặn kẽ với những nghiên cứu tương tự trên vi khuẩn A. tumefaciens C58 gây bệnh. Trong khi đó, sự xâm nhiễm và chuyển gen của vi khuẩn A. rhizogenes để tạo thành kiểu hình rễ tơ và kéo dài thì v ẫn chưa được hiểu biết nhiều.[55]
Trong đó, mẫu được cắt và tạo vết thương nhằm tạo ra hợp chất phenolic thu hút vi khuẩn A. rhizogenes gắn lên vị trí bị thương của mẫu. Ngâm mẫu đã tạo vết thương vào dung dịch vi khuẩn tạo điều kiện để mẫu tiếp xúc với vi khuẩn và những